高氧誘導支氣管肺發育不良模型新生大鼠肺組織中miR-21-5p的表達

月小飛，梅花，宋丹，張鈺恒，新春

（內蒙古醫科大學附屬醫院新生兒科，呼和浩特 010050）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產兒呼吸系統常見并發癥之一［1］。隨著現代醫療技術水平的不斷進步，新生兒重癥監護病房的廣泛建立，極低、超低出生體質量早產兒的存活率顯著提高，致使BPD的發生率呈逐年上升趨勢［2-3］。BPD患兒肺功能受損嚴重，生后吸氧時間長，離氧耐受性差，且呼吸系統疾病發生率及再次住院率均高于非BPD患者，嚴重威脅早產兒存活率及遠期生活質量［4-5］。目前，BPD的發病機制尚不明確。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種普遍存在于真核細胞中，由21～25個核苷酸組成的非編碼RNA［6］。研究［7］發現，miRNA-21-5p（miR-21-5p）參與了BPD的發病過程，但它在BPD肺組織中的表達情況及調節機制仍不明確。本研究擬通過90%濃度的氧氣暴露誘導建立新生SD大鼠BPD模型，并探討miR-21-5p在BPD大鼠肺組織中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型建立

新生2 h齡清潔級SD大鼠（內蒙古醫科大學實驗動物中心）60只，雌雄不限。按隨機數字表法分為高氧組和對照組，每組30只。將高氧組大鼠置于自制飼養箱中（溫度22～30 ℃，濕度65%～75%），箱內氧濃度維持在90%，放置適量鈉石灰吸附箱內CO2。對照組大鼠置于箱內氧濃度維持在21%的飼養箱內，其余實驗條件同高氧組。2組新生SD大鼠均由母鼠喂養，每隔24 h高氧組與對照組交換哺乳母鼠，每天定時開箱0.5 h，以更換墊料并添加足夠飼料及水。

1.2 標本采集與處理

分別于生后第1、4、7天從2組各隨機取出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛后處死，立即打開胸腔，暴露肺組織并取出雙側肺臟，用冰凍生理鹽水反復沖洗。大鼠的右肺組織用于石蠟包埋、制備切片行HE染色，左肺組織置于EP管中，經液氮冷凍處理后，置于-80 ℃冰箱中凍存備用。

1.3 組織形態學觀察

2組各隨機抽取4張HE染色的肺組織切片（厚4 μm），置于光學顯微鏡（×100倍）下觀察，每張切片隨機取5個視野，從呼吸性細支氣管的中心部位至最近的纖維隔或胸膜做垂直連線，即輻射狀肺泡計數（radical alveolar counts，RAC），計算RAC的平均值，作為肺泡化程度的指標。計數RAC的同時，采用專業圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測量肺泡直徑和肺泡腔切面面積。

1.4 實時熒光定量PCR檢測2組肺組織中miR-21-5p的表達情況

2組各取50 mg凍存的大鼠左肺組織，用TRIzol（美國Invitrogen公司）法提取總RNA。根據從miRBase查到的miR-21-5p序列（UAGCUUAUCAGACUGAUG UUGA），設計特異性引物，上游引物序列為5’-CTCA ACTGGTGTCGTGGA-3’，下游引物序列為5’-TCGGC AGGCAACAGC-3’。以U6作為內參基因，上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。合成的逆轉錄引物序列為CTCAACTGGTGTCGTGGAGT CGGCAATTCAGTTGAGCGACAGCCCATCGA。miR-21-5p逆轉錄體系用逆轉錄試劑盒Superscript Ⅲ（美國Invitrogen公司）進行逆轉錄，以200 ng總RNA為模板，建立反應體系1，包含RNA 200 ng（10 μL），Oligo-dT 1 μL，Random 1 μL，混勻，65 ℃ 5 min后置于冰上。取12 μL反應體系1加入dNTP 1 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL、5×Buffer 4 μL及逆轉錄酶 1 μL混勻，離心。置于42 ℃水浴60 min后，85 ℃、10 min滅活逆轉錄酶。實時熒光定量PCR反應采用SYBR QPCR Mix試劑盒，反應體系包含cDNA 2 μL、PCR mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、ddH2O 6 μL。預變性95 ℃5 min，變性 95 ℃10 s，退火 58 ℃20 s，40個循環，延伸 72℃ 20 s。得出循環閾值（cycle threshold，Ct），采用 2-ΔΔCt法進行相對定量。ΔΔCt=ΔCtmiR-21-5p-ΔCtU6。

1.5 統計學分析

2組RAC、肺泡直徑、肺泡面積及miR-21-5P表達量采用表示，同一時間點2組各指標比較采用t檢驗，同一組中各時間點指標比較采用F檢驗，2組間差異的比較采用LSD檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織形態學變化

生后第1天，2組大鼠均肺泡結構清晰，肺泡間質無明顯滲出與水腫，肺泡腔內未見明顯滲出物；生后第4天，高氧組大鼠肺組織中肺泡結構尚清晰，但肺泡間質可見滲出與水腫，肺泡腔內可見少量炎性滲出物；生后第7天，隨著高氧暴露時間的延長，高氧組大鼠出現肺組織結構紊亂，肺泡壁斷裂破壞，部分融合成肺大泡，肺泡間質明顯水腫、增寬；而對照組大鼠生后第4、7天，肺組織與生后第1天比較無明顯變化。見圖1。

2.2 肺泡直徑、肺泡腔切面面積及RAC

與生后第1天比較，生后第4、7天高氧組大鼠肺泡直徑、肺泡腔切面面積明顯增大，RAC逐漸減少；

圖1 2組大鼠肺組織形態 HE ×100Fig.1 Morphology of the lung tissue in two groups of rats HE ×100

對照組大鼠生后第4、7 天肺泡結構逐漸清晰，肺泡數量增多，肺泡直徑逐漸變短，肺泡腔切面面積逐漸變小，RAC逐漸增多，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1～3。

2.3 miR-21-5P的表達

實時熒光定量PCR檢測2組大鼠肺組織中miR-21-5p的表達量，結果顯示，隨著時間的推移，高氧組大鼠肺組織內miR-21-5p的表達水平呈下降趨勢，而對照組大鼠肺組織內miR-21-5p的表達水平呈上升趨勢，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表4。

3 討論

BPD是影響早產兒死亡率及預后的主要疾病之一［1］。2000年美國國家衛生研究院制定了“新型”BPD的診斷標準［8］，即任何新生兒如需氧支持超過28 d便可診斷，以肺泡和肺血管不成熟為主要表現，主要病理學特征為肺泡發育減緩，數量減少，融合成大肺泡，但肺纖維化程度較“經典”BPD輕。本研究中，新生2 h的SD大鼠持續暴露于90%高濃度氧氣后，出現肺泡發育異常，且隨著高氧暴露時間的延長，新生大鼠出現肺泡壁斷裂破壞，結構簡單化，肺泡間質明顯水腫、增寬，間質內大量炎性細胞浸潤，毛細血管數目減少。高氧誘導的新生大鼠BPD模型與“新型”BPD 患兒肺部的病理改變一致［9］。本研究結果顯示，高氧組大鼠RAC隨著生后時間的推移，出現符合BPD患兒肺泡數量逐漸減少，融合成大肺泡的病理過程。

表1 高氧組與對照組大鼠生后不同時間肺泡直徑比較（）Tab.1 Comparison of alveolar diameter between hyperoxia group and control group on different days after birth（）

表1 高氧組與對照組大鼠生后不同時間肺泡直徑比較（）Tab.1 Comparison of alveolar diameter between hyperoxia group and control group on different days after birth（）

1）compared with the same group on the 1st day after birth，P ＜ 0.05；2）compared with the same group on the 4th day after birth，P ＜ 0.05.

表2 高氧組與對照組大鼠生后不同時間肺泡面積比較（）Tab.2 Comparison of alveolar area on different days after the birth between hyperoxic and control group（）

表2 高氧組與對照組大鼠生后不同時間肺泡面積比較（）Tab.2 Comparison of alveolar area on different days after the birth between hyperoxic and control group（）

1）compared with the same group on the 1st day after birth，P ＜ 0.05；2）compared with the same group on the 4th day after birth，P ＜ 0.05.

表3 高氧組與對照組大鼠生后不同時間RAC比較（）Tab.3 Comparison of RAC between hyperoxia group and control group on different days after birth（）

表3 高氧組與對照組大鼠生后不同時間RAC比較（）Tab.3 Comparison of RAC between hyperoxia group and control group on different days after birth（）

1）compared with the same group on the 1st day after birth，P ＜ 0.05；2）compared with the same group on the 4th day after birth，P ＜ 0.05.

表4 高氧組與對照組大鼠生后不同時間miR-21-5P表達水平比較（）Tab.4 Comparison of miR-21-5P expression level between hyperoxia group and control group on different days after birth（）

表4 高氧組與對照組大鼠生后不同時間miR-21-5P表達水平比較（）Tab.4 Comparison of miR-21-5P expression level between hyperoxia group and control group on different days after birth（）

1）compared with the same group on the 1st day after birth，P ＜ 0.05；2）compared with the same group on the 4th day after birth，P ＜ 0.05.

miRNA 是重要的細胞內轉錄后調控因子，在細胞生長、發育和凋亡中發揮重要作用［10-11］。miRNA通過與mRNA的編碼序列不完全互補結合或與其3’端非編碼區結合，使目標mRNA的翻譯過程受抑制并導致該mRNA分子降解，從而阻斷目標基因的翻譯過程，并完成轉錄后基因的調控［12］。miRNA具有開放閱讀框架，但不具有編碼蛋白質的功能，成熟miRNA的發夾結構在不同物種間具有高度保守性，其表達兼備嚴格的時空性與組織特異性［13］。BHASKARNA等［14］研究發現，大鼠BPD模型中miRNA的表達具有差異，其中miR-21的表達上調顯著。VAPORIDI等［15］的研究也表明，在高通氣相關肺損傷中，表達上調 2倍以上的miRNAs有65個，其中，miR-21的表達上調尤為明顯，且給予抗miR-21后，肺組織的順應性增加。本研究利用實時熒光定量PCR檢測高氧組和對照組大鼠肺組織中miR-21-5p的相對表達量，結果顯示，隨著時間的推移，高氧組大鼠肺組織內miR-21-5p的相對表達量呈下降趨勢，而對照組則呈上升趨勢；且2組大鼠miR-21-5p的相對表達量與RAC呈正相關，與肺泡直徑和肺泡腔切面面積呈負相關，提示對照組miR-21-5p的相對表達量隨著生后正常肺組織肺泡化過程逐漸增多；持續吸入高濃度氧氣后，大鼠肺組織內miR-21-5p的相對表達量逐漸減少。表明miR-21-5p的相對表達量與肺組織肺泡化存在一定的相關性，高氧暴露條件下，肺組織中miR-21-5p的表達減少，并可能通過某種通路的調節引起肺組織發育不良。從miR-21-5p與其靶基因的作用網絡圖中發現，miR-21-5p通過調控血管內皮生長因子信號通路、依賴環磷鳥苷蛋白激酶信號通路、氧化磷酸化、細胞凋亡等參與多種生命活動。覃松等［16］研究發現，在持續吸入高濃度氧氣（＞90%）誘導的高氧性急性肺損傷動物模型中，miR-21-5p通過抑制磷酸酶和張力蛋白同源（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因的表達完成對大鼠肺組織的保護作用。目前的研究［17］認為miR-21-5p是抗凋亡因子，并通過作用于靶基因PTEN，抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI-3K/PKB ）通路，完成抗凋亡機制。QIU等［18］研究發現，miR-21-5p通過作用于PI3-K/Akt和ERK通路上的靶蛋白maspin，完成對葡萄糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞增殖和血管生成的調控作用。本研究中，雖然已發現在高氧誘導的BPD大鼠肺組織中miR-21-5p的表達減少，但miR-21-5p在大鼠BPD發生過程中的具體作用和機制有待進一步探討。