不同表面樣式引導(dǎo)骨再生生物膜對(duì)細(xì)菌黏附能力影響的研究

儲(chǔ)順禮，崔 巖，周延民，李嫻靜，李 威

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 種植科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

生物材料應(yīng)用于人體，對(duì)醫(yī)學(xué)進(jìn)步做出了顯著貢獻(xiàn)，然而，生物材料在植入人體初期也扮演著異物的角色，也會(huì)為細(xì)菌定植提供了合適的場(chǎng)所[1]。在口腔骨缺損再生治療中，引導(dǎo)骨再生(GBR)生物膜必不可少，臨床應(yīng)用中由于組織張力過大經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)生物膜暴露感染，關(guān)于生物膜表面細(xì)菌黏附定植對(duì)比研究國內(nèi)外甚少，本研究基于此，研究不同表面樣式引導(dǎo)骨再生生物膜對(duì)變形鏈球菌黏附的影響，以期獲得相關(guān)參數(shù)，從而指導(dǎo)生物膜的臨床應(yīng)用以及研發(fā)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

依據(jù)專利[2]，采用鹽析法制備出PPC[聚碳酸亞丙酯，poly(propylene carbonate),簡(jiǎn)稱PPC] / PBS[聚琥珀酸丁二酯，poly(butylene succinate),簡(jiǎn)稱PBS] 引導(dǎo)骨再生生物膜(簡(jiǎn)稱PPC/PBS膜)，修剪成5 mm×5 mm大小，環(huán)氧乙烷熏蒸消毒后備用；海奧生物膜(20 mm×25 mm)購自于煙臺(tái)正海生物科技股份有限公司，修剪成5 mm×5 mm大小后環(huán)氧乙烷熏蒸消毒備用。變形鏈球菌336931購自于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；BHI血瓊脂平板。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及表面形態(tài)檢測(cè)

采用鹽析法制備的PPC/PBS膜以及市售的海奧生物膜，依據(jù)其表面形態(tài)，可以分為粗糙面和光滑面，對(duì)四種樣式的表面進(jìn)行分組，依次為PPC/PBS膜多孔面組、PPC/PBS膜光滑面組(依據(jù)專利制備的PPC/PBS基引導(dǎo)骨再生生物膜表面其中一面非常光滑，孔很少很小，記為PPC/PBS膜光滑面，另外一面非常粗糙，有很多相通的孔，記為PPC/PBS膜多孔面)、海奧膜非UP面組、海奧膜UP面組(海奧生物膜表面其中一面印有UP字樣，該UP面相對(duì)較為致密，另一面無UP字樣，相對(duì)較為粗糙，臨床操作中非UP面與骨缺損直接接觸，UP面與軟組織相接觸)。對(duì)上述四組表面形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)。

1.3 細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)用變形鏈球菌336931菌株接種于BHI瓊脂平板，進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，形態(tài)學(xué)檢查為純培養(yǎng)物，厭氧培養(yǎng)48 h，制成濃度為6×108的菌懸液。將上述四組生物膜分別置于24孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)面朝上，生物膜周邊應(yīng)用橡皮泥填平(防止菌液從周邊滲透進(jìn)入非實(shí)驗(yàn)面)，應(yīng)用口腔正畸用金屬結(jié)扎絲將其固定位于培養(yǎng)板的最底部保持穩(wěn)定，環(huán)氧乙烷熏蒸消毒后，各加入0.2 ml細(xì)菌懸液，置入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出生物膜，用PBS緩沖液清洗5次。然后每個(gè)樣本置入離心管內(nèi)加入PBS緩沖液 2 ml，超聲洗滌60 s，收集原液并進(jìn)行10倍倍比稀釋至10-3。取10 μl菌液接種于BHI瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌落生長數(shù)量計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察各樣本表面形貌結(jié)果顯示兩種生物膜具有不同孔大小的表面結(jié)構(gòu)形態(tài)。海奧膜光滑面較為致密，膠原束排列較不規(guī)則稍顯松散，粗糙面較為疏松，可見膠原纖維呈束狀排列，相鄰膠原束排列較松散 。PPC/PBS膜光滑面表面非常光滑致密，很平整，微米級(jí)孔很少見。多孔面呈多孔狀，表面均為微米級(jí)孔所覆蓋，孔大小不一，大孔孔徑約200 μm，平均孔徑約120 μm。具體見下圖1所示。

2.2 靜態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)下兩組試件表面變形鏈球菌黏附數(shù)的比較菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：PPC/PBS多孔面和海奧膜非UP面黏附數(shù)最多，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其次是海奧膜UP面，數(shù)量次之，最少的是PPC/PBS膜光滑面，數(shù)量最少，PPC/PBS膜光滑面與其它組相比較差異有顯著性，海奧膜UP面與其它組相比差異有顯著性,具體數(shù)據(jù)見表1。

圖1 掃描電鏡下兩種生物膜表面形態(tài)(A：海奧膜UP面；B：海奧膜非UP面；C：PPC/PBS膜光滑面；D：PPC/PBS膜多孔面)

表1 變形鏈球菌24 h黏附量的菌落形成單位計(jì)數(shù)(1×105CFU/mm2,Mean±SEM)

3 討論

口腔微生態(tài)系統(tǒng)是由微生物、宿主與口腔環(huán)境之間相互作用、相互依賴而組成的統(tǒng)一整體。但當(dāng)外源物進(jìn)入口腔內(nèi)可能會(huì)改變口腔微生態(tài)環(huán)境，破壞口腔微生態(tài)平衡從而引發(fā)炎癥等[3]。在臨床骨缺損中廣泛應(yīng)用的GBR生物膜即屬于外源物，然而，在GBR操作中，由于植入物導(dǎo)致局部張力很大，再加上術(shù)后局部的水腫，往往會(huì)造成軟組織創(chuàng)口術(shù)后裂開，生物膜易暴露于口腔微環(huán)境中。這種生物膜一旦暴露于口腔微生態(tài)環(huán)境中，口腔微生物勢(shì)必會(huì)附著于表面，這在一定程度上影響了GBR的效果甚至?xí)?dǎo)致局部的感染引起失敗等。

微生物發(fā)揮致病性的首要步驟是在宿主或者外源物表面的黏附[3]。細(xì)菌的黏附被認(rèn)為在感染的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。影響細(xì)菌黏附的因素較多，主要包括三個(gè)方面：修復(fù)體材料(如修復(fù)材料的表面結(jié)構(gòu)粗糙度等)、微生物(如微生物的種類等)、宿主(如口腔衛(wèi)生等)[4,5]。有研究表明材料表面細(xì)菌的黏附量與材料的粗糙程度有一定的相關(guān)性，表面結(jié)構(gòu)越粗糙，細(xì)菌黏附量增多，粗糙的表面可為細(xì)菌提供附著的場(chǎng)所并產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)，對(duì)細(xì)菌在材料表面的早期黏附量有重要影響[6,7]。在本研究掃描電鏡結(jié)果顯示，PPC/PBS膜光滑面十分光滑，海奧膜UP面相對(duì)較為致密光滑，而PPC/PBS膜多孔面、海奧膜非UP面均較為粗糙。若依據(jù)上述表面結(jié)構(gòu)粗糙與細(xì)菌黏附相關(guān)性推測(cè)：PPC/PBS膜光滑面和海奧膜UP面表面相對(duì)更為致密，細(xì)菌的黏附相對(duì)較少，而PPC膜多孔面、海奧膜非UP面表面十分粗糙相對(duì)更有利于細(xì)菌的黏附。

變形鏈球菌是口腔主要致病菌之一，屬于最早定植菌，對(duì)牙齒等口內(nèi)物表有很高的親和力，為后續(xù)細(xì)菌定植等提供便利[8]。因此本研究選用變形鏈球菌進(jìn)行對(duì)比研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在相同培養(yǎng)條件下，PPC/PBS膜光滑面和海奧膜UP面表面黏附的細(xì)菌量明顯低于PPC/PBS膜粗糙面、海奧膜粗糙面，且PPC/PBS膜光滑面也地獄海奧膜UP面，差異有顯著性。這也與掃描電鏡結(jié)果相一致，PPC/PBS膜光滑面呈現(xiàn)的表面形態(tài)非常光滑致密，不利于細(xì)菌的黏附定植；海奧膜UP面次之；而表面相對(duì)較為粗糙的PPC/PBS膜粗糙面、海奧膜粗糙面其表面形態(tài)更有利于細(xì)菌的黏附。這與Badih[9]的研究結(jié)果相類似，材料粗糙度越大，細(xì)菌越容易黏附。

GBR生物膜主要應(yīng)用于引導(dǎo)骨再生中隔絕軟組織細(xì)胞進(jìn)入到骨再生空間，都具有兩個(gè)表面，一面貼附于骨缺損直接與骨或骨替代材料接觸，另一面貼附于軟組織與軟組織創(chuàng)口直接接觸。上述變形鏈球菌在不同表面結(jié)構(gòu)生物膜材料表面具有不同的黏附特性提示我們，為防止或盡量減少細(xì)菌在GBR生物膜表面黏附，建議臨床上在條件允許的情況下應(yīng)盡量選用其中一面為更為光滑的GBR生物膜，且在臨床應(yīng)用中不可以將生物膜多孔面和光滑面位置顛倒，以免細(xì)菌在生物膜表面聚集影響骨再生效果。