microRNA調控肝星狀細胞活化干預肝癌癌前病變的研究進展

吳 杰，李京濤，魏海梁，閆曙光，范 妤，郭英君，常占杰

1 陜西中醫藥大學 第一臨床醫學院，陜西 咸陽 712046；2 陜西中醫藥大學附屬醫院 肝病科，陜西 咸陽 712046；3 寧夏回族自治區人民醫院 肝病科，銀川 750001

肝細胞癌(HCC)是全世界第二大常見的癌癥死亡原因，占所有原發性肝惡性腫瘤的90%[1]。過去15年HCC的發病率呈逐年遞增趨勢，盡管治療方案不斷改進，但患者預后仍然很差，其主要原因是由于多數患者發現時已至晚期，失去最佳治療時機[2]。臨床上，依靠影像學、病理學和分子生物學檢測，可以及早的發現肝癌癌前病變的存在[2]。研究[3]證實，在HCC的進展中，會經歷一個較長的肝癌癌前病變過程。HCC癌前病變表現為：肝細胞異型增生、異型增生灶、低度異型增生結節、高度異型增生結節、肝細胞腺瘤。如果能夠將肝癌的治療陣線前移，在HCC癌前病變階段就及早干預，就有可能阻止或延緩癌前病變惡性轉變為HCC。

HCC癌前病變惡性轉變的機制尚不明確。目前較公認的機制包括肝癌癌前病變細胞的產生(種子破壞)、炎癥纖維化微環境的形成(環境污染)，以及兩者的相互作用[4]。而在上述機制中，肝星狀細胞(HSC)的活化和異常分泌始終處于核心地位，在HCC癌前病變細胞啟動、產生以及發展各階段中，作為異常微環境的特殊組成部分，HSC亦起著關鍵的作用。本文就microRNA(miRNA)靶向調控HSC活化，干預肝癌癌前病變惡性轉變的機制研究新進展進行綜述。

1 HSC活化與肝癌癌前病變的關系

1.1 HSC活化 當肝臟受致病因子(病毒、酒精或內毒素等危險因子)損傷時，HSC的鄰近細胞(肝竇內皮細胞、Kupffer細胞等)分泌多種細胞因子，這些細胞因子作用于HSC，通過誘導基因轉錄使HSC基因表達發生改變，HSC會丟失細胞內脂質小滴，轉變為成纖維性肌成纖維細胞表型，并表達大量的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和細胞外基質蛋白(ECM)，使其具有自身增殖能力、分泌與調節功能，即活化的HSC[5-6]。活化的HSC通過基質金屬蛋白酶抑制劑抑制基質金屬蛋白酶活性，導致細胞外基質進一步累積，同時產生大量相關的趨化因子與細胞因子。ECM的過度沉積與細胞因子的大量分泌又進一步刺激活化HSC，如此形成一個正反饋而維持HSC的活性[7]。

1.2 活化的HSC貫穿HCC癌前病變全過程 正常肝細胞的增殖和分化都由細胞內和細胞間信號調控，活化的HSC異常分泌從而干擾正常基因表達、細胞間信號通路傳導，使機體細胞組織發生癌變。研究[8]表明，在含有HSC的條件培養基中能顯著地誘導肝癌細胞在單層培養皿中的增殖和遷移，在三維球體共培養系統中，HSC促進肝癌的生長，減少中心壞死程度，在裸鼠體內同時植入HSC和HCC細胞可促進肝癌的生長和侵襲，抑制腫瘤壞死。HCC癌前病變細胞的啟動階段,在致病因子持續作用下使肝細胞破壞并向異型增生結節轉化[9]。異型增生結節是指在慢性肝炎或肝硬化背景下形成的具有不典型特征的增生結節或團塊，存在細胞質和細胞核的異常[10]。與HCC不同，異型增生結節是一種新生的類腫瘤樣病變而非單純的增生性病變[11]。研究[12]表明，高分化異型增生結節患者的端粒酶逆轉錄酶活性強，推測是因為端粒的長度和結構改變，導致染色體穩定性的改變，進而出現基因突變，而呈現出較高的惡變風險。

在HCC發生發展中，基因組改變是一個逐步累積的過程，持續的基因突變或缺失以及變異基因積累促進異型增生結節的發展[13]。從而加快了啟動進程[14]。研究[15]顯示，端粒酶逆轉錄酶啟動子的突變頻率與p16基因甲基化在肝癌的發生發展中呈明顯遞增的趨勢。在HCC癌前病變細胞的啟動階段中，活化的HSC通過旁分泌產生大量TGFβ，激活TGFβ1-PI3K/AKT信號通路，通過抑制下游抑癌二聚體TSC1/TSC2 活性，調節mRNA的轉錄，改變肝細胞基因表型，同時活化的HSC可直接分泌免疫調節因子(包括IL-1、IL-6、MCP-1、CCL21等)促進炎癥因子的聚集，導致肝細胞非典型增生性修復[16]，從而進一步促進異型增生結節的形成，為肝細胞的惡性轉變或肝干細胞轉化為HCC癌前病變細胞奠定基礎。

在HCC癌前病變細胞的產生階段，致病因子持續作用與基因變異不斷蓄積，逐漸使大量肝細胞與HSC鄰近細胞受損，HSC鄰近細胞分泌的細胞因子進一步促使更多的HSC活化[17]，大量活化的HSC通過調節胞外基質的降解與合成，降低間質膠原酶活性，減少ECM降解，使大量胞外基質蛋白沉積，ECM被新生的膠原蛋白所取代，加劇炎癥因子的浸潤，同時，HSC分泌的促炎因子又進一步加重對已損傷肝細胞區域的浸潤，受損區域在正反饋調節下促進局部炎性細胞的趨化性、黏附性和活性，進而促使炎癥微環境的形成[18]。在炎癥微環境下，一方面,低分化異型增生結節更易向高分化異型增生結節轉化而加重惡變風險[19]，另一方面，處于有絲分裂期的肝細胞更易發生基因突變，從而干擾了DNA正常復制，導致DNA突變傳給子代細胞，肝細胞惡變基因的不斷蓄積，最終使肝細胞轉化為HCC癌前病變細胞，從而進展為早期肝癌[20-21]。

多數研究者[22]認為在HCC癌前病變細胞的發展階段，腫瘤細胞具有分化程度差、增殖迅速、易擴散的特點,同時呈浸潤性生長。活化的HSC通過調節免疫逃逸，分泌促肝細胞生長因子、促血管生長因子從而使腫瘤細胞直接或間接蔓延侵犯周圍正常肝組織。研究[23]發現活化的HSC通過分泌IL-6，誘導發育髓源性抑制細胞的產生，在腫瘤環境中髓源性抑制細胞的高表達使T淋巴細胞免疫反應表現出較強的抑制性，從而增強腫瘤細胞的免疫逃逸能力，有利于HCC的轉移和發展。活化的HSC可通過連接 B7-H1/Pd-1信號通路顯著增強HSC的免疫調節活性，誘導T淋巴細胞凋亡增強，從而為肝癌細胞的遷移和侵襲創造條件[24]。HSC也可以通過觸發HCC細胞的上皮-間質轉化分泌層粘連蛋白5[25]，而有研究[26]證實這種層粘連蛋白同工型是具有較強的黏附性及遷移性，更具攻擊性和侵害性的癌癥表型。活化的HSC作為腫瘤微環境的重要組成部分，其分泌的TGFβ參與肝內結構的重建，通過細胞收縮使肝竇內壓升高，為癌變形態學的改變奠定了基礎。活化的HSC還通過分泌血管內皮生長因子A與基質金屬蛋白酶9增加肝癌細胞血管形成，從而促進腫瘤細胞遷移、瘤體的增長。除此之外，HSC可直接促進HCC細胞的增殖與發展，增強癌細胞的成瘤能力。

因此，活化的HSC在HCC癌前病變惡性轉變的全過程中均起到重要作用，是肝癌癌前病變惡性轉變防治研究的重要靶點。

2 miRNA與肝癌癌前病變的關系

2.1 miRNA miRNA是指在轉錄后水平通過負調節基因維持細胞內穩態的非編碼RNA，長度約為21 bp，其具有組織特異性小、保守性高、靶基因廣的特點。在轉錄水平下，miRNA通過其自身序列與靶基因之間的特定mRNA堿基配對而下調其靶基因的表達，引起miRNA靶基因的降解或導致蛋白質翻譯的變化，從而參與細胞的代謝、增殖、分化以及調亡等生理過程，在疾病的發生發展中發揮著重要的調控作用[27-28]。因miRNA與靶基因具有“一對多”“多對一”的特點，從而使miRNA與靶基因形成復雜的網絡結構，這種獨特之處使得miRNA能通過信號調節對多種細胞分化過程產生協同作用[29]。基于此，在肝癌癌前病變的發生發展中，相關的miRNA能夠通過調控HSC活化而影響這一過程。

2.2 miRNA對HSC活化的調控作用

miRNA在HSC的活化以及癌變進展過程中發揮著重要的作用。miRNA主要通過調控相關靶基因的表達，進而影響HSC狀態轉化，從而調控HSC增殖與凋亡。

2.2.1 促進HSC活化的miRNA 在HSC活化的進程中，許多miRNA對HSC的活化具有促進作用。Ma等[30]用CCl4誘導肝纖維化大鼠模型，發現肝組織中miRNA-214 水平穩定表達,上調miRNA-214水平可顯著降低負調節因子融合同源基因(Sufu)的表達，從而促進Hedgehog信號通路傳導，促使HSC增殖、纖維細胞外基質的積累和原纖維基因的表達。TGFβ是肝臟疾病中主要的促纖維化細胞因子。TGFβ與TβRⅡ受體結合導致TβRI受體形成異源四聚體，然后通過Smad2/3的R-Smad磷酸化啟動信號通路[31]，磷酸化以后與Smad4結合，然后轉移到細胞核內，調節多個目標基因表達[32]，促進HSC的活化。在此過程中，Smad7和R-Smad競爭性與TβRI受體結合，負調節TGFβ信號傳導，抑制HSC活化。有研究[33]發現，miRNA-17-5p可通過下調Smad7表達，減少其與R-Smad競爭TβRⅠ受體的結合，進而促進TGFβ信號傳導而增強HSC的活化。同時，miRNA-212-3p過表達也可靶向下調抑制性因子Smad7，進而促進TGFβ信號通路，誘導HSC的活化[34]，促進肝纖維化細胞的增殖并抑制其凋亡。研究[35]表明PI3K/AKT通路在促進HSC活化、抑制HSC凋亡充當著重要的角色。TGFβ通過TGFβⅠ型受體直接激活PI3K/AKT通路，miRNA-216a/217簇作為Smad7的抑制劑，通過促進TGFβ信號傳導進而激活PI3K/AKT通路，從而促使纖維細胞外基質的積累和癌前基因的表達[36]。研究[37]發現，GNMT是甲基轉移的主要調節劑，可抑制甲基化的異常啟動子，從而阻止原發性腫瘤的發生，miRNA-873-5p作為GNMT的轉錄后抑制劑，介導整體表觀基因組學改變并促進肝纖維化，同時抗miRNA-873-5p降低STAT3的激活，從而抑制HSC的活化，因此在阻斷HCC癌前病變進程中具有重要作用(圖1)。

2.2.2 抑制HSC活化的miRNA HSC活化和肝臟炎癥反應主要依賴于NF-κB/Bambi信號傳導通路的激活，IL-1受體相關激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)和TNF受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)是NF-κB/Bambi信號傳導通路的激動劑。研究[38]發現miRNA-146a-5p過表達可特異性抑制HSC活化通路相關的受體激酶與受體因子的激活，從而抑制HSC活化和增殖，減少細胞外基質的沉積，降低肝纖維化的發生與細胞因子的異常分泌，進而延緩癌前病變的進展。

TGFβ通路也可參與抗纖維化調節。Wang等[39]發現miRNA-130a-3p靶向作用于tGfBr1、tGfBr2，從而抑制Smad2 和Smad3磷酸化，阻斷TGFβ信號通路從而抑制HSC活化，使HSC活化數量與增殖的標志物α-SMA表達水平下調。鋅指蛋白3是肝癌癌前病變中重要的促纖維化基因，miRNA-378a-3p[40]可靶向抑制NF-κB信號通路的Smo下游鋅指蛋白3基因的表達，從而抑制HSC的活化。同時，研究[41]證實wnt10a是wnt/β-catenin通路的靶點之一，miRNA-378a-3p過表達可使Wnt/β-catenin途徑失活，從而抑制HSC的活化與增殖、α-SMA及膠原的表達。

HSC的活化過程中與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。TLR4通過其胞內區的TIRAP結構，與MyD88的C端結構域識別并結合，然后依次募集并活化MyD88下游的接頭蛋白，包括IRAK4、IRAK1、TRAF6和轉化生長因子β激活激酶1(transforming growth factor β-activated kinase-1，TAK1)蛋白，其中，TAK1蛋白既可以激活IKK-NF-κB信號途徑，也可以激活p38-NF-κB信號途徑，均能促使NF-κB磷酸化并激活，進而活化HSC，增加肝纖維化和炎癥反應。研究[42]證實，miRNA-326過表達可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，從而抑制HSC活化，降低癌前相關蛋白的表達水平，增加細胞凋亡。

Kupffer細胞是位于肝竇中的特殊巨噬細胞，活化的M2型Kupffer細胞分泌TGFβ，有效的激活HSC并維持其活性[43]。研究[44]表明，miRNA-155可通過靶向抑制IL-13受體α1來抑制Kupffer細胞向M2型極化，從而減少TGFβ的分泌，除此之外，miRNA-19a-3p通過靶向抑制Far-1而抑制其下游原癌基因Fos，進而抑制M2型Kupffer細胞的極化，減少細胞因子的分泌進而抑制HSC活化[45]。

雙熒光素酶報告分析表明[46]，miRNA-185通過直接靶向RHEB和RICTOR的3′UTR降解其mRNA，進而阻斷Smad信號與TGFβ的轉換，下調α-SMA、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等纖維化相關基因的表達，從而抑制HSC的激活。

研究[47]發現,miRNA-340可以通過抑制SPP1基因進而抑制LX-2細胞活化、降低細胞外基質沉積和增殖,抑制TGFβ1/Smad信號通路激活從而抑制HSC活化,進而影響肝癌癌前病變發生和發展的進程(圖2)。

3 小結

肝癌癌前病變的發生與HSC活化密切相關。在肝細胞受損的基礎上，HSC活化并釋放大量異常信號因子，一方面干擾損傷肝細胞再生修復而發生基因變異，從而促進HCC癌前病變的啟動進程，在變異基因不斷蓄積之下遺傳給子代細胞，并穩定表達，促使肝癌癌前病變細胞的形成；另一方面，大量異常信號因子調控信號通路傳導，加劇炎癥微環境的形成，促進肝癌癌前病變細胞惡變為腫瘤細胞，并發生擴散，遷移與增長。而miRNA通過與mRNA的3′UTR區結合在轉錄后水平調節靶基因，干預HSC相關細胞因子的分泌或蛋白基因的表達，影響炎性微環境成分，進而發揮調節HSC活化，影響肝癌癌前病變惡性轉變的作用。基于miRNA調控HSC活化干預肝癌癌前病變惡變，將成為肝癌防治工作的新思路和新靶點。