藁本內酯通過改善骨骼肌糖利用提高老年小鼠運動能力

杜旌暢 向長貞 張紅梅 雷連曼

衰老是人必需面對的自然演進過程。隨著年齡增長，機體出現一系列漸進性的衰退。骨骼肌是人體最先出現衰老的組織［1］，表現為肌肉力量減退、恢復時間延長等。延緩老年人肌肉功能的降低，對緩解人體衰老有積極意義。藁本內酯在傘形科植物中含量豐富，是中國傳統藥材當歸、川芎的重要有效成分。藁本內酯具有多樣的藥理作用。課題組前期研究發現，藁本內酯對模擬缺血環境的血管內皮細胞有明顯的保護作用［2］。另有研究證實，藁本內酯能夠抑制細胞炎癥，對抗心肌組織缺氧損傷［3］。目前，藁本內酯對衰老肌肉組織的作用尚缺乏報道。本研究采用小鼠爬桿和負重游泳模型，結合檢測肌肉組織相關因子的表達，評價藁本內酯對衰老小鼠肌肉功能及糖合成、代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康昆明種小鼠18只，雄性，12月齡，體質量（40±5）g；由成都達碩實驗動物有限公司提供。實驗動物常規飼養于24℃恒溫動物房中，光照∶黑暗=14∶10，經1周適應性喂養后進行實驗。

1.2 藥品與試劑 藁本內酯（成都曼思特生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物有限公司）；乳酸測試盒（南京建成生物有限公司）；總蛋白定量測定試劑盒（南京建成生物有限公司）；糖原試劑盒（Solarbio）；Anti-GSK-3β蛋白一抗（Cell Signaling Technology）；Anti-GSK3 beta（phosphor S9）蛋白一抗（Abcam）；β-Actin（北京博奧森）；兔二抗（Cell Signaling Technology）；硫酸、甲醇為分析純（成都科龍化工）。

1.3 儀器 高通量電泳系統及轉印槽（美國Bio-Rad）；凝膠化學發光檢測儀（美國Bio-Rad）；全波長酶標儀（美國Biotek）；微量勻漿儀（美國 Thermo）；離心機（美國 Thermo），純水儀（美國 Thermo）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與給藥：18只小鼠隨機均等分為對照組（B組）、藁本內酯每日給藥組（LE組）、藁本內酯間日給藥組（LD組）3組。藁本內酯使用生理鹽水稀釋至2 mg/mL。B組每日灌胃生理鹽水0.3 mL，LE組每日50 mg/kg灌胃藁本內酯，LD組單日50 mg/kg灌胃藁本內酯、雙日灌胃生理鹽水0.3 mL。所有動物每日灌胃1次，共給藥14 d；完成后，于第15天進行爬桿實驗，第16天進行力竭游泳實驗，第17天取組織進行相關因子的檢測。

1.4.2 爬桿實驗：將小鼠放在長50 cm垂直懸空的光滑玻璃棒上端，使小鼠肌肉一直處于緊張狀態，記錄小鼠在玻璃棒停留至滑落的時間，累計測量3次，記錄每只小鼠爬桿總時間。

1.4.3 力竭游泳實驗：小鼠尾根部負荷5%體質量的鉛皮塊，置小鼠在水箱中游泳。水箱大小為400 mm×600 mm×400 mm，水深（35±1）cm，水溫（25±2）℃。以小鼠頭部沉入水底10 s不能浮出水面記為體力耗竭，記錄每只小鼠力竭游泳時間。

1.4.4 組織獲?。盒∈笥诘?7天進行非負重游泳30 min，休息60 min后處死。股動脈取血處死小鼠，同時收集動脈血約1000 μL，4℃靜置30 min，離心機3000 r/min離心10 min后取上清備用；迅速取出動物腓腸肌組織約0.3 g于1 mL生理鹽水中，微量勻漿儀中勻漿，進行后續因子的測定。

1.4.4.1 血清中乳酸、LDH含量測定：取適量血清使用生理鹽水稀釋后，嚴格按照試劑盒步驟操作，采用比色法檢測血清乳酸、LDH水平。

1.4.4.2 肌肉組織中糖原及總蛋白含量測定：取適量組織勻漿液，嚴格按照試劑盒步驟操作，采用比色法檢測肌肉組織中糖原水平，并計算單位體積總蛋白含量。

1.4.4.3 肌肉組織中糖原合成激酶-3β（GSK-3β）及其磷酸化（p-GSK-3β）水平測定：采用Western blot法檢測組織中GSK-3β及p-GSK-3β水平，以β-Actin為內參計算相對含量。按照western蛋白提取試劑盒說明書提取肌肉組織蛋白后分裝保存在-80℃的冰箱待用。將肌肉組織蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜60 min，封閉2 h，加入GSK-3β及其磷酸化蛋白一抗，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標記的兔抗鼠Ig G（1∶3000），孵育，ECL顯影，曝光。采用 Quantity One軟件進行灰度分析，GSK-3β與內參β-Actin灰度的比值即為GSK-3β的相對含量，以p-GSK-3β與GSK-3β灰度的比值即為GSK-3β的相對磷酸化水平。

1.5 統計學方法 數據采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藁本內酯對小鼠爬桿時間及力竭游泳時間的影響 結果顯示，與B組比較，LE組與LD組小鼠的爬桿時間、力竭游泳時間均顯著延長（P＜0.05），2種給藥方式之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 藁本內酯對小鼠爬桿及力竭游泳時間的影響（±s，s，n=6）

表1 藁本內酯對小鼠爬桿及力竭游泳時間的影響（±s，s，n=6）

注：與B組比較，*P<0.05

組別 爬桿時間 力竭游泳時間B 組 63.17±10.42 194.0±32.92 LE 組 84.50±13.72* 296.7±44.36*LD 組 81.83±11.75* 267.3±29.68*

2.2 藁本內酯對小鼠血清中乳酸與LDH含量的影響 與B組比較，LE組與LD組小鼠血清中的乳酸與LDH含量均顯著降低（P＜0.05）；與LD組相比，LE組小鼠血清中的乳酸與LDH含量也均顯著降低（P＜0.05）。見表 2。

表2 藁本內酯對小鼠血清中乳酸、LDH含量的影響（±s，n=6）

表2 藁本內酯對小鼠血清中乳酸、LDH含量的影響（±s，n=6）

注：與B組比較，*P<0.05；與LE組比較，△P<0.05

組別 乳酸（mmol/L） LDH（U/L）B 組 515.2±19.60 615.1±60.19 LE 組 374.0±19.08* 354.7±52.37*LD 組 411.3±26.53*△ 477.9±39.99*△

2.3 藁本內酯對小鼠肌肉組織中糖原、GSK-3β及其磷酸化水平的影響 與對照組相比，LE組與LD組小鼠組織中糖原含量均顯著升高（P＜0.05），而2種給藥方式之間差異無統計學意義，見表3。3組GSK-3β的總量差異無統計學意義（P＞0.05），但LE組與LD組GSK-3β磷酸化水平較B組顯著增高（P＜0.05），且與LD組相比，LE組GSK-3β的磷酸化水平更高（P＜0.05）。見表 3，圖 1。

表3 藁本內酯對小鼠血清糖原含量的影響（±s，n=6）

表3 藁本內酯對小鼠血清糖原含量的影響（±s，n=6）

注：與B組比較，*P<0.05

組別 糖原含量B 組 0.0682±0.01459 LE組LD組0.1499±0.02235*0.1251±0.01225*

圖1 藁本內酯對小鼠肌肉組織中GSK-3β及其磷酸化水平的影響（±s，n=3）

3 討論

骨骼肌功能退化是衰老的重要表現，老年人衰老不僅表現為骨骼肌質量下降，肌肉耐力、爆發力等也會明顯退化。糖的利用能力對骨骼肌功能有重要影響，隨著年齡增長，骨骼肌對于糖的利用能力也在降低。研究發現，衰老抑制了骨骼肌表面葡萄糖轉運蛋白mRNA的轉錄，提示其對細胞攝取葡萄糖有抑制作用［4］。進一步研究發現，骨骼肌利用葡萄糖能力的降低與細胞胰島素抵抗（IR）狀態有直接聯系［5］。改善骨骼肌對糖的利用，對于改善衰老肌肉的功能有巨大幫助。

藁本內酯具有廣泛的生物學效應，可對抗缺血損傷、舒張平滑肌、抑制神經炎癥［6-8］。本研究通過爬桿試驗和力竭游泳實驗，探討不同給藥頻率下藁本內酯對老年小鼠力量與耐力的影響。結果顯示，2種藁本內酯給藥頻率均能夠顯著提升小鼠力量與耐力，不同給藥頻率之間差異無統計學意義。在相關研究中，有文獻報道了藁本內酯對C2C12細胞的凋亡和自噬有抑制作用［9-10］，提示了該藥物對骨骼肌功能的改善作用，而本研究則首次觀察到藁本內酯有明確的提升骨骼肌功能的作用。

在運動情況下，糖原分解產生乳酸，部分進一步氧化為H2O與CO2，未完全氧化的乳酸則進入血液，在運動后會經糖異生途徑重新用于糖原合成。檢測運動后血乳酸與組織中糖原的水平，對于評價骨骼肌糖異生能力有重要意義。本研究證實，經藁本內酯處理的老年小鼠，運動后血乳酸水平更低，而肌糖原表達更高。這說明藁本內酯的確對骨骼肌的糖異生有促進作用。2種不同給藥頻率組間乳酸水平有差異，而糖原增加并沒有差異，這可能與藁本內酯能夠舒張血管有關［11］，局部組織更好的血供有利于乳酸的迅速擴散，使得機體能夠以更高的效率清除乳酸。結合GSK-3β檢測結果可以發現，不同給藥頻率下其磷酸化程度均出現了明顯的升高。因此，藁本內酯對乳酸的降低可能是加快乳酸擴散與強化糖異生共同作用的結果，因此其變化幅度大于糖原的變化。

最后，本研究檢測了藁本內酯對運動老年小鼠血LDH的影響，LDH可用于反映運動引起的組織損傷。在既往研究中，已經觀察到藁本內酯對缺血細胞的膜穩定作用［12］，本研究再次在不同模型下驗證了藁本內酯對細胞的保護作用。

本研究結果顯示，藁本內酯能夠提高老年小鼠的力量與耐力，加快乳酸代謝、增強肌糖原合成、抑制力竭運動引起的血LDH升高，改善老年小鼠骨骼肌功能。該作用在藁本內酯中首次發現，拓寬了其生物學用途，也為進一步使用富含藁本內酯的藥物改善老年人骨骼肌功能提供了一定依據。