“提取、測(cè)定茶葉中咖啡因”綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)

張艷軍，廖日權(quán)，王 蕓，鐘書明，張瑞瑞，陳 怡

(北部灣大學(xué) 石油與化工學(xué)院，廣西 欽州 535000)

1 引言

咖啡因是一種生物堿，能溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，存在于茶葉中[1-2]。“從茶葉中提取咖啡因”是有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中開設(shè)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)性項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)利用索氏提取法對(duì)天然產(chǎn)物中有效成分進(jìn)行提取[3]。在索氏抽提過(guò)程中判斷提取是否完全主要看顏色的變化，不同的學(xué)生判斷標(biāo)準(zhǔn)不一樣，無(wú)法準(zhǔn)確判斷抽提是否完成；最后通過(guò)升華得到純品，由于升華過(guò)程中溫度控制難度比較大，可能會(huì)最終導(dǎo)致得到咖啡因量少，無(wú)法準(zhǔn)確得到其中咖啡因的含量[4-5]。而“高效液相色譜法測(cè)定飲料中的咖啡因含量”是儀器分析實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，利用高效液相色譜儀對(duì)天然產(chǎn)物有效成分的含量進(jìn)行測(cè)定[6]。通過(guò)把二個(gè)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，設(shè)計(jì)成一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，該綜合實(shí)驗(yàn)的開設(shè)使學(xué)生能夠掌握天然產(chǎn)物有效成分的提取工藝和含量測(cè)定。開設(shè)綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)有助于鍛煉學(xué)生的創(chuàng)新思維、創(chuàng)新能力及綜合素質(zhì)的培養(yǎng)[7-8]。索氏提取工藝設(shè)計(jì)通過(guò)設(shè)定溶劑濃度、提取時(shí)間、提取溫度、溶劑用量等因素，采取單因素和正交試驗(yàn)考察這些因素對(duì)咖啡因得率的影響[9]，利用HPLC法檢測(cè)咖啡因含量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀1260 (美國(guó)安捷倫)，色譜柱：ODS-C18柱 (4.6×250mm，5μm)，甲醇為色譜純(fisher公司)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取升華實(shí)驗(yàn)獲取咖啡因(色譜純)標(biāo)準(zhǔn)品20mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成(200μg/mL)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別吸取0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mL儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，配制成濃度為2，10，20，40，100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制出咖啡因標(biāo)準(zhǔn)工作曲線[10]。

2.3 咖啡因得率計(jì)算

精密吸取咖啡因提取液0.5mL于10mL容量瓶中，以同濃度乙醇進(jìn)行定容混勻后，設(shè)定流動(dòng)相甲醇∶水=40∶60，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)280nm，柱溫為30℃的條件下測(cè)定其提取液的峰面積，平行測(cè)定三次取平均值。根據(jù)測(cè)得的峰面積及咖啡因標(biāo)準(zhǔn)工作曲線由公式(1)計(jì)算得到樣品液中咖啡因的得率。

樣品中咖啡因得率按公式(1)計(jì)算：

咖啡因得率= (N×C×V)/M×100%

(1)

式子中N為咖啡因提取液的稀釋倍數(shù)；C為咖啡因提取液的質(zhì)量濃度(μg/mL)；V為咖啡因提取液稀釋前的總體積(mL)；M為茶葉的質(zhì)量(g)。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

HPLC法測(cè)定，以咖啡因得率為參考指標(biāo)，通過(guò)研究提取溫度、提取時(shí)間、溶劑濃度、料液比各因素條件的改變對(duì)咖啡因得率的影響，得出最佳提取工藝條件，具體單因素設(shè)定如下：

(1)提取溫度對(duì)咖啡因得率的影響：提取時(shí)間2h、溶劑濃度90%、料液比1∶50作為固定條件保持不變。分別設(shè)定提取溫度60，70，80，90，100 ℃這五個(gè)水平來(lái)實(shí)驗(yàn)。判斷提取溫度對(duì)咖啡因得率的影響。

(2)提取時(shí)間對(duì)咖啡因得率的影響：最佳提取溫度、溶劑濃度90%、料液比1∶50作為固定條件保持不變。分別設(shè)定提取時(shí)間1，2，3，4，5這五個(gè)水平來(lái)實(shí)驗(yàn)。判斷提取時(shí)間的不同對(duì)咖啡因得率的影響。

(3)溶劑濃度對(duì)咖啡因得率的影響：最佳提取溫度、最佳提取時(shí)間、料液比1∶50作為固定條件不變。分別設(shè)定溶劑濃度60%，70%，80%，90%，100%這五個(gè)水平來(lái)實(shí)驗(yàn)。判斷溶劑濃度的不同對(duì)咖啡因得率的影響。

(4)料液比對(duì)咖啡因得率的影響：以最佳提取溫度、提取時(shí)間、溶劑濃度作為固定條件不變。分別設(shè)定料液比1∶45，1∶50，1∶55，1∶60，1:65g/mL這五個(gè)水平來(lái)實(shí)驗(yàn)，判斷料液比的不同對(duì)咖啡因得率的影響。

2.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)法獲取最佳提取工藝條件。根據(jù)提取溫度、提取時(shí)間、溶劑濃度、料液比、設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出咖啡因的最佳提取工藝參數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用HPLC，得到咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性方程為y = 22.83x +2.9903，R2=0.9994。在咖啡因2～100μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.2.1 提取溫度對(duì)咖啡因得率的影響

如圖2所知，在提取溫度為60～90℃時(shí)，咖啡因得率逐漸增大，這說(shuō)明適當(dāng)?shù)臏囟忍嵘欣诳Х纫蚣铀偃芙猓划?dāng)提取溫度達(dá)到90℃，咖啡因得率達(dá)到最佳；若提取溫度繼續(xù)升高至100℃時(shí)，得率出現(xiàn)明顯降低，此時(shí)醇溶性雜質(zhì)由于過(guò)高溫度而大量溶出[11]，與咖啡因競(jìng)爭(zhēng)溶于乙醇-水體系，從而干擾咖啡因溶解。并且溫度過(guò)高，加速了溶劑乙醇的揮發(fā)。故此，得到最佳提取溫度為90℃。

圖2 提取溫度對(duì)咖啡因得率的影響

3.2.2 提取時(shí)間對(duì)咖啡因得率的影響

如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間在3h內(nèi)，咖啡因的得率保持上升；當(dāng)提取時(shí)間為3h，咖啡因的得率呈最大，達(dá)1.77%；但超過(guò)3h后，得率反而下降。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)短，溶液中咖啡因未溶解平衡，溶解較少，得率低；若提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，咖啡因易發(fā)生分解及其他損失，得率也會(huì)降低，由此可確定得到最佳提取時(shí)間為3h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)咖啡因得率的影響

3.2.3 溶劑濃度對(duì)咖啡因得率的影響

如圖4所示，當(dāng)溶劑濃度在60%～90%范圍內(nèi)時(shí)，咖啡因的得率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；溶劑濃度為90%時(shí)，咖啡因得率最大，因?yàn)榭Х纫驗(yàn)榉菢O性小分子化合物，基于相似相溶原理，咖啡因的溶解度隨著乙醇濃度的提高而提高；但當(dāng)溶劑濃度為100%時(shí)，咖啡因的提取率明顯降低，無(wú)水熱乙醇更易揮發(fā)導(dǎo)致溶劑的減少，咖啡因的溶解度因此下降。故而確定乙醇90%為最佳溶劑濃度。

圖4 乙醇濃度對(duì)咖啡因得率的影響

3.2.4 料液比對(duì)咖啡因得率的影響

如圖5所示，隨著料液比的增加，咖啡因的得率顯著提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶55時(shí)，此時(shí)咖啡因得率達(dá)到2.12%；但若料液比繼續(xù)增加時(shí)，咖啡因的得率無(wú)明顯變化。這是因?yàn)榱弦罕容^小時(shí)，提取液中咖啡因濃度較大，由于分子擴(kuò)散速度低導(dǎo)致咖啡因得率小，隨著溶劑量的提高，茶葉中更多的咖啡因被溶解釋放出來(lái)，但茶葉中所含的咖啡因是一定的，多數(shù)咖啡因被析出之后溶劑量的再增加對(duì)最終提取效果影響不大。基于提取效果及經(jīng)濟(jì)成本的角度出發(fā)，可以確定最佳料液比為1∶55。

圖5 料液比對(duì)咖啡因得率的影響

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)考察四個(gè)因素和三個(gè)水平，故此選擇L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果由表1、表2所示。

表1 L9(34)正交表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析表

由表2中K值分析確定得到提取咖啡因的最佳組合A2B2C2D2，由R值確定上述因素在咖啡因提取實(shí)驗(yàn)中的影響次序?yàn)樘崛囟?料液比>提取時(shí)間>溶劑濃度，本實(shí)驗(yàn)最佳提取條件為：提取溫度90 ℃，提取時(shí)間3 h，溶劑濃度90%，料液比1∶55 (g/mL)，該條件下咖啡因得率達(dá)2.13%。

4 結(jié)語(yǔ)

將有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)“咖啡因的提取”和儀器分析實(shí)驗(yàn)“咖啡因的測(cè)定”實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容相結(jié)合，既形成一個(gè)系統(tǒng)的、完整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，又體現(xiàn)出有機(jī)化學(xué)與儀器分析之間的交叉融合。使學(xué)生掌握有機(jī)化學(xué)中天然產(chǎn)物的提取同時(shí)，也掌握了液相色譜儀對(duì)有機(jī)物的定性、定量分析，對(duì)液相色譜儀的結(jié)構(gòu)、原理及用途有了更直觀的認(rèn)識(shí)。綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計(jì)，可培養(yǎng)學(xué)生多角度思考問(wèn)題、開拓學(xué)生的思維。有助于學(xué)生綜合解決問(wèn)題能力、創(chuàng)新能力等綜合素質(zhì)培養(yǎng)，同時(shí)也為學(xué)生今后開展科學(xué)研究提供思路。