異甘草酸鎂對刀豆蛋白A誘導的急性肝衰竭小鼠模型的影響

高鈺迪，田 原，張向穎，張曉慧，段鐘平，任 鋒，陳 煜

首都醫科大學附屬北京佑安醫院，a.疑難肝病及人工肝中心，肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室；b.北京市肝病研究所，北京 100069

急性肝衰竭是由病毒感染、化學物質損傷及自身免疫反應等多種原因引起的嚴重臨床癥候群，是多種肝臟疾病的終末階段。其起病急、病死率高，內科綜合治療效果不佳，外科治療限制因素多，是嚴峻的全球性健康問題，其中肝臟的免疫反應是發病機制的關鍵[1]。刀豆蛋白A(ConA)是提取自大刀豆的植物血凝素，同時具有刺激T淋巴細胞增殖的特性，其誘導的免疫性肝損傷模型可以較好地模擬病毒性肝炎、自身免疫性肝病等肝臟疾病的免疫學機制，是目前應用非常普遍的肝病模型之一[2]。異甘草酸鎂(MgIG)是第四代甘草酸類藥物，具有優良的抗炎、抗氧化作用，廣泛應用于肝病的臨床治療[3-5]。研究[6-7]表明MgIG可通過調節多種信號轉導通路緩解多種因素所致肝損傷，而對ConA誘導免疫性肝損傷的急性肝衰竭模型的作用尚無較深入研究。本研究通過MgIG對ConA誘導急性肝衰竭小鼠模型的影響，進一步探究其對急性肝衰竭發病機制中肝臟免疫反應可能的保護機制，為急性肝衰竭的內科臨床診治及新一代甘草酸藥物的臨床應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 健康BALB/C小鼠，雄性，8～12周，體質量20～25 g，購自維通利華生物有限公司，在首都醫科大學附屬北京佑安醫院飼養。MgIG藥物由江蘇省正大天晴股份有限公司提供；ConA購自美國西格瑪公司(Sigma)；TUNEL試劑盒購自美國羅氏生物制藥公司(Roche)；caspase3活性試劑盒購自碧云天生物公司(Beyotime)；預混液相芯片試劑盒購自德國默克公司(Merck)。

1.2 小鼠免疫性肝損傷模型建立 90只小鼠隨機分為4組，分別為對照組、MgIG對照組，每組各10只；ConA模型組、MgIG+ConA預處理組，每組各35只(其中的15只用來計算總生存率)。12 h禁食處理后，對照組小鼠腹腔注射PBS緩沖液(pH=7.20)處理；MgIG對照組小鼠采用腹腔注射(30 mg/kg)MgIG[8]；ConA模型組小鼠尾靜脈注射ConA(20 mg/kg)建模；MgIG+ConA預處理組小鼠于ConA建模前2 h給予MgIG(30 mg/kg)腹腔注射預處理，根據轉氨酶升高水平判斷建模效果。

1.3 標本采集 模型建立后12 h，戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠，取眼球靜脈血1.5 ml，3000 r/min離心10 min獲取上層血清，-80 ℃保存，送檢首都醫科大學臨床檢測中心測定ALT及AST水平。肝臟組織剪去肝葉邊緣，取5 mm3經4%多聚甲醛固定制作石蠟切片待用。取3 mm3于液氮保存制作冰凍切片待用。

1.4 肝臟標本HE染色 模型建立后，取肝組織浸泡于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，制備5 μm厚度切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡，蘇木素及伊紅水溶液染色，光學顯微鏡以100及200倍數觀察，并進行病理評分。評分標準如下：肝小葉結構完整，未見肝細胞腫脹變性、壞死及炎癥細胞浸潤，計1分；肝小葉結構基本完整，肝細胞局限性變性、點狀壞死，偶見炎癥細胞浸潤，計2分；肝小葉結構改變，肝細胞彌散性變性、腫脹、碎片狀壞死，局限性炎癥細胞浸潤，計3分；肝小葉結構紊亂，肝細胞變性腫脹明顯，亞大塊或大塊壞死，大量炎癥細胞浸潤，計4分。

1.5 TUNEL法檢測肝細胞凋亡 冰凍切片于4%多聚甲醛中固定30 min，0.1% triton-X 100溶液透化，PBS緩沖液沖洗3次，加入熒光標記的TUNEL混合物，DAPI復染核。熒光顯微鏡下觀測，凋亡細胞呈現紅色熒光，細胞核為藍色熒光，Image J軟件計算細胞數目。

1.6 caspase3蛋白活性測定 肝臟組織加入裂解液，冰浴勻漿后離心置于冰上，裂解物4 ℃下18 000×g離心15 min，將上清液移至預冷離心管中。按試劑盒指導手冊操作，加入檢測緩沖液和Ac-DEVD-pNA混勻，37 ℃下孵育2 h，測定樣品A405，根據標準曲線計算相應的蛋白活性。

1.7 蛋白印跡法檢測caspase3蛋白表達 肝組織置于1 ml組織裂解液中，電動勻漿器勻漿，4 ℃下3000 r/min離心5 min取上清液，-80 ℃儲存。BCA蛋白定量法根據吸光度計算蛋白質濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，30 V電壓下轉膜12 h至PVDF膜，5%牛奶封閉，1∶1000第一抗體孵育過夜；TBST洗膜，1∶2000第二抗體孵育1.5 h。洗膜后加入增強化學發光液曝光。掃描膠片，Image J軟件分析目標條帶灰度值。

1.8 液相芯片法測定小鼠血清炎癥因子 模型建立后，取小鼠外周血以3000 r/min的速度4 ℃下離心10 min，分離上層血清，使用預混液相芯片試劑盒，按試劑盒指導手冊操作，Luminex 200系統上機檢測。

1.9 倫理學審查 本研究方案經由首都醫科大學實驗動物倫理委員會審批，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 小鼠生存率 從ConA模型組與MgIG+ConA預處理組小鼠中各隨機選取15只，共觀察72 h。ConA模型組小鼠于給藥6 h后開始死亡，共死亡9只；MgIG+ConA預處理組小鼠于給藥12 h后開始死亡，共死亡3只。直接概率法計算ConA模型組小鼠總生存率為40%，MgIG+ConA預處理組小鼠總生存率為80%(圖1)。

2.2 小鼠ALT和AST水平 ConA模型組小鼠轉氨酶水平較對照組顯著上升(P值均<0.05)，經MgIG預處理小鼠轉氨酶水平較ConA模型組小鼠明顯降低(P值均<0.05)(表1)。結果表明MgIG對ConA誘導的小鼠免疫性肝損傷存在保護作用。

2.3 小鼠肝臟組織學變化 模型建立后，根據建模效果，選取對照組及MgIG對照組各8只、ConA模型組與MgIG+ConA預處理組各12只進行下一步實驗。取肝臟組織經HE染色后觀察小鼠肝組織。對照組小鼠及MgIG對照組小鼠肝組織結構清晰，肝細胞形態規整，呈多邊形，圍繞中心靜脈規則排布圍成肝小葉，肝組織無淤血。經ConA處理12 h后，小鼠肝小葉內淤血明顯，肝組織呈大塊及亞大塊壞死，肝細胞腫脹、排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤。MgIG預處理組較之ConA模型組，肝組織淤血減輕，肝組織壞死區域明顯減小，僅有少量炎癥細胞浸潤，細胞形態大致正常(圖2，3)。對照組、MgIG對照組、ConA模型組及MgIG+ConA預處理組病理評分分別為1.0±0.2、1.2±0.3、3.7±0.6、2.3±0.5,4組間比較差異有統計學意義(F=2.7，P<0.05)，對照組與MgIG對照組間比較無統計學意義(P>0.05)，余各組間比較結果均具有統計學意義(P值均<0.05)。

表1 各組小鼠血清轉氨酶水平

2.4 小鼠肝組織TUNEL染色 冰凍切片染色后，觀察小鼠肝組織，計數胞核深染紅色熒光的細胞所占比例。對照組與MgIG對照組凋亡細胞較少，凋亡細胞所占比例差異無統計學意義(P>0.05)。ConA模型組小鼠肝細胞凋亡水平明顯升高，經MgIG+ConA預處理的小鼠肝細胞凋亡減少，對照組、MgIG對照組、ConA模型組及MgIG+ConA預處理組中每100個細胞中凋亡細胞數值分別為0.2±0.1、0.1±0.1、7.8±1.3、2.2±0.4，4組間比較差異有統計學意義(F=27.6，P<0.001)。對照組與MgIG對照組間比較無統計學意義(P>0.05)，余各組間比較結果均具有統計學意義(P值均<0.05)(圖4)。

2.5 小鼠肝臟caspase-3總蛋白表達及其活性 肝組織勻漿后采用免疫印跡法檢測caspase-3總蛋白表達水平，caspase-3活性試劑盒測定其蛋白活性。與對應組內參β-actin的相對值比較，4組小鼠caspase-3總蛋白表達水平無明顯差異。在caspase-3活性檢測中，對照組及MgIG對照組caspase-3活性較低，ConA干預組小鼠肝組織caspase-3蛋白活性明顯升高，經MgIG預處理后，caspase-3活性較之ConA組下降，對照組、MgIG對照組、ConA模型組及MgIG+ConA預處理組中caspase-3活性分別為0.813±0.022、0.930±0.033、1.347±0.042、1.060±0.053，4組間比較差異均有統計學意義(F=51.072，P<0.001)，對照組與MgIG對照組間比較無統計學意義(P>0.05)，余各組間比較結果均具有統計學意義(P值均<0.05)(圖5)。以上數據表明MgIG預處理降低了ConA干預后肝細胞凋亡蛋白的活化水平。

2.6 小鼠血清促炎性細胞因子水平 模型建立后，取小鼠外周血離心分離血清，預混試劑盒及Luminex 200系統檢測小鼠血清IL-1β和TNFα表達水平。結果表明，對照組及MgIG對照組血清促炎性細胞因子水平較低，ConA建模后小鼠血清中促炎性細胞因子IL-1β和TNFα與對照組比較明顯上升(P值均<0.05)，而MgIG預處理降低了ConA誘導的促炎性因子水平上升，與ConA模型組比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。結果表明MgIG可顯著降低ConA誘導的小鼠血清中促炎性細胞因子IL-1β和TNFα水平。

表2 4組小鼠血清促炎性細胞因子水平

3 討論

急性肝衰竭是由多種因素導致的肝臟解毒、合成、排泄及生物轉化功能損傷和失代償，是高度兇險的臨床癥候群，以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病為主要表現，起病急驟，病死率極高。在我國，急性肝衰竭的主要病因為病毒性肝炎、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病及遺傳代謝性肝病等，肝細胞病理呈大塊或亞大塊狀壞死，存活肝細胞嚴重變性。治療方式以內科綜合治療基礎上對癥治療為主，尚缺乏特效藥物及手段，近年來人工肝治療及肝移植逐漸應用于臨床，但其設備要求高，肝源稀少限制了急性肝衰竭整體治療效果[1,4]。急性肝衰竭損傷過程中，肝臟炎癥的發生發展發揮了關鍵性作用，包括Kupffer細胞在內的大量免疫細胞分泌多種細胞因子，大量促炎性介質引發的細胞因子風暴介導肝臟內的免疫反應，加重肝臟炎癥，是促進肝細胞損傷的重要環節[9]。細胞凋亡及壞死是肝衰竭的典型病理表現，Kupffer細胞等免疫細胞釋放的TNFα和IL-6可激活STAT3信號通路并誘導caspase家族蛋白的表達，導致細胞凋亡[10]。IL-1β與TNFα也是損傷肝臟細胞的重要促炎因子，應用抗TNFα抗體可顯著緩解ConA誘導的肝損傷[11]。而ConA具有選擇性刺激T淋巴細胞增殖作用，誘導肝臟免疫反應激活，募集CD4+T淋巴細胞、Kupffer細胞等功能性免疫細胞聚集于肝門區，釋放大量炎癥因子攻擊肝組織，導致肝細胞凋亡、壞死，肝組織受損[2,12-13]。其誘導的免疫性肝損傷可以較好地模擬病毒性肝炎、自身免疫性肝病及肝衰竭病理生理過程中的肝內免疫反應。

MgIG是第四代甘草酸類藥物，結構類似糖皮質激素，研究[14-16]表明其抗炎、降酶效果好，對病毒性肝炎、藥物性及酒精性肝病等多種肝臟疾病具有較好療效，可通過調節MAPK、核因子-кB等炎癥反應相關通路緩解肝臟炎癥。本研究結果顯示MgIG可顯著降低ConA誘導肝損傷小鼠血清轉氨酶水平，減少肝組織壞死，明顯改善肝功能。蛋白印跡結果及caspase-3活性檢測共同表明，MgIG可抑制ConA處理后肝組織凋亡相關蛋白caspase-3的活化，進一步通過TUNEL染色法證明其減少了肝細胞凋亡。結果表明，MgIG可以降低ConA誘導的凋亡相關蛋白caspase-3的激活，減少肝細胞凋亡可能是其緩解肝衰竭的機制之一。

Kupffer細胞等免疫細胞及其分泌的多種細胞因子和血清中炎癥細胞因子如IL-1β和TNFα與肝衰竭預后呈正相關。本研究通過液相芯片法檢測小鼠外周血細胞因子表達水平，結果顯示MgIG明顯改善ConA誘導后小鼠血清促炎性細胞因子IL-1β和TNFα水平，表明降低促炎性細胞因子分泌是MgIG緩解肝臟炎癥的可能機制，并由此緩解ConA誘導的肝損傷。

綜上所述，MgIG可明顯緩解ConA誘導的小鼠急性肝衰竭，其機制可能為通過抑制肝細胞凋亡及降低促炎性細胞因子分泌水平緩解肝臟炎癥反應。本課題組將進一步深入研究MgIG對免疫性肝損傷的保護作用，探討其對免疫細胞亞群的調節及其具體的分子機制。