Toll樣受體4基因多態性與HBV相關原發性肝癌易感性及預后的關系

赫偉麗，楊笑月，張愛軍，王曉陽，王亞軍，趙 帆，徐光福

北京中醫藥大學東直門醫院 感染科，北京 100700

原發性肝癌(以下簡稱為肝癌)是我國最為常見的惡性腫瘤之一，位居世界死因第5位，患者5年生存率僅為7%[1]。目前關于肝癌的致病機理尚不明確，臨床普遍認為肝癌的發生主要與HBV、HCV感染有關，此外，遺傳因素也是肝癌發生的重要因素之一。研究[2-4]認為，肝癌的發生存在遺傳易感性。Toll樣受體4(TLR4)是一種髓源性細胞上表達的模式識別受體，可識別革蘭陰性菌脂多糖。研究[5]顯示，TLR4與腫瘤的發生發展密切相關，尤其是炎癥相關性腫瘤，而肝癌便是一種典型的炎癥相關腫瘤，常發生于肝炎、病毒性肝炎以及脂肪肝等導致的肝硬化基礎之上。有學者[6]報道，TLR4基因多態性與結腸癌、胃癌等發展具有著密切的聯系，而關于其與HBV相關原發性肝癌易感性及患者預后關系的研究，尚無相關報道。本研究旨在探討分析TLR4基因多態性與HBV相關原發性肝癌易感性之間的關系以及對患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年6月-2017年7月與北京中醫藥大學東直門醫院合作的北京佑安醫院收治的HBV相關肝癌患者106例作為肝癌組，同期北京中醫藥大學東直門醫院收治的慢性乙型肝炎患者120例作為乙型肝炎組以及健康對照受試者100例作為對照組。納入標準：(1)肝癌患者均在北京佑安醫院接受手術治療，腫瘤切除完整，且切緣鏡下午腫瘤，術前、術中未見遠處轉移，術后經病理組織學檢查確診為肝細胞性肝癌；(2)肝癌患者均為HBsAg陽性半年以上和(或)HBV DNA>1×103IU/L；(3)慢性乙型肝炎患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中相關診斷標準，且HBsAg陽性半年以上和(或)HBV DNA>1×103IU/L；(4)對照組均為健康的體檢志愿者，無心、腦、腎以及內分泌代謝性疾病。排除標準：(1)其他部位惡性腫瘤肝轉移患者；(2)合并丙型肝炎、甲型肝炎等其他肝炎病毒感染者；(3)合并代謝性肝病、自身免疫性肝病以及酒精性脂肪性肝病等其他肝臟病變患者；(4)合并其他嚴重內科疾病或精神疾病患者。

1.2 標本采集及基因組DNA提取 抽取3組受試者清晨空腹肘靜脈血5 ml，使用乙二胺四乙酸抗凝，使用上海生工生物工程公司全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA，將其置于-20 ℃保存待用。

1.3 PCR引物以及反應條件 分別擴增TLR4 D299G、T399I以及A896G多態性位點基因序列。根據文獻[8]設計引物，采用Bio-Rad PCR儀，PCR反應體系為30 μl，包括10×Buffer 3 μl、dNTPs 2.4 μl、上游引物0.9 μl、下游引物0.9 μl、Taq DNA聚合酶0.24 μl、DNA模板2 μl、無酶雙蒸水20.56 μl。PCR反應條件為95 ℃預變性4 min，94 ℃ 45 s、55 s(D299G和A896G：56 ℃；T399I：58 ℃)，72 ℃ 1 min，共35個循環，72 ℃ 10 min。取3 μl PCR擴增產物于含溴化乙錠(0.5 μg/ml)的2%瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠成像系統記錄電泳結果，每次PCR反應均使用無菌雙蒸水作為陰性對照。使用限制性內切酶Nco I酶切上述PCR產物，酶切體系20 μl，包括10×K Buffer 2 μl、10 μ/μl Nco I 1 μl，PCR產物10 μl以及無酶雙蒸水7 μl。混勻后瞬時離心，酶切產物于含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠成像系統記錄實驗結果。

1.4 擴增產物檢測及分析 取10 μl PCR反應產物，使用10 U BamH I內切酶于37 ℃條件下酶切消化4 h，反應終止后產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA片段長度標準物作為參考，在紫外燈下觀察結果。

1.5 隨訪 術后對患者進行隨訪，包括門診隨訪、電話隨訪、微信隨訪、視頻隨訪等形式，隨訪間隔不超過3個月，以術后復發作為隨訪終點，包括局部復發與遠處轉移，隨訪截止日期為2019年8月31日。

1.6 倫理學審查 本研究經北京中醫藥大學東直門醫院倫理委員會批準同意(批號：ECPJ-BDY-2015-27)，3組受試者均自愿簽署知情同意書。

2 結果

2.1 3組受試者臨床資料比較 3組受試者性別、年齡、高血壓、糖尿病比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)，乙型肝炎組與肝癌組患者HBV DNA病毒載量比較差異無統計學意義[(4.68±1.54)log IU/ml vs(4.39±1.20)log IU/ml,P=0.119]，乙型肝炎組與肝癌組肝功能指標AST以及ALT顯著高于對照組(P值均<0.05)，且肝癌組AST、ALT顯著高于乙型肝炎組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 TLR4基因型及等位基因分布與肝癌關系 經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，各組的觀察數與預期數比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)，表明各基因頻率符合遺傳平衡，具有群體代表性。3組受試者TLR4 D299G位點以及TLR4 A896G位點基因型及等位基因分布差異均無統計學意義(P值均>0.05)；而3組受試者TLR4 T399I位點基因型比較差異有統計學意義(P<0.05)，肝癌組T等位基因頻率明顯高于乙型肝炎組及對照組(P<0.05)，其中乙型肝炎組與對照組比較χ2=4.090、P=0.043，肝癌組與對照組比較χ2=14.933、P<0.001，肝癌組與乙型肝炎組比較χ2=4.091、P=0.043(表2)。非條件logistic回歸模型顯示，TLR4 T399I基因型及等位基因進入回歸模型(P<0.05)，TLR4 T399I CC基因型OR[95%可信區間(95%CI)]為1.682(1.109～2.243)，P=0.027、TLR4 T399I TT基因型OR(95%CI)為2.103(1.347～2.896)，P<0.001；TLR4 T399I T等位基因OR(95% CI)為1.872(1.192～2.374)，P=0.002。

2.3 TLR4基因型對肝癌患者術后復發的影響 TLR4 D299G位點以及TLR4 A896G位點不同基因型肝癌患者術后無復發生存情況無明顯差異(χ2=0.022、0.471，P值均>0.05)；TLR4 T399I位點CC基因型肝癌患者術后無復發生存情況明顯優于CT+TT基因型(χ2=6.781，P<0.05)(圖1～3)。

表1 3組受試者臨床資料比較

表2 TLR4基因型、等位基因與肝癌的關系[(例)%]

3 討論

腫瘤是一種多基因疾病，基因的變異、缺失以及畸形是導致腫瘤發生發展的重要因素，腫瘤的遺傳易感性是由于不同基因、不同多態相關的組合效應所構成[8]。肝癌是全球范圍內最具挑戰的健康問題之一，我國原發性肝癌發病最為常見的原因為HBV感染[9]。對于HBV相關原發性肝癌患者的臨床治療，目前主要以手術治療為主[10]，肝葉切除術一直是患者首選治療方式[11-12]。但是由于患者術后高復發率以及高轉移率，手術切除術后患者臨床預后仍不理想。除了各種外部因素的影響，近年來學者[13-14]提出，遺傳因素也對患者術后復發、轉移有重要影響。

TLRs家族是一類天然免疫識別受體，主要在樹突狀細胞、巨噬細胞以及單核細胞等細胞膜上表達，是介導特異性免疫反應的跨膜模式識別分子受體家族，可介導機體的天然免疫，同時也可提供刺激分析和誘導T淋巴細胞分化的細胞因子，幫助機體建立獲得性免疫[15-16]。TLR4是TLRs家族中獨特的一員，在機體固有免疫起始反應中具有舉足輕重的作用，研究[17-18]顯示，TLR4在肝癌組織中高表達，且新的證據表明TLR4與腫瘤的發生以及腫瘤進展有關，TLR4激活可導致免疫反應的活化，繼而促進腫瘤的發生發展。有研究[19-20]報道，TLR4基因多態性與結腸癌、胃癌等多種腫瘤的易感性有關，本研究探討分析TLR4基因多態性與HBV相關原發性肝癌易感性之間的關系以及對患者預后的影響。

本研究結果顯示，3組受試者TLR4 D299G位點以及TLR4 A896G位點基因型及等位基因分布差異均無統計學意義(P值均>0.05)；而3組受試者TLR4 T399I位點基因型比較差異有統計學意義(P<0.05)，肝癌組T等位基因頻率明顯高于乙型肝炎組及對照組(P<0.05)。提示TLR4 T399I位點基因突變與HBV相關原發性肝癌發生密切相關，該位點T基因的攜帶可能是肝癌易感因素之一，T等位基因肝癌發生風險是C等位基因的1.872倍，與既往研究[21]結果相似，認為TLR4 T399I位點T等位基因可能促進腫瘤組織中TLR4的過度激活，促進IL-1α以及TNFα表達的升高，從而促進腫瘤的發生發展。有研究[23]報道，肝炎病毒感染所引發的炎癥反應可激活TLR4信號途徑，誘導IL-6等細胞因子的分泌，促使腫瘤細胞對細胞毒性T淋巴細胞的攻擊產生抵抗作用，促使腫瘤細胞逃避免疫攻擊，但腫瘤最終的發生取決于個人對腫瘤的易感性。

此外，本研究分析TLR4基因多態性與HBV相關原發性肝癌患者術后復發情況的影響，結果顯示，TLR4 D299G位點以及TLR4 A896G位點不同基因型肝癌患者術后無復發生存情況無明顯差異(P>0.05)；TLR4 T399I位點CC基因型肝癌患者術后無復發生存情況明顯優于CT+TT基因型(P<0.05)。提示TLR4 T399I位點基因多態性與肝癌患者臨床預后密切相關，其中CT+TT患者術后復發率更高，T基因的攜帶可能導致患者預后更差，而關于其影響機制，目前尚未見相關研究報道，仍需進一步深入研究分析，考慮與腫瘤細胞侵襲轉移能力、機體免疫以及基因對腫瘤耐藥影響等因素有關[23]。

綜上所述，TLR4 T399I位點基因多態性與HBV相關原發性肝癌易感性密切相關，該位點T基因攜帶可能是腫瘤發生以及預后不良的重要因素。