自噬在硼替佐米誘導的腎癌細胞凋亡中作用的研究

陳福東，肖 帥，張鴻雁，畢林濤

(吉林大學中日聯誼醫院 1.手術室；2.核醫學科；3.腫瘤血液科，吉林 長春130033)

據統計資料顯示，我國腎癌發病率呈逐年上升趨勢，至2008年已躍居我國男性惡性腫瘤發病率第10位[1]。腎癌的傳統治療方法效果并不理想。有文獻表明[2]，基于腎細胞癌的分子水平的治療策略顯示出潛在的優勢。近來的研究表明，自噬在抗腫瘤藥物引起的細胞凋亡中發揮重要的作用[3]。本研究利用體外培養人腎癌ACHN細胞，探討自噬在硼替佐米誘導的腎癌細胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎癌ACHN細胞系購于中國科學院上海生命科學研究院；G250考馬斯亮藍、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基胺基甲烷(Tris-Base)與四甲基二乙胺(TEMED)購于美國Sigma公司；HEPES緩沖液、L-谷氨酰胺購于美國Amresco公司；標準胎牛血清(FBS)購于江蘇晶美生物科技有限公司；Caspase-3、LC3購于Santa Cruz公司；胰蛋白酶、辣根過氧化物酶羊抗鼠二抗購于北京鼎國生物技術有限公司；噻唑藍(MTT)購于北京賽馳生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1藥物、試劑配置 配置1640完全培養液、D-Hanks液、PBS液、0.25%胰蛋白酶溶液、電泳緩沖液、電泳轉移緩沖液、12%分離膠、濃縮膠。

1.2.2細胞培養 a)細胞復蘇;b)細胞培養及傳代;c)細胞凍存。

1.2.3MTT檢測細胞增殖率 酶聯免疫檢測儀，波長490 nm檢測，增殖率=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.2.4Western blotting 檢測硼替佐米對人腎癌ACHN細胞凋亡相關蛋白cleaved caspase-3及自噬相關蛋白LC3表達水平的影響

1.3 統計學處理

所有數據采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，各個樣本均數間的統計學差異采用t檢驗進行分析，采用方差分析比較不同組間的均數差異，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 硼替佐米對ACHN細胞增殖抑制率影響

分別應用0 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、50 nM硼替佐米處理ACHN細胞24 h后，MTT檢測結果(圖 1)表明，硼替佐米呈劑量依賴性地抑制細胞增殖。后續實驗選用20 nM濃度進行單獨以及聯合用藥。

圖1 硼替佐米對ACHN細胞24 小時抑制率

2.2 硼替佐米對ACHN細胞凋亡相關蛋白cleaved caspase-3表達水平的影響

分別應用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米處理ACHN細胞24h，Western Blotting檢測凋亡相關蛋白cleaved caspase-3表達水平(圖2 )。與對照組相比，硼替佐米可以明顯地增加ACHN細胞凋亡。

圖2 硼替佐米對caspase-3蛋白的影響

2.3 硼替佐米對ACHN細胞自噬相關蛋LC3表達水平的影響

分別應用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米處理ACHN細胞24 h，Western Blotting檢測自噬相關蛋白LC3表達水平(圖 3)，硼替佐米明顯增加了ACHN細胞的自噬。

圖3 硼替佐米對ACHN細胞LC3蛋白的影響

2.4 自噬抑制劑3-MA聯合硼替佐米對ACHN細胞增殖及對凋亡相關蛋白cleaved caspase 3 的表達水平的影響

聯用3-MA可以進一步抑制ACHN細胞增殖(圖4)，促進ACHN細胞凋亡(圖5)。

3 討論

硼替佐米為硼酸肽類化合物,它可選擇性作用到26S蛋白酶體,通過可逆性地抑制蛋白酶體活性而抑制多種蛋白的降解過程,從而影響多種細胞功能，如細胞周期,誘導細胞凋亡等，表現出了良好的抗腫瘤活性。大多數的抗癌藥都能引起其敏感細胞發生凋亡，而凋亡過程的發生需要Caspases的參與。Caspases家族是細胞凋亡過程中的效應蛋白，通過蛋白酶水解，活化的Caspases可以進行細胞內信號轉導[4]。而本實驗中檢測的Caspase-3則是這個家族中最重要的死亡執行者，它廣泛分布在各類細胞中，主要以無活性的酶原形式存在，而活化的Caspase-3則能夠促進凋亡信號的轉導。在本實驗中，硼替佐米明顯增強了Caspase-3在腎癌細胞中的表達，促進腎癌細胞發生凋亡。

自噬是細胞通過各種途徑在自噬溶酶體內進行自我消化，分解細胞內受損的細胞器、蛋白質等。基礎水平的自噬幫助細胞維持穩態，實現自我更新等。當受到較嚴重損傷無法自我修復，細胞就會發生自噬性死亡[5]。細胞自噬過程分四個階段：啟動、延長、成熟和降解。自噬相關蛋白Beclin1在啟動階段發揮重要作用，LC3主要在延長階段發揮作用。在自噬過程中，定位于細胞質中的P62與經泛素化的蛋白結合，P62蛋白再與LC3-II形成復合物，在溶酶體內被降解，以至于P62蛋白在細胞自噬過程中不斷被消耗[6,7]。本實驗結果顯示，硼替佐米促進腎癌細胞的自噬，明顯降低了P62的表達水平。

圖4 3-MA聯合硼替佐米對ACHN細胞增殖影響

圖5 3-MA聯合硼替佐米對ACHN細胞凋亡的影響

據報道，許多抗癌劑誘導自噬[8-10]，導致自噬細胞死亡可能是這些藥物殺死腫瘤細胞的重要機制；然而，最新文獻顯示雷帕霉素誘導的自噬可以保護各種腫瘤細胞系對一般凋亡刺激誘導的凋亡。自噬是否真的是一個重要的細胞死亡機制仍有高度爭議，因為它也有可能是細胞試圖生存的機制。對于自噬與凋亡的交互作用，可以分三類即合作關系、對抗關系與推動關系[11]。合作關系即自噬和凋亡協同作用，或通過互補機制共同導致細胞死亡；對抗關系即自噬與凋亡在引起細胞的過程中起著截然相反的作用，自噬不但不引起細胞死亡，反而在凋亡過程中維持癌癥細胞存活；推動關系中自噬雖然也是程序性細胞死亡，但并沒有直接參與細胞死亡，而是為細胞凋亡提供營養支持。例如細胞遭受營養剝奪時，自噬水平的上調可以維持胞內ATP水平，使得內磷脂酰絲氨酸得以向胞外暴露釋放出凋亡信號，如果自噬受到抑制，這類ATP依賴性特征性凋亡發生也會減少，但對其它凋亡反應并無影響[12]。本研究結果表明抑制自噬可以增強硼替佐米誘導的ACHN細胞凋亡作用，這提示自噬可能在ACHN細胞凋亡過程中發揮促進其存活的作用，抑制自噬增強了硼替佐米抗腫瘤作用。