外周血清5-羥色胺與血小板水平對肝細胞癌患者預后的影響

王志鑫，李 姚，周留馨，任 利，曲 凱，苗 潤，侯立朝，王海久，劉 昌，樊海寧

1 青海大學附屬醫院 肝膽胰外科，西寧 810000；2 青海省包蟲病重點實驗室，西寧 810000；3 西安交通大學第一附屬醫院 肝膽外科，西安 710006

肝癌是全球性高發病率、病死率的惡性腫瘤之一，盡管部分患者可以通過手術治療達到根治，然而術后超過70%的肝癌患者可以發生腫瘤復發或遠處轉移，高達90%以上的死亡與腫瘤轉移/復發有關[1]。研究[2]證明肝癌主要通過血行轉移，血小板可能在其轉移過程中發揮重要作用，然而機制尚未明晰。本研究擬回顧性分析肝細胞癌患者外周血小板計數與臨床病理特征的關系，了解影響肝癌患者預后(整體、無復發生存期)的獨立危險因素，并進一步分析血小板計數與患者生存期的相關性。此外，通過對比肝癌轉移組與非轉移組患者外周血小板計數、聚集功能及血清游離5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)間的差異，進一步了解血小板與肝細胞癌復發/轉移的關系，同時明確外周血游離5-HT與肝癌復發/轉移的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2004年1月-2012年12月于西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科、消化內科、周圍血管科治療的210例肝細胞癌患者臨床資料。納入及排除標準如下：(1)≥18周歲；(2)符合NCCN指南肝癌診斷標準；(3)初治病例，無既往腫瘤相關病史及治療經過；(4)無其他影響血小板數量和功能的疾病：如原發性血小板增多癥；骨髓增生性疾病(例如慢性粒細胞白血病、真性紅細胞增多癥、骨髓纖維化等)；血小板反應性增多(如急性出血、缺鐵、急慢性感染及溶血等)；(5)無近/長期可影響血小板功能/數量的藥物或其他治療。在收集的210例患者中選取52例肝細胞癌患者(包括20例肝癌復發/轉移者及32例非復發/轉移患者)行外周血血小板聚集功能、游離5-HT檢測，病例需符合以下條件：(1)≥18周歲；(2)符合NCCN指南肝癌診斷標準，且此次入院明確診斷為肝癌復發/轉移；(3)無其他影響血小板數量/功能的疾?。喝缭l性血小板增多癥；骨髓增生性疾病(如慢性粒細胞白血病、真性紅細胞增多癥、骨髓纖維化等)；血小板反應性增多(如急性出血、缺鐵、急慢性感染及溶血等)；(4)無近/長期可影響血小板功能/數量的藥物或其他治療。

1.2 資料獲取及樣本檢測 利用醫院病案室病歷縮微系統，對病歷進行篩選復合，將原始病歷資料建立原始數據庫，采集項目包含患者一般信息、入院時常規及腫瘤相關檢驗、檢查數據。自收集患者病歷起，每3個月電話隨訪以及信訪，如果出現2年或者以上無法聯系者，則視為失訪。所有回顧分析的病例隨訪截止時間為2014年12月31日，研究起始時間為接受主要的治療(手術/TACE/射頻消融/化療)，結束時間為患者死亡、最后1次隨訪時間或者失訪。隨訪內容包括術后生活情況、復發時間、是否死亡、死亡時間及死亡原因。如果在隨訪期間患者死于原癌及相關疾病則患者資料為完全數據，如果至隨訪截止日期患者生存則按照截尾數據處理。

采集空腹外周靜脈血標本5 ml 2管(采集前7～10 d患者未服用阿司匹林或含有阿司匹林的藥物)，采用SE 2100型全自動血液細胞分析儀測定血小板計數、使用血小板聚集儀檢測外周血小板聚集率。然后將試劑及血漿樣品置于室溫下(20 ℃～25 ℃)進行溫度平衡，計算試劑用量，樣本與標準品進行雙份實驗，完成5-HT ELISA檢測。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由青海大學附屬醫院倫理委員會審批(批號：P-SL-2019072)，患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 按照納入排除標準最終納入肝癌病例1102例，經過篩選和隨訪，最終得到有效病例210例，一般資料見表1。

表1 肝癌患者基線資料

將210例患者分為低血小板組(≤150×109/L)129例(61.4%)與高血小板組(>150×109/L)81例(38.6%)，分析血小板計數與肝癌患者臨床病理特征間的相關性。結果發現，不同血小板水平患者的年齡(χ2=32.304，P=0.044)、腫瘤大小(χ2=35.201，P=0.001)、腫瘤數目(χ2=31.304，P=0.032)、Child分級(χ2=31.250，P=0.036)及TNM分期(χ2=35.201，P=0.001)等指標差異均有統計學意義，提示血小板與肝癌進程關系密切。

2.2 肝癌患者預后影響因素分析 單因素分析發現，年齡、入院AFP水平、腫瘤大小、靜脈侵襲、入院血小板計數、TNM分期及治療方式為患者整體生存及無復發生存的危險因素(P值均<0.05)。多因素Cox分析發現，與患者生存相關的獨立危險因素有年齡、入院AFP水平、入院血小板計數、治療方式(P值均<0.05)，而與無復發生相關的危險因素包括年齡、入院AFP水平、腫瘤大小、入院血小板計數、治療方式(P值均<0.05)(表2，3)。

2.4 外周血小板、血5-HT與肝癌患者復發/轉移的關系 對比分析20例住院的肝癌復發/轉移患者及32例非復發/轉移患者外周血小板計數、聚集功能的差異，結果發現2組血小板計數、血小板聚集率、血清游離5-HT水平差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表4)。進一步相關性分析發現，血清5-HT水平與外周血小板計數及最大聚集率均呈正相關(P值均<0.05)(圖2)。

3 討論

盡管目前針對肝癌已有多種治療措施，但包括移植在內的手術治療、放療和化療[3]，均存在著應用的局限性，較高的復發率以及治療的不徹底性，因此現有的治療方法都不能從根本上解決這一難題。近年來，越來越多的研究者從腫瘤微環境入手開展了大量的研究工作，期待從新的角度揭示肝癌的起因及進展機制，以期從中發現新的、更好的腫瘤治療靶點。

血小板廣泛存在于機體內，由巨核細胞生成，是血液循環中最小的血細胞。血小板早先是作為血液系統生理變化的主要參與者之一被認知，其主要功能是阻止組織損傷及血管損傷后出血。近年來越來越多的研究將關注點放在血小板與腫瘤的關系方面。目前學界也有觀點認為，血小板對腫瘤患者預后具有積極意義。例如，有學者[4]對216例結腸癌肝轉移或者肝切除術后患者的預后進行觀察發現，血小板數低于100×109/L的患者術后肝功能恢復時間延長，且病死率更高，也有許多研究[5-8]支持血小板減少癥及低血小板水平對接受肝切除的肝癌患者預后具有不利影響的觀點。另外，研究發現在肝移植術后血小板輸注可以促進肝再生[9]，而利用血小板特異性抗體減少血小板含量或用血小板活性抑制劑抑制血小板功能，均使小鼠部分肝切除后肝再生明顯降低[10]。提示血小板可能通過促進肝再生對肝癌患者術后生存產生積極影響。

表2 影響肝癌患者生存的危險因素分析

表3 肝癌患者無瘤生存危險因素分析

表4 2組患者外周血5-HT及血小板相關指標比較

目前幾個基于血小板的預測指數已經被確定為肝癌的預測指標，如Tamaki等[11]報道FIB-4>3.25可以增加約1.7倍的肝癌發病風險。Sitia等[12]動物實驗發現，在對免疫介導的慢性HBV的小鼠應用抗血小板藥物，如阿司匹林和氯吡格雷后，可以明顯抑制動物模型肝癌的發生率。然而，還有相當數量的臨床研究結果提示血小板對于肝癌患者預后有消極的影響，例如Nouso等[13]將血小板>80×109/L視為肝功能Child C級的肝硬化肝癌患者整體不佳的獨立預測因素，而臨床觀察發現，高血小板水平在包括肝癌在內的部分腫瘤(例如：子宮內膜癌[14]、宮頸癌[14]、卵巢癌[15-16]乳腺癌[17]大腸癌[18]及胃癌[19]等實體腫瘤)中是預后不良因素，診斷時的血小板增多會導致許多類型的腫瘤長期存活率下降[20-22]。甚至還有基礎研究證實了血小板可以促進肝癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、血管生成和轉移。

由于血小板與肝癌患者預后關系的結論不一，本研究收集肝癌患者資料，進行了相關性及預后分析，結果發現，血小板計數與肝癌患者整體預后及復發/轉移密切相關，且血小板計數越高，其生存期越短、復發率越高，這與既往部分肝癌相關研究結果一致。

盡管既往研究報道血小板可以通過多種途徑影響腫瘤細胞，然而目前為止具體機制仍未完全明晰。通常認為血小板通過活化形式發揮作用，其主要變化是血小板獨立分泌活性因子。其內的大量α顆粒、致密顆粒等在活化狀態下向外釋放糖蛋白、凝血因子和許多促血管生成因子與抗血管生成因子等，進而發揮其生物學作用。5-HT是體內重要的內源性活性物質，90%以上儲存在外周循環的血小板中，血小板是儲存和運輸5-HT的重要物質[23]。研究發現，血小板源性的5-HT通過與其受體5-HT2A和5-HT2B結合，在大鼠肝臟的再生過程中起著關鍵性作用。此外，還發現5-HT與肝纖維化[24]、非酒精性肝炎及病毒性肝炎的發病機理相關，甚至在腫瘤相關研究中發現血小板源性的5-HT能夠促進包括膽管癌[25]和肝細胞癌[26]在內的多種腫瘤生長，且膽管癌患者血漿中高5-HT水平也提示預后較差[27]。與此同時，也有學者[28]認為5-HT的表達水平與胃癌的分化程度密切相關。

基于上述原因，本研究推測血小板對肝癌進程的影響可能與其內所含的大量內源性5-HT密切相關，因此通過檢測對比不同組肝癌患者外周血小板計數、功能及5-HT水平及相關性對本研究的推測進行初步驗證。結果發現，血小板計數、活化程度及5-HT水平在肝癌轉移組均較非轉移組偏高，還發現血清5-HT水平與外周血小板計數及聚集率均呈正相關。這提示血小板及5-HT與肝癌患者預后均存在密切關聯，提示血小板源性的5-HT可能在肝癌復發、轉移中發揮重要作用，為進一步研究提供了一定的基礎和依據。