自噬在硼替佐米誘導(dǎo)的腎癌細胞凋亡中作用的研究

陳福東，肖 帥，張鴻雁，畢林濤

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.手術(shù)室；2.核醫(yī)學(xué)科；3.腫瘤血液科，吉林 長春130033)

據(jù)統(tǒng)計資料顯示，我國腎癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，至2008年已躍居我國男性惡性腫瘤發(fā)病率第10位[1]。腎癌的傳統(tǒng)治療方法效果并不理想。有文獻表明[2]，基于腎細胞癌的分子水平的治療策略顯示出潛在的優(yōu)勢。近來的研究表明，自噬在抗腫瘤藥物引起的細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[3]。本研究利用體外培養(yǎng)人腎癌ACHN細胞，探討自噬在硼替佐米誘導(dǎo)的腎癌細胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎癌ACHN細胞系購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；G250考馬斯亮藍、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基胺基甲烷(Tris-Base)與四甲基二乙胺(TEMED)購于美國Sigma公司；HEPES緩沖液、L-谷氨酰胺購于美國Amresco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)購于江蘇晶美生物科技有限公司；Caspase-3、LC3購于Santa Cruz公司；胰蛋白酶、辣根過氧化物酶羊抗鼠二抗購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(MTT)購于北京賽馳生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1藥物、試劑配置 配置1640完全培養(yǎng)液、D-Hanks液、PBS液、0.25%胰蛋白酶溶液、電泳緩沖液、電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、12%分離膠、濃縮膠。

1.2.2細胞培養(yǎng) a)細胞復(fù)蘇;b)細胞培養(yǎng)及傳代;c)細胞凍存。

1.2.3MTT檢測細胞增殖率 酶聯(lián)免疫檢測儀，波長490 nm檢測，增殖率=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.2.4Western blotting 檢測硼替佐米對人腎癌ACHN細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平的影響

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，各個樣本均數(shù)間的統(tǒng)計學(xué)差異采用t檢驗進行分析，采用方差分析比較不同組間的均數(shù)差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硼替佐米對ACHN細胞增殖抑制率影響

分別應(yīng)用0 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、50 nM硼替佐米處理ACHN細胞24 h后，MTT檢測結(jié)果(圖 1)表明，硼替佐米呈劑量依賴性地抑制細胞增殖。后續(xù)實驗選用20 nM濃度進行單獨以及聯(lián)合用藥。

圖1 硼替佐米對ACHN細胞24 小時抑制率

2.2 硼替佐米對ACHN細胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達水平的影響

分別應(yīng)用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米處理ACHN細胞24h，Western Blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達水平(圖2 )。與對照組相比，硼替佐米可以明顯地增加ACHN細胞凋亡。

圖2 硼替佐米對caspase-3蛋白的影響

2.3 硼替佐米對ACHN細胞自噬相關(guān)蛋LC3表達水平的影響

分別應(yīng)用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米處理ACHN細胞24 h，Western Blotting檢測自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平(圖 3)，硼替佐米明顯增加了ACHN細胞的自噬。

圖3 硼替佐米對ACHN細胞LC3蛋白的影響

2.4 自噬抑制劑3-MA聯(lián)合硼替佐米對ACHN細胞增殖及對凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase 3 的表達水平的影響

聯(lián)用3-MA可以進一步抑制ACHN細胞增殖(圖4)，促進ACHN細胞凋亡(圖5)。

3 討論

硼替佐米為硼酸肽類化合物,它可選擇性作用到26S蛋白酶體,通過可逆性地抑制蛋白酶體活性而抑制多種蛋白的降解過程,從而影響多種細胞功能，如細胞周期,誘導(dǎo)細胞凋亡等，表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。大多數(shù)的抗癌藥都能引起其敏感細胞發(fā)生凋亡，而凋亡過程的發(fā)生需要Caspases的參與。Caspases家族是細胞凋亡過程中的效應(yīng)蛋白，通過蛋白酶水解，活化的Caspases可以進行細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。而本實驗中檢測的Caspase-3則是這個家族中最重要的死亡執(zhí)行者，它廣泛分布在各類細胞中，主要以無活性的酶原形式存在，而活化的Caspase-3則能夠促進凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本實驗中，硼替佐米明顯增強了Caspase-3在腎癌細胞中的表達，促進腎癌細胞發(fā)生凋亡。

自噬是細胞通過各種途徑在自噬溶酶體內(nèi)進行自我消化，分解細胞內(nèi)受損的細胞器、蛋白質(zhì)等。基礎(chǔ)水平的自噬幫助細胞維持穩(wěn)態(tài)，實現(xiàn)自我更新等。當(dāng)受到較嚴(yán)重?fù)p傷無法自我修復(fù)，細胞就會發(fā)生自噬性死亡[5]。細胞自噬過程分四個階段：啟動、延長、成熟和降解。自噬相關(guān)蛋白Beclin1在啟動階段發(fā)揮重要作用，LC3主要在延長階段發(fā)揮作用。在自噬過程中，定位于細胞質(zhì)中的P62與經(jīng)泛素化的蛋白結(jié)合，P62蛋白再與LC3-II形成復(fù)合物，在溶酶體內(nèi)被降解，以至于P62蛋白在細胞自噬過程中不斷被消耗[6,7]。本實驗結(jié)果顯示，硼替佐米促進腎癌細胞的自噬，明顯降低了P62的表達水平。

圖4 3-MA聯(lián)合硼替佐米對ACHN細胞增殖影響

圖5 3-MA聯(lián)合硼替佐米對ACHN細胞凋亡的影響

據(jù)報道，許多抗癌劑誘導(dǎo)自噬[8-10]，導(dǎo)致自噬細胞死亡可能是這些藥物殺死腫瘤細胞的重要機制；然而，最新文獻顯示雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬可以保護各種腫瘤細胞系對一般凋亡刺激誘導(dǎo)的凋亡。自噬是否真的是一個重要的細胞死亡機制仍有高度爭議，因為它也有可能是細胞試圖生存的機制。對于自噬與凋亡的交互作用，可以分三類即合作關(guān)系、對抗關(guān)系與推動關(guān)系[11]。合作關(guān)系即自噬和凋亡協(xié)同作用，或通過互補機制共同導(dǎo)致細胞死亡；對抗關(guān)系即自噬與凋亡在引起細胞的過程中起著截然相反的作用，自噬不但不引起細胞死亡，反而在凋亡過程中維持癌癥細胞存活；推動關(guān)系中自噬雖然也是程序性細胞死亡，但并沒有直接參與細胞死亡，而是為細胞凋亡提供營養(yǎng)支持。例如細胞遭受營養(yǎng)剝奪時，自噬水平的上調(diào)可以維持胞內(nèi)ATP水平，使得內(nèi)磷脂酰絲氨酸得以向胞外暴露釋放出凋亡信號，如果自噬受到抑制，這類ATP依賴性特征性凋亡發(fā)生也會減少，但對其它凋亡反應(yīng)并無影響[12]。本研究結(jié)果表明抑制自噬可以增強硼替佐米誘導(dǎo)的ACHN細胞凋亡作用，這提示自噬可能在ACHN細胞凋亡過程中發(fā)揮促進其存活的作用，抑制自噬增強了硼替佐米抗腫瘤作用。