撫順地區豬鏈球菌病病原分離和鑒定

楊春艷

（撫順市農業特產學校，遼寧 撫順 113123）

豬鏈球菌的血清型有35 個，還有一些菌株的血清型沒有被定型[1-2]。其中，豬鏈球菌2 型和1型，是豬的重要致病菌，可感染給人，是集約化養豬場的常見病，是嚴重危害養豬業的細菌性傳染病[3-4]。為了檢出撫順地區豬鏈球菌病流行菌株的血清類型、耐藥性等特點，方便臨床更好的采取預防措施。

本研究應用傳統的實驗室檢驗方法，在撫順地區發生豬鏈球菌病的31 個鄉鎮，采取典型發病豬的病料，進行了分離培養、血清型鑒定、藥敏試驗、毒力測定試驗，為該病的防治提供有力的數據資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源

撫順地區不同豬場發生典型豬鏈球菌病的20頭死亡豬，在無菌條件下采取病豬心、脾、肝、淋巴結、關節液等組織樣本，共30份。

1.2 主要試劑

HM47 鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒，廣東環凱微生物科技有限公司生產。參考菌株ATCC35246，馬腺疫鏈球菌獸疫亞種，鏈球菌C群，2 型豬鏈球菌標準菌株，購自中國藥品生物制品鑒定所，其余菌株自行分離。070200 豬鏈球菌生化鑒定盒，廣東環凱微生物科技有限公司生產。

1.3 試驗動物

ICR 小鼠40 只，規格：20～25 g·只-1，購自錦州醫科大學實驗動物中心

2 試驗方法

2.1 細菌形態學觀察

采取病豬心，脾、肝、淋巴結30 份。進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察結果。

2.2 病原菌的分離

將病料接種在普通培養基上和血液平板上，37 ℃，24 h 培養后，挑取可疑菌落，革蘭氏染色，鏡檢。鏡檢后如果看到成鏈狀排列的G+菌，將可疑菌落接種在血平板上做純培養后，觀察。將純培養的菌落接種在血清馬丁肉湯中增菌培養，37 ℃培養24 h，觀察其生長表現。然后接種血清肉湯純化后，4 ℃冷藏備用。

2.3 生化實驗

豬鏈球菌生化鑒定盒使用方法：從血瓊脂平板上挑取可疑的溶血性菌落，放在0.85%生理鹽水中，與0.5 McFarlang比濁管進行比濁，將細菌懸液體制備成0.5 McFarlang，備用。再用一次性吸管吸取2滴制備好的菌懸液體，分別加入到微量生化管中，蓋上西林瓶塞子，置于瓶架上，37 ℃恒溫箱中培養后，觀察結果。

2.4 血清分型

乳膠凝集實驗過程：所有的試劑在使用前要達到室溫。用10 mL 蒸餾水把酶試劑溶解后，將酶提取液分裝于試管中，每管0.4 mL。用滅菌接種環挑取實驗室分離的菌株加入到酶溶液中，制成菌懸液。將試管置于37 ℃水浴鍋中10～15 min，使菌液混合均勻。乳膠試劑充分搖勻，分別滴入6個反應環內1滴。如果存在對應型的鏈球菌會出現肉眼可見的顆粒凝集，為陽性。如果乳膠試劑仍然光滑，說明是陰性，無凝集或者凝集微弱。同時做AG群陽性對照、生理鹽水空白對照和ATCD35246對照。

2.5 動物致病性實驗

將40 只試驗小鼠（體重20～25 g）分為試驗組36只，共9組，每組4只，對照組4只小鼠。9株分離菌株在血清肉湯中培養12 h，取其培養物，經過離心，吸取菌體，試驗組每只小鼠注射0.2 mL。對照組每只小鼠腹腔注射0.2 mL 血清肉湯。注射后小鼠隔離飼養，記錄其發病情況。死亡小鼠立即解剖，取死亡小鼠的肝臟涂片、革蘭氏染色，鏡檢。同時要在血液瓊脂平板上做分離培養。

2.6 藥敏實驗

將菌株在馬丁瓊脂斜面培養基上接種，培養24 h，做含菌數為1.5×106個·mL-1的稀釋，用滅菌棉簽蘸取稀釋液在平板上均勻涂抹，蓋蓋放置5 min，用鑷子將藥敏片放在平板上輕壓實，每個平板上放3 個藥敏片，每個藥敏片距離25 mm，紙片和平板邊緣不小于15 mm，37 ℃18 h后觀察[5]。

3 試驗結果

3.1 細菌形態學觀察結果

病料經過革蘭氏染色，陽性，病料中多為圓形或橢圓形的單個散在或成雙排列，少數是鏈狀出現的球菌，在血液平板上和肉湯培養基中的菌落，鏡檢可以看到8～15個球菌鏈。

3.2 細菌分離培養結果

本細菌在有氧和無氧的條件下均能生長繁殖，在普通培養基上不愛生長。在含有葡萄糖、血液的培養基中生長很好，可以見到露珠樣的菌落，邊緣整齊，光滑黏稠，有α或者是β溶血環。在馬丁肉湯中，底部有沉淀。在血清肉湯中，先使肉湯混濁，后在試管底部有顆粒沉淀，無菌膜，上清液透明。

3.3 生化實驗結果

在37 ℃條件下能夠生長，在10 ℃、15 ℃條件下不能生長。在40%和10%膽汁管中，呈陽性。過氧化氫酶試驗陰性。淀粉水解試驗（+）。甘油試驗（-）。水解七葉苷（+）。能夠發酵葡萄糖、麥芽糖等糖，能夠產酸。能多數發酵甘露醇等糖，少數不發酵，產酸，不能產生靛基質。V-P 試驗陰性，甲基紅試驗（M.R）陽性。試驗結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的細菌為豬鏈球菌。

3.4 細菌血清分型結果

豬鏈球菌血清型檢驗結果見表1。乳膠凝集試驗結果：分離菌株與診斷液反應結果為陰性，ATCD35246 與C 群診斷液反應為陽性，A-G 群抗原對照為陽性。玻片凝集試驗結果：分離菌株與2型血清呈陽性反應，ATCC35246 為陰性。血清試驗結果為病料的病原屬于R群豬鏈球菌2型。

3.5 動物致病性試驗結果

致病性試驗結果見表2。腹腔接種分離菌株的小鼠5 h 后開始死亡，15 h 全部死亡。死后剖檢可見胸腔充滿積液，膀胱充血，肝、腎、脾水腫，心臟血液和胸腔積液涂片，革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察可見散在的或成鏈狀的G+球菌。對照組沒有任何異常。采取死亡小鼠的肝、肺等發病組織進行細菌分離培養鑒定，分離菌株的培養特性和生化試驗結果與供毒細菌一致。

表2 致病性試驗結果

3.6 藥敏實驗結果

分離菌株對氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、頭孢噻吩、頭孢拉啶、克林霉素、氟甲砜霉素、強力霉素高敏。羅紅霉素、氯霉素、環丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星中度敏感。慶大霉素、新霉素、青霉素不敏感。

4 討 論

豬鏈球菌2 型的死亡率和感染率都比較高，為了能更快的控制豬鏈球菌2型引起的感染，從病死豬病料中分離鑒定出豬鏈球菌2型，是臨床診治的重要病原學依據。從藥敏實驗結果看，平時認為比較高效的藥物其敏感性卻很低，多表現耐藥，很多地區藥敏試驗結果都有較大的差異，這和臨床上濫用抗生素有極大的關系。所以對于豬鏈球菌病的治療，早期可以聯合用藥，最好在藥敏試驗的基礎上再選用敏感性較高的藥物治療。采取綜合防治措施，加強飼養管理，適當的對癥治療[6]。

5 小 結

本研究從撫順地區的養豬場中收集患有豬鏈球菌病的組織病料，通過分離培養得到9 株細菌株，生化實驗確定這些菌株和豬鏈球菌性質相似，血清型實驗證明了只有1 個血清型：2 型。小鼠致病性實驗表明，這些菌株致病型強，死亡率為100%。藥敏實驗中，撫順地區分離的豬鏈球菌對氟甲砜霉素最為敏感，可以作為治療豬鏈球菌病的藥物。另外，分離菌株對氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、頭孢噻吩、頭孢拉啶、克林霉素、強力霉素高敏。在實際臨床中考慮到用藥成本，采取綜合治療措施，在使用疫苗的基礎上，發病豬只用少量的敏感藥物作為輔助治療，同時加強飼養管理，對鏈球菌病的防治能取得比較好的效果。