熒光硅量子點作為葉面光肥提高生菜對光能利用率的機理研究

潘曉琴，李常健，張浩然,3，鄭胤建，董日月，李 唯,3，宋世威，楊 暹，劉應亮,3，雷炳富,3*

(1． 華南農業大學材料與能源學院 生物基材料與能源教育部重點實驗室/廣東省光學農業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642；2． 華南農業大學 園藝學院，廣東 廣州 510642； 3． 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣東 廣州 510642；4. 中國農業科學院 都市農業研究所，四川 成都 610213)

1 引 言

光合作用是將太陽能直接轉化為三磷酸腺苷(ATP)和生物質等產物形式的化學能的生化過程。植物對光能的利用率高低，直接影響植株的形態構建及其生物積累量，如何綜合運用納米材料、微電子及園藝設施等手段提高植物對光能的利用效率，一直以來備受研究人員的關注，成為相關研究領域的熱點和難點。提高植物光能利用率的方法大體上可分為兩類：一類通過植物外部環境進行調節，如人工施加補光劑[1]、使用高效LED燈[2]、覆蓋轉光農膜[3]等方法；另一類是通過植物本身的基因改造進行改善[4-5]。后者雖意義重大但耗時長且風險高，前者研究成果轉化效率更快，帶來的即時經濟效益更高。因此，近年來，基于覆蓋轉光農膜或噴施葉面光肥用于提高植物對光能利用效率的研究方興未艾[3,6-7]。

近年來，納米材料及納米技術用于植物組織成像、葉面肥、金屬離子示蹤、生物傳感等方面的應用已有不少報道[8-11]。非重金屬熒光量子點是一類新型的光致發光納米材料，具有物化穩定性好、毒性低、發光量子效率高、制備工藝簡單等獨特的優點，近年來受到人們的廣泛關注，已經在生物醫學、光電器件、傳感器、催化和植物光合作用等領域顯示出廣泛的應用前景。尤其是，由于它們的毒性低、發光效率高、水溶性好等特性，在植物領域的應用成為一個新的熱點問題，包括植物細胞成像、植物栽培、基因表達或作為增強光合作用的介質等，受到了廣泛的關注[12-13]。在眾多研究的熒光量子點中，熒光碳量子點(Carbon dots, CDs)是在植物應用方面研究的熱門材料之一，已有的報道包括在綠豆芽上研究CDs在植物體內的轉運[14]、在生菜上研究CDs對光合作用的補光作用等[15]。與碳量子點相比，硅量子點(Silicon quantum dots,SiQDs)的原料豐富，光譜吸收范圍寬、低毒且生物相容性好，其光學性質較CDs而言相對穩定，多被用于制成生物探針[16-17]，但在植物種植上的應用則少見報道[18-19]，且SiQDs的轉光功能對植物光合作用的影響方式也尚不清楚。

在光合作用過程中，葉綠體光合作用僅能利用可見光范圍的光能，具有高選擇性。紫外或近紫外光不僅難以被植物利用，甚至會造成植物的氧化損傷從而阻礙植物生長。當植物遭受紫外脅迫時，適當增加光譜中的藍光含量可以降低植物對紫外光的敏感性，從而減緩脅迫作用[20]。大部分SiQDs能夠吸收紫外光并轉化為紅藍光，具有改變光環境從而保護和提高植物的光能利用率的潛力。值得注意的是，SiQDs中含有大量的Si元素，而Si元素在一些逆境脅迫下對植物生長同樣起著改善的作用，如減輕小麥稻瘟病造成的光合能力降低[21]、緩解干旱脅迫對光合作用的抑制等[22]。因此，將SiQDs作為葉面肥施用，既能利用其光肥功能，又兼備Si元素本身對植物生長的積極作用。

基于上述考慮，本研究選取了一種高分散性、納米尺寸均一且光學性能穩定的高亮SiQDs，提取模式植物生菜的葉綠體，從能量轉移層面上解釋了SiQDs提高葉綠體光能轉化速率的內在機理，并將SiQDs作為葉面光肥，通過植物工廠內的生菜種植實驗，驗證了其對生菜種植的增產效應。

2 實 驗

2.1 樣品制備

參考Gong等的方法制備SiQDs[23]。稱取11.6 g檸檬酸鈉加入到240 mL純水中，混合攪拌的同時持續通入氮氣20 min。加入60 mL N-氨乙基-γ-氨丙基二甲氧基硅烷(DAMO)，繼續通入氮氣40 min。將混合液倒入500 mL反應釜中，200 ℃條件下反應12 h。冷卻至室溫，使用截留量為1 000 u的透析袋透析24 h(平均4～5 h換一次水)，透析袋中液體即為目標樣品液。旋蒸濃縮樣品液后取40 mL進行冷凍干燥，計算可得其濃度為40.16 mg·mL-1。

2.2 葉綠體的提取

參考Pan等的方法提取葉綠體(CLP)[8]。先配置蔗糖磷酸緩沖液，包含0.4 mol/L蔗糖、10 mmol/L氯化鉀、30 mmol/L磷酸氫二鈉和20 mmol/L磷酸二氫鉀，配置完畢后將緩沖液置于冰箱中預冷到4 ℃。使用研磨機將生菜葉片破碎，在蔗糖磷酸緩沖液中提取葉綠體，而后用4層紗布將提取液過濾至棕色樣品瓶中，得到葉綠體粗提液，全程在黑暗環境下操作并使用冰浴盡量使葉綠體處于4 ℃的條件下。將粗提液在1 000 r·min-1、4 ℃條件下離心3 min，棄底部沉淀取上層液體，再在3 000 r·min-1、4 ℃條件下離心3 min，得底部沉淀葉綠體。將所得葉綠體再次分散于蔗糖磷酸緩沖液中，得葉綠體懸浮液。取0.1 mL葉綠體懸浮液分散于4.9 mL無水乙醇中，測其在OD650的吸光值，計算可得其濃度為398.21 mg·L-1。

2.3 樣品表征

使用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM；型號：JEOL-2010)及Nano Measurer對樣品形貌及粒徑大小進行表征測量。使用傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR；型號：Nicolet 6700)和X射線電子能譜(X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS；型號：Thermo Scientific Escalab 250Xi)對樣品進行官能團鑒定。使用熒光光譜儀(型號：Hitachi F-7000)測試樣品的激發、發射熒光(Photoluminescence,PL)光譜。使用熒光光譜儀(型號：Edinburgh Instruments FLS 1000)表征樣品的熒光壽命及絕對量子效率，測試前將溶液稀釋到在最佳激發波長處的吸收值小于0.1即可。使用紫外分光光度計(型號：Hitachi UV-2550)測試樣品的紫外-可見吸收光譜。

2.4 希爾反應

希爾反應用于測量光合作用過程中光系統Ⅱ的電子傳遞速率。使用2,6-二氯酚靛酚(2,6-Dichloropheno-lindopheno,DCPIP)的還原速率來表示。分別配置4 mL濃度為0,10,100, 200 mg·mL-1的SiQDs蔗糖-磷酸緩沖液分散液，再加入4 mL葉綠體懸浮液，4 ℃共處理1 h后分別加入2.0 mL 120 μmol/L DCPIP。使用光強為7.0 mW·cm-2的氙燈照射5 min，每隔1 min記錄一次溶液在OD600的吸光值。

2.5 生菜應用

生菜種植：品種為“意大利耐抽薹生菜”，一種散葉不結球類型生菜，購于廣東省農科院蔬菜研究所。種植地點為華南農業大學校內廣東省光學農業工程技術研究中心的植物工廠。營養液配方為華南農業大學葉菜通用配方，環境溫度為20～23 ℃，光源為通用白色LED燈，光照18 h黑暗6 h。光照的同時輔以波長為365 nm的紫外燈光照4 h。

生菜處理：幼苗長至3葉1心時，將幼苗轉移到水培架上定植10 d。將樣品液配制成濃度為0,5,50,100 mg·L-1的SiQDs水分散液，使用噴瓶將不同濃度的樣品液均勻地噴施于生菜葉面上，每組3個重復，每隔2 d處理一次，14 d后采收，測定相關指標。其中，在生菜處理的第11 d，取生菜的第4片葉用于葉綠素熒光(IMAGINE PAM)成像實驗，測試快速光飽和曲線，成像實驗前對生菜進行暗處理20 min。

2.6 數據處理

采用SPSS 15.0 軟件進行數據統計分析，經鄧肯多重比較檢驗對試驗數據進行差異顯著性分析(P<0.05)，利用Origin 8.0對數據擬合、繪圖。

3 結果與討論

3.1 SiQDs的形貌粒徑

如圖1所示，所制備的SiQDs具有良好的分散性，呈類球形，尺寸分布均勻。取100個納米粒子測量其尺寸可知該樣品的平均粒徑為3.6 nm(見圖1插圖)。SiQDs的TEM圖像說明，檸檬酸鈉作為強還原劑，可以在高溫高壓條件下與DAMO反應，自組裝形成納米粒徑小、尺寸分布均勻且高分散性高的SiQDs。

圖1 SiQDs的TEM圖像(插圖為SiQDs尺寸分布圖)

3.2 FTIR光譜

圖2 SiQDs的FTIR光譜

3.3 PL光譜

將SiQDs液稀釋到一定濃度后測其熒光激發發射光譜。如圖3所示，該材料在380 nm波長激發下熒光強度最大，最佳發射為450 nm，屬于藍色熒光。隨著激發波長的延長，SiQDs的熒光發射強度呈現先升高后下降的趨勢，而最佳發射并沒有出現紅移或藍移的現象，表明該材料不存在激發依賴效應[15]。結合圖4(a)可知，該材料在最佳發射下出現的兩個激發峰與其紫外-可見吸收光譜相對應，與大部分碳點的吸收光譜類似[25]。此外，測得該材料的絕對量子效率為64.2%，其熒光發射強度特性為實現良好的轉光提供了保障。

圖3 SiQDs的激發和發射光譜

3.4 XPS能譜

3.5 SiQDs對葉綠體的影響

植物光合作用發生在葉綠體細胞器上。葉綠體上的光合色素可以吸收紅藍光，而后通過光合作用將吸收的光能轉化為化學能并儲存在植物組織中[32]。如圖5(a)所示，葉綠體光合作用的有效吸收范圍為400～720 nm的可見光。本研究制備的SiQDs可以吸收紫外光然后發射藍光，且材料所發的藍光正好處于生菜葉綠體光合作用的有效吸收范圍內(圖5(b))，說明SiQDs可以將生菜葉綠體光合作用無法有效利用的紫外光吸收轉換為光合作用能有效利用的藍光。向SiQDs水分散液中添加不同含量葉綠體懸浮液后，觀察其熒光光譜，可以發現，隨著葉綠體溶液添加量的增多，SiQDs的熒光發射強度下降，并分別在450 nm及513 nm附近出現2個發射峰(圖5(c))，且兩個發射峰間的凹陷處正好對應了圖5(b)的空白處，說明SiQDs發射的藍光被葉綠體有效吸收。680nm與730 nm處的兩個熒光峰的降低是由體系濃度增大導致的葉綠體聚集產生的熒光猝滅(圖5(d))。圖5(e)展示的是SiQDs及含有3 mL體積的SiQDs/葉綠體混合液的熒光壽命。擬合計算后可知，加入葉綠體前后SiQDs的熒光壽命分別為13.48 ns和13.46 ns，SiQDs/葉綠體的熒光壽命沒有明顯縮短(表1)。當熒光體濃度較大或與其他吸光物質共存時，熒光體或其他吸光物質對激發光或發射光的吸收導致熒光減弱但壽命卻沒有發生變化的現象，稱為內濾效應。以上結果表明，葉綠體通過內濾效應吸收了SiQDs發射的藍光。

圖5 (a)葉綠體的紫外-可見吸收光譜圖；(b)歸一化的葉綠體可見光吸收光譜及SiQDs在365 nm激發下的熒光光譜；(c)添加不同體積葉綠體懸浮液后SiQDs在400 nm激發下的熒光光譜(總體積4 mL，SiQDs濃度500 mg·mL-1)；(d)不同濃度葉綠體在400 nm激發下的熒光光譜；(e)SiQDs及SiQDs/葉綠體在450 nm處監測的熒光壽命曲線；(f)不同濃度SiQDs對葉綠體還原DCPIP的影響(用ΔAbs.來表示DCPIP還原速率)。

表1 SiQDs與SiQDs/CLP熒光壽命的多指數擬合數據

為了驗證葉綠素是否將吸收的藍光用于光合作用，我們設計了實驗，通過觀察不同濃度SiQDs對葉綠體還原DCPIP的影響規律加以討論。如圖5(f)所示，隨著SiQDs濃度的提高，DCPIP的被還原量增多，代表著光合電子傳遞鏈上的電子傳遞速率加快[33]。因此可以認為，葉綠體吸收的藍光促進了生菜的光合作用。

3.6 SiQDs對生菜生長的影響

如圖6所示，噴施不同濃度的SiQDs水分散液后，生菜的干重及鮮重較噴施清水的對照組而言均有顯著性提高，其中以濃度為50 mg·L-1的效果最佳。在鮮重方面，濃度為5 mg·L-1的處理組與濃度為50,100 mg·L-1的處理組沒有顯著性差異，50 mg·L-1的處理組與100 mg·L-1的處理組有顯著性差異(圖6(a))。而在干重方面，盡管較對照組有了顯著性的提高，但100 mg·L-1的處理組與5,50 mg·L-1處理組相比卻有顯著性下降(圖6(b))。表明低濃度SiQDs水分散液噴施處理生菜可以提高生菜的干鮮重，而高濃度處理會抑制這種促進效果。

圖6 不同濃度SiQDs處理后生菜的生物量。(a)總鮮重；(b)總干重。

3.7 SiQDs對生菜光合作用的影響

為了弄清楚SiQDs對生菜生長的促進作用是否與光合作用有關，采用快速光飽和曲線進行了表征和計算。如圖7所示，隨著噴施濃度的提高，電子轉移速率也得到了提高。這個趨勢與圖5(f)一致，且5 mg·L-1的處理組與50 mg·L-1的處理組也沒有顯著性差異。兩者相互印證，初步說明SiQDs對生菜生長的促進作用是與SiQDs轉光作用提高光合電子傳遞速率有關的。對曲線擬合結果進行計算分析得到了表2的數據。由表2可知，較對照組而言，SiQDs處理均提高了生菜的最大光合速率，且隨著處理濃度的提高而增大，說明適當濃度SiQDs作為葉面光肥施用，可以提高生菜的最大光合速率。

圖7 不同濃度SiQDs處理后生菜的快速光飽和曲線

表2 不同濃度SiQDs處理后生菜的光合特性擬合結果

4 討 論

熒光硅量子點的光學特性與材料的尺寸、表面官能團及分散性等有關。首先是尺寸對發光的影響。TEM結果、PL光譜的對稱性和激發不依賴現象都表明，熒光硅量子點的納米尺寸均一，光學性質穩定，是開展植物應用的有利條件之一。同時，材料的納米粒徑小于5 nm，也有利于從葉面氣孔吸收進入植物體內，從而更好地與葉綠體協同作用提高光能利用率[8,14,25,34]。其次是表面的官能團對熒光強度的影響。本方法制備的SiQDs表面含有豐富的—NH官能團，熒光強度高[35]，絕對量子效率高達64.2%，表明該材料的發光效率高，能有效地將植物光合作用不能有效利用的紫外光轉換為能被吸收后用于光合作用的藍光。最后是材料的分散性。在本試驗中，FTIR、XPS和紫外-可見吸收光譜測試3種方法結果相互驗證，表明該方法制備的SiQDs表面富含多種親水性含氧官能團，對分散于水溶液中的材料起到保護殼的作用，是SiQDs具有優異的水分散性的主要原因[26]。

圖8 SiQDs促進CLP光合作用示意圖

SiQDs具有轉光功能。CDs作為補光天線可以通過能量共振轉移的方式，將能量傳遞給葉綠體從而提高葉綠體光合效率[36]。但這種傳遞方式會受限于供體與受體間的距離，發生條件比較苛刻[37]。在本實驗中，如圖8所示，SiQDs與葉綠體間的能量傳遞方式為內濾效應，屬于輻射能量傳遞，不受距離限制[38]。將SiQDs作為葉面光肥應用于生菜種植時，既體現了Si元素本身對光合作用起到的促進作用[39]，又利用了硅點的轉光功能，從而促進了生菜的光能利用效率。即便SiQDs沒有進入葉片細胞內與葉綠體結合，也能將能量傳遞給葉綠體。

5 結 論

本文采用水熱反應制備了性能優異的SiQDs。其優異的分散性則要得益于表面豐富的含氧官能團。當該量子點與葉綠體共存時，會發生內濾效應，提高葉綠體的電子傳遞速率。通過生菜種植實驗證實了適宜濃度的SiQDs(50 mg·L-1)作為葉面光肥能顯著提高生菜的干鮮重含量及最大光合速率。因此，本研究認為，SiQDs利用熒光硅量子點的轉光功能及硅元素的獨特作用，作為葉面光肥應用于生菜種植是可行且有效的，更具體的生物機理研究尚需要后續開展更為完善的植物應用試驗進行驗證。