siRNA介導的ADAM17基因沉默對前列癌PC3細胞增殖和凋亡的影響

李 雪，馮樹強，李然偉，田文杰，姜 爽，楊 賀

(吉林大學第二醫院 泌尿外科，吉林 長春130041)

據流行病學資料統計，前列腺癌(prostate cancer,PCa)是危及男性健康的主要疾病，尤其是西方國家男性發病率最高的惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌[1]。近年來隨著人口老齡化到來和高齡人群增多，我國PCa的發病率和死亡率也呈逐年上升趨勢[2]。早期腫瘤可以通過外科手術、放射治療達到臨床治愈，但晚期腫瘤則需要采用激素治療。去勢治療雖然有效，然而絕大多數患者在治療過程中因轉歸為雄激素非依賴性而最終需要化療，但副作用大且療效差[3]。因此人們開始探索新的分子靶向用藥的基因治療。隨者研究的深入，發現ADAM17的異常表達與PCa細胞增殖和侵襲等生物學功能和效應密切相關，在PCa的發生發展和轉移的全過程中扮演著極其重要的角色，也發揮著十分關鍵的作用[4，5]。鑒子RNA干擾技木被普遍認為能從源頭上使某些致癌基因“沉默”，從而抑制腫瘤細胞增殖及轉移[6]。故我們應用RNA干擾(RNAi)技術，設計針對ADAM17-siRNA表達載體，轉染PC3細胞后觀察ADAM17在PCa中表達的變化，并探討其變化對PC3細胞增殖和凋亡的影響，旨在為提高臨床PCa的治療水平提供實驗依據和新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料人前列腺癌PC3細胞株購自ATCC公司， PGCsi-U6/Neo/GFP購于上海吉凱基因化學公司，Trizol試劑為 Gibco公司產品，限制性內切酶和工具酶購于大連 Takara公司，RPMI1640培養基,，小牛血清為Hgclone公司產品，轉染試劑 LipofetamineTM2000購于 Invitrogen公司，G418購于 Sigma公司，ADAM17定量檢測試劑盒購于晶美公司，流式細胞儀(FCM)購自美國Clomech公司， 噻唑藍(MTT)購自上海吉凱基因化學公司，原位未端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自北京中山生物公司。

1.2 實驗方法

①shRNA設計和質粒構建：根據shRNA設計原理，設計針對ADAM17 siRNA表達質粒,，另設計一個不含持異性的ADAM17序列的PGC-CONT作為對照(以下稱陰性對照組)。序列編號為：ADAM17意義鏈5′-GATCCAATGGATGTCTATCA-

TTCAAGAGATGATAGACATCCATGAACTTT-

TTTTGGAAA；反義鏈5′-AGCTTTTCCAAAAA-

AAGTTCATGGATGTCTATCATCTCTTGAAT-

GATAGACATCCATGAACTG。

PGC-CONT意義鏈

5′-GATCCAATGGATGTCTATCATTCAAGAG-

ATGATAGACATCCATGAAC TTTTTTTGGA-

AA；反義鏈5′-AGCTTTTCCAAAAAAAGTTCATGGATGTCTATCATCTCTTGAATGATA-

GACATCCATGAACTG。

將互補的意義鏈和反義鏈分別引入HamhI和HindⅢ酶切位點，每對單鏈寡核苷酸片段等量混勻，91℃變性6 min后，75℃退火12 min實時與HamhI和HindⅢ雙酶切線的PGCsi-U6/Neo/GFP質粒鏈接，連接產物分別命名為 PGC-si ADAM17，PGC-CONT。連接產物常規轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，測序正確后提取質粒轉染PC3細胞。

②PC3細胞培養及轉染：PC3細胞培養于含10%小牛血清的不含抗生素的RPM1640培養液中，在37℃，5%CO2培養箱中培養至對數生長期時，按 Lipofetaminetm2000使用說明書要求程序轉染，轉染細胞在500 mg/L的G418壓力下篩選陽性克隆。

③RT-PCR檢測PC3細胞ADAM17的表達；提取PC3細胞總RNA，RT-PCR擴增ADAM17片段，以β- cactin作為內參。ADAM17引物:上游引物5′- CAGAAGGAG GAGGGCAGAAT-3′，下游引物5′- TGGCCTT GGTGAGGTTTGAT-3′，擴增片段256 bp。PCR產物經2%瓊芝糖凝膠電泳分離，于紫外燈下拍照。

④MTT法檢測PC3細胞增殖率：取對數生長期的各組細胞接種于96孔培養板，每組3復孔，每孔細胞數為1×105個，37℃培養48 h后變換培養液，繼續培養72 h，每孔分別加入MTT20 μI，37℃孵育4 h，輕輕吸去上清，加入100 ul DMS0，37℃振蕩降解25 min后，檢測A590值，結果取3孔平均值。

⑤TUNEL法測定PC3細胞凋亡率：在胰酶消化后的各組細胞懸液中滴加 TUNEL反應液37℃濕盒卵育2 h，PBS洗滌3次，滴加過氧化物酶標記的抗地高辛抗體37℃濕盒卵育25 min。DAB顯色，蘇木精復染。以PBS代替 TUNEL反應液作為陰性對照。陽性對照切片經DNA酶I預處理8 min后按 TUNEL法步驟進行染色。結果判定：凋亡細胞的胞核呈棕黃色，每張切片觀察5個視野，每個視野計數200個細胞，計算凋亡細胞所占的百分率(凋亡率)。

⑥FCM檢測PC3細胞周期變化：分別收集上述3組細胞，每組1×106個，胰酶消化制成單細胞懸液，冰PBS洗滌3次后逐滴緩慢加入-20℃預冷的70%乙醇中，4℃固定36 h，PBS洗滌去除固定液，加入核糖核苷酸A重懸細胞，避光染色3 h。FCM檢測各組PC3細胞的周期分布清況。實驗重復3次，用MPIAS-500多媒體彩色病理圖文分折系統對陽性細胞著色的平均灰度進行定量分析結果。

1.3 統計學分析采用SPSS11.5統計軟件對數據進行處理,所有實驗數據均采用均數±標準差表示,以P<0.05為差異有統計學意義，P>0.05為差異無統計學意義。

2 結果

2.1 PGC-si ADAM17表達載體的鑒定及篩選對2個重組質粒進行測序，結果與所設計的ADAM17 siRNA寡核苷酸序列一致，證明PGC-siADAM17及PGC-CONT重組質粒構建成功。采用脂質體法將重組質粒和對照質粒分別轉染PC3細胞，經G418篩選，35 d后獲得陽性細胞克隆。

2.2 ADAM17-siRNA對PC3細胞ADAM17表達的影響各轉染組細胞ADAM17 mRNA表達結果如圖1所示，A圖為RT-PCR產物電泳結果，B圖為所得的比值。與未轉染組比較:載體組的ADAM17 mRNA表達水平下調。這表明ADAM17 siRNA抑制了PC3細胞ADAM17的表達，發揮了特異的RNAi作用。

2.3 MTT法檢測結果若將未轉染組細胞增殖設定為100%，則PGC-CONT及PGC-si ADAM17增殖率分別為91.7%和53.6%，與空質粒PGC-CONT的陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 穩定轉染細胞ADAM17的RT-PCR結果

A:RT-PCR電泳圖(M:marker;1:載體轉染組；2：陰性對照組；3：未轉染組 B:光密度掃描ADAM17/β-actin表達水平比值

*與陰性對照組相比，P<0.01

A(590 mm)

2.4 FCM測定結果未轉染組，陰性對照組和ADAM17 siRNA組G0/G1期細胞所占的比例分別為46.9±0.9%、48.5±1.5% 和59.8±1.4%，與對照比較，ADAM17siRNA組中G0/G1期細胞所占比例明顯增加，S期細胞顯著減少(P<0.05,表1)。

2.5 TUNEL法檢測結果未轉染組，陰性對照組和載體轉染組的瘤細胞凋亡率分別為1.3%、2.8%和12.7%，組間比較差異具有顯著統計學意義(P<0.01，圖3)。

表1 FCM檢測瘤細胞G0/G1期和S期細胞比例

圖3 TUNEL法檢測瘤細胞凋亡率

3 討論

PCa是一個多因素、多壞節、多階段的復雜疾病，RNAi技術本身則可以針對多個基因或者基因族的共有序列來抑制多個基因的表達，從而誘導腫瘤細胞調亡、抑制腫瘤生長[7]。本研究應用RNA干擾技術，針對ADAM17設計了ADAM17 siRNA表達質粒，結果發現其在體外對前列腺癌PC3細胞具有抑制生長并促進凋亡的作用。到目前為止的研究普遍認為，ADAM17 在包括PCa在內的人體多種惡性腫瘤中表達陽性，尤其在PCa中高表達，其表達水平不但與腫瘤的發生發展有關，而且還和遠處轉移以及患者的生存期縮短有關，是一個預后不良和術后復發風險高的指標，它已成為目前研究的熱點癌基因[8.9]。本實驗通過ADAM17 siRNA沉默ADAM17達到了較好的抑制前列腺癌PC3細胞增殖和促進其凋亡的效果。實驗數據結果顯示，PGC-siADAM17的載體轉染組對癌細胞抑制率為53.6%，凋亡率為12.7%，而且是癌細胞大多停滯在GO/GI期，不能向成熟癌細胞遷移、分化。這是我們初步認為以RNA于擾為基礎的靶向ADAM17的基因治療極有可能是提高前列腺癌療效的新的有效方法之一。但由于令人鼓舞的本研究成果只是在單細胞水平上取得的，因而其更確切的實用臨床意義還有待動物實驗和臨床試驗的進一步驗證，本課題組成員將在此基礎上進行更深入的后續研究。希望通過對ADAM17的研究，能夠為明確和厘清腫瘤發生、發展和轉移的機制帶來一定幫助，從而提高前列腺癌患者的臨床療效和治療水平。