靶向血管內皮生長因子受體2的sKDR抑制血管內皮細胞生長和血管生成的研究

鄭紅淑，王秀巖，李然偉，馮樹強，李春艷，徐文翠

(吉林大學第二醫院 泌尿外科，吉林 長春130041)

惡性腫瘤的生長、侵襲和轉移與新生血管形成密切相關，血管形成在腫瘤多個生物學過程中均起到至關重要的作用[1]。近年來抗血管生成是治療腫瘤的研究熱點之一，已被許多研究證明是有效的，已成為癌癥治療不可替代的方法。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成最重要的因子，可通過不同形式的干預，以阻斷腫瘤新生血管形成。抑制腫瘤血管生成的策略包括抑制血管生成因子及其受體的產生，抑制VEGF信號通路，抑制VEGF與其受體之間的結合，抑制VEGF信號的細胞內轉導。VEGF促腫瘤生長和血管形成作用主要與其受體KDR(kinase insert domain receptor，KDR)有關[3]。KDR是一種跨膜蛋白，在正常組織中不表達，但在多種實體腫瘤組織細胞及腫瘤血管內皮細胞均有高表達[4,5]。我們構建了含有KDR胞外VEGF結合區編碼基因和信號肽的真核分泌型表達質粒PQE40-KDR，即可溶性血管內皮生長因子受體sKDR(soluble KDR，sKDR)，通過陽離子及脂質體將其轉染到人臍靜脈內皮細胞HUVEC(Human umbilial vein endothelial cell,HUVEC),觀察其對細胞增殖和血管生成的影響，為尋求更加確實有效的分子靶向用藥的基因治療臨床惡性實體腫瘤的新靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料小鼠抗His標簽單克隆抗體和TA克隆載體pMD19-T Simple Vector購自Qiagen公司；IPTG購自Promega公司；各種限制性內切酶、工具酶及DNA片段回收試劑盒和表達載體pQE40購自TaKaRa公司；NTA-Ni2+瓊脂糖樹脂購自Qiagen公司；重組人VEGF和rhVEGF165購自Peprotech公司；RPMI-1640培養基、小牛血清購自Hyclone公司；TRIzoL試劑購自Gibco公司；轉染試劑LipofetamineTM2000購自Invitrogen公司；G418和酶標儀分別為Sigma和Biorad公司產品。

1.2 實驗方法①獲取KDR胞外可溶性片段的獲得及構建sKDR真核分泌型表達載體：采用膠原酶(Ⅰ型)消化法，在無菌條件下提取新生兒臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。用含有用添加20%小牛血清的RPMI-1640培養液進行培養。取第二代HUVEC，利用TRIzol法提取總RNA，RT-PCR法擴增KDR胞外第1-4個Ig樣結構域cDNA片段。根據人KDR基因的cDNA序列及相應編碼結構域，設計引物序列如下：sense 5’ -GCCTCTGTGGGTTTGCCTAGTGTTTC，下游引物antisen se5’- ATTGGTAAGGATGACAG TGTAATTTC，擴增片段長度在1 149 bp時，利用下述2條引物從重組TA克隆載體上擴增sKDR片段，引物序列：sense 5’-CGGGATCCATGGCCTCTGTGGGT-3’(含BamH Ⅰ酶切位點)，antisense：5’-CCCAAGCTTATTGGTAAGGATGAC-3’(含HindⅢ酶切位點)。將PCR產物和載體PQE40分別用BamHⅠ/ HindⅢ雙酶切后進行連接。將C端加有6His-Tag的KDRcDNA片段，N端帶有Kozak序列GCCACC及ATG起始密碼的小鼠Igk信號肽序列的cDNA片段與PQE40載體進行連接，構建分泌型真核表達質粒PQE40-KDR，即sKDR載體連接方式及酶切位點情況(圖1)。

②采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法進行穩定表達sKDR細胞株的篩選：在200 μg/ml的G418濃度下對穩定株進行培養，在400 μg/ml的G418濃度下篩選陽性轉染株，將篩選出的PQE40-KDR陽性細胞克隆，用無血清培養基培養，取培養上清依次進行倍比稀釋(1∶1,1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64,1∶128)，包被96孔酶標板，利用rhVEGF165作為一抗，小鼠抗人VEGF單抗作為二抗，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG，以四甲基聯苯胺(TMB)作為底物進行顯色，硫酸終止后在酶標儀上檢測450與620 nm處吸光度A比值(A450/A620比值)。

③逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)鑒定穩定表達sKDR的細胞株：取穩定表達sKDR的HUVEC，Trizol法提取細胞總RNA。取2 μg 總RNA用逆轉錄酶進行逆轉錄合成cDNA，PCR分別擴增KDR和β-action。KDR引物：上游引物5’-AATTACTTGCAGGGGACAGAG,下游引物5’-TTCTGGGTATCTTGCACAAAG,擴增片段位于胞外第1-4 Ig樣結構域，長度352 bp；β-action引物：上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA,下游引物5，-CTCCTTAATGTCACGCATTTC,擴增片段長度為630 bp。采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離產物，并在紫外線燈下拍照保存。重復3次。

④四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測HUVEC的增殖情況：選用生長良好的第3代HUVEC，調整細胞密度為2×104個/ml，接種于96孔細胞培養板，37℃培養24 h，細胞貼壁后換為不含血清的RPMI1640培養液繼續培養24 h，分別加入pQE40-KDR組，pQE40組及未轉染組HUVEC無血清培養上清，濃度100 μl/ml。隨后分別觀察HUVEC的生長情況。

⑤sKDR蛋白對CAM血管生成的影響:將雞胚置于37.8℃的孵箱中孵育，每天輕輕翻蛋2-3次。取孵滿8 d的雞胚，用酒精消毒蛋殼，在雞胚長軸的氣室一端打一1-2 mm的減壓孔，另在雞胚長軸中央(胚頭右下方)開一1-2 cm2的天窗，形成人工氣室。帶有5 cm圓孔硝酸纖維素濾膜，高壓滅菌，分別取PBS(10 μl)、VEGF(20 ng)、VEGF(20 ng)+不同濃度sKDR(0.5 μg、1 μg和2 μg)點于紙片上，待其充分吸收后，加入雞胚尿囊膜血管較少的部位。加雞胚，用滅菌透明膠帶封閉，孵育72 h，數碼相機拍照。

圖1 p QE40-KDR連接方案示意圖

(說明：本圖為作者原創，是本文中sKDR真核分泌型表達質粒構建的重要環節。Igκ信號肽位于pQE40真核表達質粒CMV啟動子的下游，可引導表達的蛋白分泌到細胞外，KDR cDNA為KDR胞外第1-4 Ig樣結構域，6His為組氨酸標簽。這種結構可使sKDR在信號肽的指導下分泌到細胞培養上清，并能通過6His組氨酸標簽進行純化)

2 結果

2.1 穩定表達sKDR的HUVEC培養上清與VEGF的結合活性：穩定表達sKDR的培養上清pQE40-KDR經倍比稀釋后與rhVEGF蛋白呈現出不同的結合力，在1∶1-1∶16稀釋范圍內，隨稀釋度增大A值逐漸降低，二者呈明顯正相關，相關系數r=0.9063。轉染空質粒組(pQE40)和未轉染組的HUVEC培養上清與VEGF無結合力(表1)。

表1 表達sKDR的HUVEC培養上清與rhVEGF165結合力

2.2 RT-PCR檢測穩定表達sKDR的HUVEC細胞KDRmRNA表達水平：將各組 KDR與內參β-action電泳條帶進行光密度掃描后分析，發現pQE40-KDR與β-action比值為0.665±0.048，而pQE40組和未轉染組分別0.160±0.015和0.161±0.020。與pQE40組比較，pQE40-KDR組的KDR表達水平明顯增高，差異具有統計學意義(t=17.387，P<0.0001)；pQE40組與未轉染組比較，差異無統計學意義(t=0.02317，P=0.9826)。未轉染組也呈現出一定水平的KDRmRNA，(圖2)。

M:標樣;1:pQE40-KDR;2:pQE40；3：未轉染組

2.3 sKDR對HUVEC增殖能力的影響：MTT法檢測HUVEC增殖，我們發現與PBS組相比，未轉染組、pQE40組和pQE40-KDR組， KDR可顯著誘導并加速內皮細胞增殖。加入sKDR后，隨著加入濃度的增加，內皮細胞增殖受抑程度增強，說明內皮細胞增殖與sKDR濃度水平呈正相關。兩者相對比，差異有統計學意義(表2)。

表2 sKDR對臍靜脈內皮細胞增殖的影響

Note:*compare with PBS group;#compare with KDR group

2.4 sKDR對CAM血管生成的影響：KDR可顯著促進CAM血管生成。6只經KDR處理的雞胚其血管均以KDR為中心呈放射狀分布。當加入含量為2 μg的 sKDR時，6只雞胚中只有一枚血管呈放射狀分布顯示出極強的血管抑制功能，兩者相對比，差異有顯著統計學意義(P<0.01)，(圖3)。

圖3 sKDR對雞胚尿囊膜血管生成的影響

3 討論

VEGF可特異性結合VEGFR(主要是VEGFR1和VEGFR2)，誘導血管形成。VEGFR-2的結構包括細胞內部分、跨膜部分和細胞外部分，這些都是信號傳輸所必需的。近年來，國內外研究普遍認為，sKDR是VEGFR2的膜外部分的一種可溶性形式，它對VEGF具有相同的高親和力，但不誘導血管生成。因此，sKDR可與VEGF結合，并與正常的VEGFR-2競爭，通過形成具有跨膜VEGF受體的非活性異二聚體，可以發揮顯性負作用。因此，sKDR向腫瘤組織的傳遞抑制了腫瘤組織中新生血管的形成，具有抗腫瘤作用。在VEGF受體中，VEGFR2即KDR在介導VEGF刺激內皮細胞增殖及血管通透性方面的作用更重要[6,7]。臨床實驗結果證實多種腫瘤細胞均表達KDR，腫瘤細胞分泌的VEGF與血管內皮細胞及腫瘤細胞膜上的KDR結合后通過自分泌和旁分泌效應，促進內皮細胞增殖，并增加血管通透性，加速腫瘤細胞分裂增殖，導致腫瘤生長與轉移[8,9]。提示在HUVEC中存在VEGF/KDR信號傳導途徑。VEGF能與KDR結合，從而促進細胞增殖誘導新生血管形成，因此干擾VEGF/KDR信號傳導亦就成為目前抗腫瘤血管生成治療中的主要策略[4,5]。由于KDR僅存在于血管內皮細胞和大多數腫瘤細胞表面，腫瘤細胞表達分泌的VEGF只有與血管內皮細胞膜上的KDR結合后，才能誘導內皮細胞增殖生長及血管通透性增加[9,10,11]。因此，瞄準KDR并使其生物活性失活的策略將能在很大程度上遏制腫瘤血管生成，阻止腫瘤持續生長。

本實驗結果中的各項統計數據初步說明，我們針對血管內皮生長因子受體2(VEGF2)構建的真核分泌型表達載體pQE40-KDR，即sKDR具有特異性抑制VEGF/KDR信號傳導的功能，從而有效遏制了HUVEC增殖和CAM血管生成。本實驗同時表明，sKDR僅具有與配體結合的能力而無信號傳導功能，因其與KDR的特異性結合而顯著下調了VEGF與KDR結合的能力，可顯著降低VEGF的水平和活性，從而達到抑制HUVEC細胞增殖和阻抑CAM血管新生的目的。因此，這一發現對于抑制惡性實體瘤轉移具有極其重要的意義。也為分子靶向用藥的基因治療，甚至抗血管治療腫瘤的新藥研發提供了實驗依據和新思路。因此，靶向KDR一方面可通過干擾VEGF/KDR的信號傳導，另一方面可與VEGF的競爭性結合起到耗竭VEGF的作用，從而有效抑制細胞生長，KDR作為新的抗癌基因治療靶點具有一定的潛力和臨床應用前景。