有氧運動聯合水飛薊賓對阻塞性黃疸小鼠模型腸黏膜屏障的影響

彭律成，邵長鳳，陳嘉勤，陳 偉,3

1 永州職業技術學院，湖南 永州 425100；2 湖南師范大學 體適能與運動康復湖南省重點實驗室，長沙 410006；3 湖南體育職業學院，長沙 410019

阻塞性黃疸(obstructive jaundice,OJ)指肝管梗阻后膽汁排泄不暢，膽紅素反流入血，而出現鞏膜及其全身皮膚黃染，也稱為外科黃疸[1]。腸道膽汁缺乏會使腸黏膜屏障受到破壞，腸道細菌和內毒素進入血液循環，引發全身性炎癥及多器官功能障礙[2-4]。目前OJ對腸黏膜屏障的影響已成為熱點。研究[5]發現，microRNAs(miRNAs)能直接或間接與炎癥通路的很多關鍵基因作用。miRNA-21是迄今研究的最為廣泛的miRNAs之一[6]。有研究[7-8]報道，miRNA-21參與了缺血后處理抗腸缺血再灌注損傷的調控過程，其已成為抗炎反應的一個關鍵因子。Toll樣受體4(TLR4)可通過激活其下游效應因子NF-κB，促進炎癥介質的釋放，導致炎癥反應的發生[9]。新近研究[10]證實，TLR4是miRNA-21的下游靶蛋白。miRNA-21過表達可通過抑制TLR4及其下游 NF-κB的活化，降低炎癥因子的表達。但miRNA-21/TLR4/NF-κB通路是否參與了OJ腸損傷的調控過程，尚缺少文獻報道。作為天然多酚類黃酮，水飛薊賓具有抗炎、抗脂質過氧化、抗脂氧酶等活性，可以減少炎癥細胞因子的產生，并減輕結腸黏膜屏障的損傷[11-12]。有氧運動作為一種簡單、易行且經濟的臨床康復治療手段，對OJ肝損傷具有改善作用[13-14]，同時可以改善腸缺血再灌注、炎癥性腸病和結腸癌腸黏膜損傷。但有氧運動和水飛薊賓，以及聯合干預在OJ腸損傷中的作用及機制，鮮有相關文獻報道。為此，本研究利用本課題組膽總管結扎法，采用手術線直角懸掛膽總管72 h構建小鼠OJ模型，探討有氧運動及水飛薊賓對OJ小鼠腸黏膜屏障的影響及可能的交互效應。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要試劑：Trizol(Inventragtion)、反轉錄試劑盒(TAKA-RA，美國)、mRNA引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)、miRNA-21 引物(Ribobio)、兔抗多克隆抗體TLR4、NF-κB(南京建成生物工程研究所)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)、TBil、ALT、AST、二胺氧化酶(DAO)、內毒素檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)、D-乳酸試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。主要儀器：YD-6D型生物組織石蠟包埋機、YD-A生物組織攤烤片機、LEICA RM2235 切片機、WFG 7200型可見分光光度計、Bio-Rad CFX96Touch 實時熒光定量 PCR 儀、倒置相差顯微鏡、高速低溫離心機、099C K54型電動勻漿機、高性能超凈工作臺。

1.2 動物模型構建與分組 選取成年健康雄性昆明小鼠，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物中心提供(生產許可證 SCXK〔Xiang〕2016-0002)。采用國家標準嚙齒類動物飼料飼養1周后，參照本課題組大鼠膽總管結扎構建OJ模型[15]并加以改進, 構建一種新的膽總管短期(72 h)懸掛OJ小鼠模型。操作如下：麻醉狀態下，鑷子夾起腹部皮膚，剪刀縱向開1～1.5 cm切口，暴露肝臟。距肝門1 cm處分離膽總管，4-0不可吸收手術線將其懸掛于腹壁。假手術組小鼠僅在腹部開同等長度切口，縫合。小鼠放籠飼養，待自然蘇醒。2 d后解除懸掛，復位膽總管。構建OJ模型成功的小鼠隨機分為模型組(M)、有氧運動組(E)、水飛薊賓組(S)和有氧運動聯合水飛薊賓組(ES)，另設假手術組(GO)，每組10只。

1.3 干預方案 確定小鼠運動能力正常，E組和ES組采用中等強度跑臺訓練，訓練前進行為期1周的運動強度適應，固定于每天下午4點。第1～2天，設置運動跑臺坡度為0°，速度6 m/min，訓練25 min/d；第3～4天，設置運動跑臺坡度為5°，速度8 m/min，訓練40 min/d；第5～6天設置運動跑臺坡度為8°，速度10 m/min，訓練1 h/d。之后保持此強度共訓練至第7周，每周休息1 d。S組和ES組按人與小鼠體表面積折算等效劑量經口灌胃(200 mg/kg體質量，0.4 ml生理鹽水進行溶解)。GO組、M組和E組進行相同體積的生理鹽水灌服，1次/d，共7周。

1.4 樣品采集與處理 干預7周后，小鼠禁食過夜，2%戊巴比妥鈉(500 mg/kg)麻醉，確認無翻轉反射后，眼科鑷子摘眼球取血至5 ml 抗凝管中，4 ℃、4500 r/min 離心15 min，吸取上清液，-20 ℃保存備用。手術剪開腹，分離組織，暴露小腸段，距回盲部約3cm處，向近端依次切取末端回腸3段，每段約1 cm，生理鹽水洗凈回腸組織，最末端加入1 ml Trizol，儲存于-80 ℃；次末端液氮速凍后儲存于-80 ℃，用于檢測基因和蛋白表達；近端用10%多聚甲醛固定，備用于相關染色。

1.5 病理學觀察 回腸組織石蠟切片，厚度4 μm，脫蠟、乙醇梯度脫水，HE染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，滴加中性樹膠進行封片，于光學顯微鏡下觀察回腸組織的形態。

1.6 血清學指標檢測 利用全自動生化分析儀測定TBil、ALT和AST；速率法檢測血清中DAO活性；ELISA法檢測血清D-乳酸水平。采用終點顯色法(顯色基質)定量檢測內毒素含量，Bradford法測定回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白含量。

1.7 免疫組化染色 回腸組織石蠟切片，厚度4 μm，步驟按說明書操作，PBS替代一抗作陰性對照。采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術(SABC法)檢測回腸組織中TLR4、NF-κB及TNFα陽性表達，用Simple PCI圖像分析系統進行結果分析，Olympus光學顯微鏡下計算陽性表達面積百分比。

1.8 real-time PCR檢測及高通量測序

1.8.1 回腸組織總RNA提取 按照說明書使用高容量的cDNA逆轉錄試劑盒進行cDNA的合成。使用 Prime Script?RT Master Mix Perfect Real Time kit 定量檢測TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達水平，One Step Prime Script?miRNA cDNA Synthesis Kit 試劑盒逆轉錄試劑盒和 SYBR Green PCR Master Mix Kit(Applied biosystems)PCR試劑盒逆轉錄與定量miRNA-21基因水平。qRT-PCR使用 CFX Connect PCR 系統(BioRad，USA)進行 40 個循環，GAPDH和U6作為內部參照。根據GeneBank 核酸數據庫中神經組織各因子cDNA 序列，TLR4、NF-κB、TNFα mRNA基因引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成(表1)，miRNA-21、U6(內參基因)亦按照miR Base database 數據庫中的堿基由廣州 Ribobio生物科技有限公司提供。PCR 檢測過程每樣本設3個重復，測試結果采用 2-△△Ct法計算組織中基因表達水平，ΔΔCt=實驗組(Ct目的基因-Ct內參基因)-校正組(Ct目的基因-Ct內參基因)。

表1 mRNA基因引物序列

1.8.2 高通量測序 提取檢測樣本肝組織總RNA，待瓊脂糖電泳檢測其純度合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase Ⅰ合成cDNA第二鏈，經過QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA再進行末端修復、加堿基A、加測序接頭處理，然后經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進行PCR擴增，完成整個文庫制備工作。采用Illumina HiSeq 2500進行測序。測序策略為SE50，DEGseq基因表達分析不同組別測序結果的差異性，選取|log2Ratio|≥1與q<0.05的差異表達基因，獲取上下調差異表達基因。

1.9 倫理學審查 本研究方案經由湖南師范大學醫學倫理委員會科學研究項目審批(批號：2018183)，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 一般情況 在模型構建過程中，建模小鼠均未出現由手術或其他原因造成的死亡情況。梗阻約48 h，小鼠嗜睡，精神萎靡，行動遲緩，毛發雜亂、無光澤，尿色變黃。梗阻72 h左右，小鼠尾巴、耳尖及腹部開始出現皮膚黃染，大便色淺、量少，個別小鼠呈現便秘狀態，解剖發現構模小鼠膽管懸掛處出現囊性擴張，肝臟呈淤膽樣改變。有氧運動及水飛薊賓干預7周后，相比M組，E組、S組、ES組OJ生理病理癥狀明顯減輕。

2.2 回腸組織病理學改變 圖1可見，GO組小鼠腸黏膜正常，腺體、絨毛形態正常，腺上皮排列整齊，基底膜及肌層完整。M組腸黏膜結構破壞嚴重，絨毛稀疏、變細，部分腺體萎縮且高度不均，脫落，間質水腫，局部有炎癥細胞浸潤，肌層萎縮。E組腸黏膜結構有所改善，腺體排列整齊，細胞形態正常，水腫消失，少有炎癥細胞浸潤。S組腺上皮排列整齊，腺體分泌活躍。ES組長絨毛形態，接近正常腸上皮。

2.3 肝功能測定結果 M組小鼠血清TBil、ALT 和AST水平最高；E組、S組血清TBil、ALT和AST水平較M組均明顯降低(P值均<0.01)；與E組、S組相比，ES組TBil、ALT 和AST水平降低(P值均<0.05)(表2)。且有氧運動與水飛薊賓間對血清TBil、ALT 和AST水平存在協同作用(P值均<0.05)。

表2 各組血清TBil、ALT、AST水平的比較

2.4 血清DAO、D-乳酸和內毒素測定結果 M組血清中腸屏障功能指標DAO、D-乳酸及內毒素水平最高;相比M組，E組、S組和ES組血清中DAO、D-乳酸水平及內毒素水平均下降(P值均<0.05)；相比E組、S組，ES組DAO與D-乳酸水平下降均具有非常顯著性差異(P值均<0.01)，內毒素水平下降具有顯著性差異(P<0.05)(表3)。對于上述指標，除DAO水平以外，有氧運動和水飛薊賓間均存在協同作用(P值均<0.05)。

表3 腸屏障功能相關指標檢測結果

2.5 回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα免疫組化染色結果TLR4免疫陽性細胞呈棕褐色，NF-κB、TNFα呈淡藍色，胞體染色深，胞核不著色(圖2)。GO組中小鼠腸組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白陽性表達面積最低，M組表達最高；相比M組，E組、S組、ES組各炎性因子蛋白陽性面積均顯著下降(P值均<0.01)，相比E、S組，ES組各因子陽性表達面積降低(P值均<0.01)(表4)。對于NF-κB、TNFα蛋白表達，有氧運動和水飛薊賓間具有協同作用(P值均<0.05)。

表4 相關因子蛋白陽性表達面積

2.6 回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平檢測 M組肝組織中TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平最高，ES組最低。相比M組，E組、S組、ES組肝組織TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平均顯著降低(P值均<0.05)；相比E組、S組，ES組TLR4、NF-κB、TNFα蛋白水平均具有明顯降低趨勢(P值均<0.05)(表5)。除NF-κB蛋白水平外，有氧運動和水飛薊賓對TLR4、TNFα蛋白水平的升高具有協同作用(P值均<0.05)。

2.7 高通量測序的KEGG功能富集關聯分析 實驗為探究不同組別樣本轉錄組間差異，主要對E組與M組、E組與ES組、S組與ES組間肝組織的差異表達基因進行篩選，共鑒定出10 657個差異表達基因，含7415個上調基因，3242個下調基因，其主要在炎癥信號通路激活后誘發，與炎性因子釋放密切相關，以及涉及參與調控細胞增殖分化、細胞損傷修復和心血管神經變性的相關蛋白抑制劑等。高通量測序結果顯示共207個差異表達基因富集于60個KEGG通路，主要參與肝纖維化發病機制、TNFα通路、膽汁分泌、NOD樣受體信號傳導、TLR-NF-κB 信號通路、炎癥介質調節信號通路、TGFβ信號通路等。另細胞增殖、分化、硫代謝、多巴胺等差異表達基因也富集于KEGG 通路，雖不具非常顯著性差異，但差異表達基因所對應的富集通路具有一定意義。

表5 回腸組織相關因子蛋白水平檢測

2.8 回腸組織miRNA-21/TLR4/NF-κB通路軸相關因子基因表達 相比M組，7周有氧運動干預后E組、S組、ES組miRNA-21基因表達均顯著升高(P值均<0.05)，相比E組、S組，ES組miRNA-21基因表達顯著升高(P值均<0.01)。M組小鼠TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達最高(P值均<0.01)。與M組比較，E組、S組TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達顯著降低(P值均<0.01)；與E組、S組相比，ES組TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達顯著下降(P值均<0.01)(表6)。除miRNA-21 mRNA表達水平外，有氧運動和水飛薊賓對于TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達存在協同效應(P值均<0.05)。

表6 回腸組織miRNA-21、TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達

3 討論

膽汁是肝臟合成及分泌的一種復雜水溶液，對于小腸中脂肪和脂溶性維生素的消化和吸收至關重要。此外，膽汁是消除過量膽固醇、內毒素、膽紅素、藥物和有毒化合物的重要途徑[16]。多種原因誘發膽汁分泌或排泄障礙時，造成肝臟內毒性和代謝廢物的堆積，膽汁酸與膽紅素在機體體循環中含量增加，同時由于腸道膽汁缺乏，腸道細菌繁殖受到抑制及腸源性內毒素降解減慢，呈現膽汁淤積性病變，致使腸屏障功能障礙，促進細菌移位，炎性因子“瀑布樣”效應，對多器官生理功能造成影響[17]。膽汁的分泌與排泄信號傳導機制錯綜復雜，主要依靠肝細胞、膽管腸細胞膜上相關蛋白質進行轉運。Chiang等[18]研究發現膽汁酸對于保護肝臟和其他組織及細胞免受膽固醇和膽汁酸毒性至關重要。同時也是維持腸屏障功能穩態的重要物質，膽汁酸穩態的改變將導致膽汁淤積性肝病、腸道消化系統炎性疾病、肥胖癥和糖尿病。Yang等[19]采用內毒素血癥的大鼠膽汁對正常小鼠進行飼養，發現小鼠肝組織巨噬細胞向膽汁中釋放了大量的炎癥細胞，且膽汁流速顯著下降，黏膜通透性和腸道細菌易位性增加。本實驗中，高通量測序KEGG分析顯示，OJ小鼠肝細胞中轉運系統的蛋白分子發生活性變化，肝胞質膜鈉依賴牛磺膽酸共轉運體、多耐藥相關蛋白(multidrug resistance,MRP)3、有機陰離子轉運多肽、轉運蛋白質、膽鹽輸出泵(BSEP)等活性下降，MRP4和MRP1活性增加，明顯降低膽汁酸排泄和膽汁流量。血清腸屏障功能指標DAO、D-乳酸和內毒素水平顯著上升，回腸組織顯微結構病理改變明顯，同時肝功能指標AST、ALT和TBil水平增加，結合小鼠一般行為學觀察結果。提示，OJ小鼠構模成功，并導致腸屏障功能受損，但是否與炎性因子的釋放有關尚未確定。

miRNAs是一類內源性表達的、具有多種調控功能的非編碼RNA，其長度約為20～25個核苷酸，它可以和靶基因mRNA堿基互補配對，促使沉默復合體對mRNA進行降解，或干擾其翻譯，進而影響細胞的增殖、侵襲、凋亡、氧化應激等生理過程[20]。近年來，miRNA對腸道屏障功能的調控作用正逐漸被揭示。目前已經發現諸多miRNA分子在腸黏膜組織中表達異常，引起腸黏膜組織內免疫功能紊亂，損傷腸上皮細胞屏障功能，導致腸黏膜組織內異常炎癥免疫反應。miRNA-126通過抑制靶基因S1PR2激活PI3K/AKT信號通路，導致上皮細胞屏障功能受損[21]；miRNA-10a在炎癥性腸病患者及小鼠炎癥腸黏膜組織中表達降低，誘導炎癥發生，據報道miRNA-21參與了缺血后處理抗腸缺血再灌注損傷的調控過程[22]，已成為抗炎反應的一個關鍵媒介。對于TLR4與miRNA-21的研究也有部分報道，新近研究[23]證實，TLR4 是miRNA-21的下游靶蛋白。miRNA-21過表達可通過抑制 TLR4 及其下游 NF-κB的活化，降低炎癥因子的表達[11]。提示miRNA-21可能具有通過調控TLR4通路而影響腸黏膜損傷發生、進展的潛在作用。然而，miRNA-21/TLR4/NF-κB是否參與OJ腸黏膜損傷過程，仍未得到充分的證實。本實驗中，M組miRNA-21表達水平高于GO組，表明OJ小鼠腸組織miRNA-21應激性升高。TLR4、NF-κB、TNFα mRNA表達水平明顯上調，TLR4/NF-κB炎性信號通路激活，促進下游TNFα等炎性信號因子的活化，造成炎癥瀑布式效應，結合血生化及組織相關指標檢測，提示OJ小鼠可能激活miRNA-21/TLR4/NF-κB通路誘發炎癥。免疫組化染色及回腸組織蛋白檢測結果顯示，TLR4、NF-κB、TNFα陽性表達面積及蛋白水平顯著上升，結合高通量測序結果，進一步表明miRNA-21/TLR4/NF-κB通路參與了OJ所導致的腸黏膜上皮細胞炎性損傷過程，且膽汁排泄障礙可激活miRNA-21/TLR4/NF-κB炎性通路軸，致使腸屏障功能炎性損傷。

有氧運動和水飛薊賓抑炎的作用早已被證實，但其是否對miRNA-21起到調控作用，進而下調其靶基因TLR4信號傳導機制發揮抑炎作用在很大程度上仍是未知的。多項研究表明，間歇和中等強度運動訓練對miRNAs具有調控作用[24]。Baggish等[25]研究發現運動誘導相關miRNAs 的變化，如血管生成(miRNA-20a、miRNA-210、miRNA-221、miRNA-222和miRNA-328)、炎癥(miRNA-21和miRNA-146a)、心肌和骨骼肌的收縮(miRNA-21和miRNA-133a)、肌肉對低氧和缺血的適應(miRNA-21、miRNA-146a和miRNA-210)。Dimassi等[26]探討了9種miRNAs對有氧運動在肥胖調節炎癥和血管功能中的作用。根據孟憲欣等[27]的前期報道，長期規律運動下調miRNA-214表達可有效抑制NF-κB活性從而使結腸炎癥得到改善，保護炎癥性腸病腸黏膜損傷。水飛薊賓是一種傳統草藥，可以抑制腸道腫瘤細胞的活力，并抑制腸道炎癥。在不同的細胞模型中, 水飛薊賓都顯示對NF-κB等多種炎癥因子活性的抑制作用。但目前有氧運動聯合水飛薊賓對OJ致腸屏障功能損傷的文獻鮮有報道。本實驗中，7周有氧運動和水飛薊賓灌胃干預后，一般情況觀察黃疸癥狀明顯改善，血清AST、ALT和TBil水平顯著降低，且有氧運動與水飛薊賓間存在協同作用。腸黏膜病理結構改善顯著，腺體排列整齊，細胞形態正常，水腫消失，少有炎癥細胞浸潤。血清腸屏障功能指標DAO、D-乳酸和內毒素水平下降，除DAO水平外，有氧運動與水飛薊賓間存在協同作用。結合回腸組織TLR4、NF-κB、TNFα陽性表達面積及蛋白水平降低結果，表明有氧運動、水飛薊賓干預與OJ后腸屏障功能的穩定及炎癥因子的介導密切相關，且有氧運動與水飛薊賓對炎性因子的調控存在協同效應。為進一步驗證有氧運動、水飛薊賓與TLR4/NF-κB炎性通路間的關系，本研究對M組、E組、S組與ES組小鼠肝組織進行mRNA高通量測序，且對其測序結果進行關聯分析，結合miRNA-21、TLR4、NF-κB、TNFα基因表達結果，有氧運動、水飛薊賓可顯著升高miRNA-21 mRNA表達水平，下調TLR4/NF-κB通路軸，抑制單核細胞等分泌TNFα炎性細胞因子，介導一系列生理(免疫反應性強化)和病理(炎癥)反應，保護腸黏膜屏障功能，除miRNA-21基因水平外，有氧運動與水飛薊賓對于TLR4、NF-κB、TNFα基因表達存在協同作用。

miRNA-21/TLR4/NF-κB通路軸對OJ小鼠致腸屏障功能炎性損傷具有重要調控作用，7周有氧運動與水飛薊賓可促進miRNA-21高表達，顯著下調TLR4的表達，促進炎性因子NF-κB、TNFα低表達，對腸黏膜屏障的炎性損傷發揮了較明顯的保護作用，且有氧運動聯合水飛薊賓干預效果更佳，在腸屏障功能的恢復及炎癥反應的抑制上，有氧運動與水飛薊賓間存在協同效應。