lncRNA LEF1-AS1 通過靶向miR-612 調控皮膚鱗狀細胞癌細胞株增殖、凋亡、遷移侵襲的體外實驗研究

鄭云鵬 李旭陽 蔡丙杰 李冬芹 尹光文

鄭州大學第一附屬醫院皮膚科450052

皮膚鱗狀細胞癌（簡稱皮膚鱗癌）是一種常見的皮膚惡性腫瘤，部分患者可發生快速轉移，影響皮膚外觀和預后［1-4］。早期快速準確地控制腫瘤進展對患者具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miR）均為常見的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），其在機體癌癥中的促進功能或者抑制功能均已得到很多研究的認可［5-6］。lncRNA LEF1-AS1 在多種癌癥中均已有研究報道，但是在皮膚鱗癌中的功能及機制尚不清楚。本實驗通過生物信息學預測LncRNA LEF1-AS1 的靶向miRNA，發現LncRNA LEF1-AS1 與miR-612 有結合位點，且研究報道LncRNA LINC00460通過使miR-612海綿化可促進頭頸部鱗癌細胞的增殖，遷移和侵襲［7］。但miR-612在皮膚鱗癌中的功能尚不清楚。本研究以皮膚鱗癌細胞SCC13 為研究對象，檢測lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表達，觀察干擾lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表達對其增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。

材料與方法

一、實驗材料

收集鄭州大學第一附屬醫院2018 年3 月至2019 年6 月外科手術切除的20例皮膚鱗癌及對應的癌旁組織。本研究符合2013 年修訂的《赫爾辛基 宣 言》（https：//www.wma.net/policies-post/wmadeclaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medicalresearch-involving-human-subjects/）的要求，所有受試者均簽署知情同意書。

SCC13細胞（編號：CVCL_4029）購自美國模式培養物集存庫。實時熒光定量逆轉錄PCR（qRTPCR）檢測試劑盒、反轉錄試劑盒（日本Takara 公司）；LipofectamineTM2000 脂質體轉染試劑盒（美國Invitrogen 公司，規格：1.5 ml）；CCK8 細胞計數試劑盒（日本同仁化學研究所）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；遷移實驗（Transwell）小室（美國Corning 公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega 公司）。 流 式 細 胞 儀（Cytomics FC 500，美 國BECKMANCOULTER公司）。

二、qRT-PCR法檢測組織中皮膚鱗癌及癌旁組織中LEF1-AS1、miR-612的表達

將充分研磨的組織用RNA提取試劑盒抽提總RNA，再用反轉錄試劑盒將其合成cDNA，采用qRT-PCR 檢測試劑盒檢測lncRNA LEF1-AS1、miR-612的表達，以GAPDH、U6為內參，引物由南京科佰生物科技有限公司合成，序列見表1，以2-△△Ct法分析lncRNA LEF1-AS1、miR-612的相對表達量。

三、SCC13細胞的培養與分組

使用含10%胎牛血清的DMEM 培養基在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中常規培養和傳代SCC13 細胞。按脂質體LipofectamineTM2000 試劑的說明書操作將lncRNA LEF1-AS1 的干擾無意義序列（si-NC）、lncRNA LEF1-AS1 的干擾序列（si-LEF1-AS1）、miR-612 過表達的無意義序列（miR-NC）、miR-612 過表達基因序列（miR-612）轉染至SCC13 細胞，記為si-NC 組、si-LEF1-AS1 組、miR-NC組、miR-612組；將si-LEF1-AS1分別與抑制miR-612 表達的無意義序列（anti-miR-NC）、抑制miR-612 表達基因序列（anti-miR-612）共轉染至SCC13 細胞中，記為si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組和si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組；各組在轉染8 h后棄去培養基繼續培養48 h，用qRT-PCR法檢測轉染的效率，確定轉染成功后用于后續實驗研究。

四、干擾lncRNA LEF1-AS1表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

取si-NC 組、si-LEF1-AS1 組SCC13 細胞，采用CCK8 法檢測細胞增殖，流式細胞儀分析細胞的凋亡情況，Transwell試驗檢測細胞的遷移、侵襲能力，Western印跡檢測增殖相關蛋白細胞周期蛋白依賴激酶1（cyclinD1）、細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑（p21），凋亡相關蛋白Bcl-2、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax），遷移及侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的相對水平。

1.CCK8 法檢測細胞增殖：以100 μl、5×105個細胞置于96孔板中，培養24、48、72 h，加入20 μl的CCK8溶液，使用酶標儀在490 nm波長檢測各組細胞的吸光度（A值）。以A值反映細胞的增殖能力。

2.流式細胞儀分析細胞凋亡：收集細胞，使用結合緩沖液重懸，按照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書要求操作，避光孵育待測細胞，快速上流式細胞儀檢測分析細胞的凋亡情況。凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。

3.Transwell 試驗檢測細胞的遷移、侵襲能力：收集細胞，先用不含血清的培養基培養24 h，取1×105/ml 細胞100 μl 均勻鋪在上室表面，下室內加入700 μl含有血清的培養基，將小室置于恒溫培養箱中培養24 h，取出小室后，進行甲醇固定、結晶紫染色，顯微鏡下觀察穿膜細胞數，取5個視野拍照，計算平均值。選用含有基質膠的小室檢測細胞的侵襲能力，不含基質膠的小室檢測細胞的遷移能力。

表1 實時熒光定量逆轉錄PCR引物信息

4.Western印跡試驗：收集細胞，裂解后提取總蛋白，使用BCA 法對蛋白進行定量。目的蛋白沸水浴變性處理，取上清液上樣電泳，經轉膜、封閉后，將膜轉移至一抗溶液（1∶500）中，4 ℃下孵育過夜。將膜轉移至相應的二抗稀釋液（1∶1 000）中，室溫孵育2 h，通過超敏ECL 發光試劑盒顯影、定影、曝光。使用Quantity One 4.6軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 為參照，以目的條帶灰度值與GAPDH 條帶的比值為cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相對表達水平。

五、過表達miR-612對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

取miR-NC 組、miR-612 組SCC13 細胞，采用CCK8 法檢測細胞增殖，流式細胞儀分析細胞的凋亡情況，Transwell 試驗檢測細胞的遷移、侵襲能力，Western 印跡檢測cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相對水平。

六、lncRNA LEF1-AS1 與miR-612 的結合能力檢測

用LncBase Predicted v.2 在線預測網站（http：//carolina.imis.athena - innovation.gr/diana_tools/web/index.php？r=lncbasev2%2Findex-predicted）預 測lncRNA LEF1-AS1 與miR-612 之間的互補序列，根據互補序列設計合成有互補結合位點的WT-LEF1-AS1序列和無互補結合位點的MUT-LEF1-AS1序列（圖1），并將其克隆至熒光載體上，構建熒光素酶報告基因質粒，分別與miR-NC、miR-612 共轉染至SCC13細胞，轉染48 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒要求操作，檢測細胞的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以二者的比值表示報告基因的表達水平。

將LEF1-AS1過表達的無意義序列（LEF1-AS1-NC）、LEF1-AS1 過表達基因序列（LEF1-AS1）、si-NC、si-LEF1-AS1 轉染至SCC13 細胞中，采用qRT-PCR 法檢測各組細胞miR-612 的相對表達水平，以檢測lncRNA LEF1-AS1 對miR-612 的調控作用。

圖1 根據長鏈非編碼RNA LEF1-AS1與微小RNA-612（miR-612）之間的互補序列設計的互補和不互補序列WT-LEF1-AS1：有互補結合位點的序列；MUT-LEF1-AS1：無互補結合位點的序列

七、干擾lncRNA LEF1-AS1 及抑制miR-612 表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

取si-NC 組、si-LEF1-AS1 組、si-LEF1-AS1 +anti-miR-NC 組、si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 組細胞，采用qRT-PCR法檢測各組細胞miR-612的相對表達，CCK8法檢測細胞增殖，流式細胞儀分析細胞的凋亡情況，Transwell 試驗檢測細胞的遷移、侵襲能力，Western 印跡檢測cyclinD1、p21、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的相對水平。

八、統計學處理

結 果

一、lncRNA LEF1-AS1 和miR-612 在皮膚鱗癌組織中的表達

皮膚鱗癌組織中的lncRNA LEF1-AS1 相對表達（2.93±0.29）高于癌旁皮膚組織（1.00±0.08，t=28.69，P ＜0.001），miR-612 的相對表達（0.52 ±0.05）低于癌旁皮膚組織（1.01±0.09，t=21.28，P ＜0.001）。

二、干擾lncRNA LEF1-AS1 表達對SCC13 增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

見圖2、表2。si-LEF1-AS1 組細胞lncRNA LEF1-AS1 相對表達低于si-NC 組（P ＜0.05）；24、48、72 h 時細胞增殖能力低于si-NC 組（均P ＜0.05），細胞凋亡率高于si-NC 組（P ＜0.05），遷移、侵襲細胞數均低于si-NC組（均P ＜0.05）。

Western 印跡顯示，si-LEF1-AS1組細胞增殖相關蛋白cyclinD1相對水平低于si-NC 組（P ＜0.05），p21 相對水平高于si-NC 組（P ＜0.05）；凋亡相關蛋白Bcl-2相對水平低于si-NC組（P ＜0.05），Bax相對水平高于si-NC 組（P ＜0.05）；遷移、侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9 相對水平均低于si-NC 組（均P ＜0.05）。見圖3、表3。

三、miR-612 過表達對SCC13 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

miR-612 組細胞miR-612 相對表達高于miRNC 組（P ＜0.05）；24、48、72 h 時miR-612 組細胞增殖能力低于miR-NC 組（均P ＜0.05）；miR-612組細胞凋亡率高于miR-NC 組（P ＜0.05）；miR-612 組遷移、侵襲細胞數均低于miR-NC組（均P ＜0.05）。見圖4、表4。

圖2 干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1表達后SCC13細胞的凋亡、遷移、侵襲能力 2A：流式細胞儀檢測，si-LEF1-AS1組細胞凋亡率高于si-NC組；2B：Transwell試驗檢測，si-LEF1-AS1組遷移、侵襲細胞數均低于si-NC組。si-NC，轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1，轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

表2 干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

表2 干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

注：n=9。si-NC：轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

分組LEF1-AS1表達（2-△△Ct）細胞增殖能力（吸光度）24 h 0.33±0.03 0.29±0.03 2.83 0.012 48 h 0.69±0.06 0.37±0.03 14.32＜0.001 72 h 1.01±0.09 0.51±0.05 14.57＜0.001凋亡率（%）遷移細胞數（個）侵襲細胞數（個）si-NC si-LEF1-AS1 t值P值1.00±0.08 0.49±0.04 17.10＜0.001 7.36±0.71 21.69±2.13 19.15＜0.001 82.65±8.12 37.69±3.34 15.36＜0.001 69.48±6.87 29.64±3.36 15.63＜0.001

圖3 Western 印跡檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1 表達后SCC13 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白的表達 3A：si-LEF1-AS1 組cyclinD1 相對水平低于si-NC 組，p21 相對水平高于si-NC 組；3B：Bcl-2 相對水平低于si-NC 組，Bax 相對水平高于si-NC 組；3C：MMP-2、MMP-9相對水平均低于si-NC組。si-NC，轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1，轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

表3 Western印跡檢測干擾lncRNA LEF1-AS1表達后SCC13細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白的表達（±s）

表3 Western印跡檢測干擾lncRNA LEF1-AS1表達后SCC13細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白的表達（±s）

注：n=9。si-NC：轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列

分組 增殖相關蛋白cyclinD1 0.65±0.06 0.24±0.03 18.34＜0.001 p21 0.31±0.03 0.73±0.06 18.78＜0.001凋亡相關蛋白Bcl-2 0.69±0.06 0.27±0.03 18.78＜0.001 Bax 0.37±0.03 0.78±0.07 16.15＜0.001遷移、侵襲相關蛋白MMP-2 0.83±0.07 0.39±0.04 16.37＜0.001 MMP-9 0.61±0.06 0.22±0.03 17.44＜0.001 si-NC si-LEF1-AS1 t值P值

Western印跡顯示，miR-612組細胞增殖相關蛋白cyclinD1 相對水平低于miR-NC 組（P ＜0.05），p21 相對水平高于miR-NC 組（P ＜0.05）；凋亡相關蛋白Bcl-2相對水平低于miR-NC組（P ＜0.05），Bax相對水平高于miR-NC 組（P ＜0.05）；遷移、侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9相對水平均低于miR-NC 組（均P ＜0.05）。見圖5、表5。

四、lncRNA LEF1-AS1 靶向調控SCC13 細胞miR-612的表達

共轉染WT-LEF1-AS1后，miR-612組細胞熒光活性（0.33 ± 0.03）低于miR-NC 組（1.00 ± 0.09，t =21.19，P ＜0.001）；而共轉染MUT-LEF1-AS1 后，miR-612 組細胞熒光活性（0.97 ± 0.07）與miR-NC組（0.98 ± 0.08）差異無統計學意義（t = 0.28，P =0.78）。

圖4 miR-612 過表達對SCC13 細胞的凋亡、遷移、侵襲能力的影響 4A：流式細胞儀檢測，miR-612 組細胞凋亡率高于miR-NC 組；4B：Transwell試驗檢測，miR-612組遷移、侵襲細胞數均低于miR-NC組。miR-NC組，轉染miR-612過表達的無意義序列；miR-612組，轉染miR-612過表達基因

表4 miR-612過表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

表4 miR-612過表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響（±s）

注：n=9。miR-NC組：轉染miR-612過表達的無意義序列；miR-612組：轉染miR-612過表達基因

分組miR-612（2-△△Ct）凋亡率（%）遷移細胞數（個）miR-NC miR-612 t值P值0.99±0.07 2.68±0.26 18.83＜0.001增殖能力（吸光度）24 h 0.35±0.03 0.32±0.03 2.12 0.049 28 h 0.67±0.06 0.43±0.04 9.98＜0.001 72 h 1.03±0.09 0.57±0.05 13.40＜0.001 6.89±0.67 18.46±1.73 18.71＜0.001 83.65±8.41 43.66±4.39 12.64＜0.001侵襲細胞數（個）71.64±7.32 34.69±3.87 13.33＜0.001

圖5 Western印跡檢測干擾miR-612過表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響 5A：miR-612組cyclinD1相對水平低于miR-NC組，p21相對水平高于miR-NC組；5B：Bcl-2相對水平低于miR-NC組，Bax相對水平高于miR-NC組；5C：MMP-2、MMP-9相對水平均低于miR-NC組

表5 Western印跡檢測miR-612過表達對SCC13細胞相關蛋白的影響（±s）

表5 Western印跡檢測miR-612過表達對SCC13細胞相關蛋白的影響（±s）

注：n=9。miR-NC組：轉染miR-612過表達的無意義序列；miR-612組：轉染miR-612過表達基因

分組 增殖相關蛋白cyclinD1 0.66±0.06 0.29±0.03 16.55＜0.001 p21 0.30±0.03 0.68±0.06 16.99＜0.001凋亡相關蛋白Bcl-2 0.71±0.06 0.33±0.03 16.99＜0.001 Bax 0.36±0.03 0.75±0.06 17.44＜0.001遷移、侵襲相關蛋白MMP-2 0.85±0.07 0.43±0.04 15.63＜0.001 MMP-9 0.62±0.06 0.26±0.03 16.10＜0.001 miR-NC miR-612 t值P值

LEF1-AS1-NC 組、LEF1-AS1 組、si-NC 組、si-LEF1-AS1 組細胞miR-612 的相對表達分別為1.00±0.09、0.49±0.04、1.01±0.08、2.53±0.25，差異有統計學意義（F=356.62，P ＜0.001），LEF1-AS1組低于LEF1-AS1-NC 組（LSD-t =15.54，P ＜0.05），si-LEF1-AS1 組高于與si-NC 組（LSD-t=17.33，P ＜0.05）。

五、干擾lncRNA LEF1-AS1 并抑制miR-612 的表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

si-NC 組、si-LEF1-AS1 組、si-LEF1-AS1+antimiR-NC 組、si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 組細胞間miR-612 的相對表達差異有統計學意義，24、48、72 h 時的增殖能力差異有統計學意義，凋亡率（圖6）、遷移、侵襲細胞數（圖7）差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。si-LEF1-AS1 組細胞中miR-612表達高于si-NC組，48、72 h細胞增殖能力低于si-NC組，細胞凋亡率高于si-NC組，遷移細胞數和侵襲細胞數低于si-NC 組（均P ＜0.05），而si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組細胞中miR-612 表達低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組，48、72 h 細胞增殖能力高于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 組，細胞凋亡率低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組，遷移細胞數和侵襲細胞數高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組（均P ＜0.05）。見表6。

圖6 流式細胞儀檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1并抑制miR-612的表達對SCC13細胞凋亡的影響 si-LEF1-AS1組細胞凋亡率高于si-NC組（P ＜0.05）；si-LEF1-AS1+anti-miR-612組細胞凋亡率低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組。si-NC，轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1，轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列；anti-miR-NC，轉染抑制miR-612表達的無意義序列；anti-miR-612，轉染抑制miR-612表達基因

圖7 Transwell試驗檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1并抑制miR-612的表達對SCC13細胞遷移、侵襲能力的影響 si-LEF1-AS1組遷移細胞數和侵襲細胞數低于si-NC組；si-LEF1-AS1+anti-miR-612組遷移細胞數和侵襲細胞數高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組

Western 印跡顯示，4 組細胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平差異均有統計學意義（均P ＜0.001），si-LEF1-AS1 組cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平均低于si-NC 組，p21、Bax 蛋白相對水平高于si-NC 組（均P ＜0.05）；而si-LEF1-AS1 + anti-miR-612 組cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平高于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 組，p21、Bax 蛋白相對水平低于si-LEF1-AS1 + anti-miR-NC 組（均P ＜0.05）。見圖8、表7。

討 論

Zong 等［8］報道，lncRNA LEF1-AS1 在食管鱗癌組織中的表達異常上調，并與患者的淋巴轉移和臨床分期具有顯著的相關性，提示lncRNA LEF1-AS1可能是參與食管鱗癌臨床進展的lncRNA，可作為潛在的預測指標。Zhang等［9］在口腔鱗癌的研究中發現，lncRNA LEF1-AS1在組織和細胞中的表達均顯著升高，且與患者預后不良相關，下調lncRNA LEF1-AS1能夠在體外抑制癌細胞的增殖、遷移，促進凋亡并發生G0/G1期阻滯，在體內抑制裸鼠腫瘤的生長，產生這種影響的作用機制與抑制Hippo信號通路活性具有明顯的相關性，提示lncRNA LEF1-AS1 通過抑制Hippo 信號通路，從而在口腔鱗癌中發揮致癌作用。由此，我們推測lncRNA LEF1-AS1可能在皮膚鱗癌中也具有致癌作用。本研究發現，lncRNA LEF1-AS1 在皮膚鱗癌組織中的表達異常升高，干擾lncRNA LEF1-AS1 表達后，皮膚鱗癌細胞SCC13的增殖能力、遷移侵襲能力均受到明顯的抑制，細胞的凋亡明顯增強，這些試驗結果均與lncRNA LEF1-AS1 在食管鱗癌和口腔鱗癌中的功能相呼應，提示其在皮膚鱗癌中也發揮致癌的功能。

表6 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移侵襲的作用（±s）

表6 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達對SCC13細胞增殖、凋亡、遷移侵襲的作用（±s）

注：n=9。si-NC：轉染lncRNA LEF1-AS1 的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉染lncRNA LEF1-AS1 的干擾序列；anti-miR-NC，轉染抑制miR-612 表達的無意義序列；anti-miR-612，轉染抑制miR-612表達基因。a與si-NC 組比較，P ＜0.05；b與si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組比較，P ＜0.05

增殖能力（吸光度）分組miR-612（2-△△Ct）si-NC si-LEF1-AS1 si-LEF1-AS1+anti-miR-NC si-LEF1-AS1+anti-miR-612 F值P值1.00±0.08 2.59±0.25a 2.56±0.26 1.41±0.14b 150.78＜0.001 24 h 0.34±0.03 0.31±0.03 0.29±0.03 0.33±0.04b 4.12 0.014 48 h 0.68±0.06 0.41±0.04a 0.38±0.03 0.57±0.04b 92.57＜0.001 72 h 1.05±0.09 0.56±0.05a 0.52±0.05 0.89±0.08b 122.15＜0.001凋亡率（%）7.74±0.76 22.64±2.24a 23.45±2.31 13.58±1.36b 160.34＜0.001遷移細胞數（個）85.69±8.55 39.65±3.87a 38.46±3.76 73.24±7.33b 131.67＜0.001侵襲細胞數（個）70.25±7.23 30.66±3.18a 28.79±2.87 59.68±5.44b 155.60＜0.001

圖8 Western印跡檢測干擾長鏈非編碼RNA（lncRNA）LEF1-AS1 并抑制miR-612 的表達對SCC13 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響 cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對水平，si-LEF1-AS1組低于si-NC 組，si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組高于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組；p21、Bax蛋白相對水平，si-LEF1-AS1 組高于si-NC 組，si-LEF1-AS1+anti-miR-612 組低于si-LEF1-AS1+anti-miR-NC組

miRNA 既可作為lncRNA 的靶標，還可作為靶基因的直接上游調控因子，其在癌癥中的功能得到普遍認可［10］。miR-612在肝癌、黑素瘤中均表達異常［11-12］，發揮調控癌癥進展的作用，但在皮膚鱗癌中的作用尚未十分清楚。Kang等［13］在非小細胞肺癌的研究中發現，miR-612 的表達異常降低，且與患者的臨床病理分期和淋巴結轉移密切相關。另外，過表達miR-612能夠抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡，阻止裸鼠體內腫瘤的生長，其機制為miR-612 靶向含溴結構域的蛋白4（BRD4）進而抑制PI3K/Akt 信號通路的活性，揭示miR-612/BRD4/PI3K/Akt信號通路在非小細胞肺癌中的功能，提示miR-612可能成為非小細胞肺癌患者抗癌治療的潛在靶標。Sheng 等［14］在研究中發現，miR-612在結直腸癌組織或細胞中的表達顯著降低，并且miR-612 在體外抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移，miR-612 直接靶向抑制AKT2，進而抑制下游的上皮-間質轉化相關的信號通路，說明miR-612 在結直腸癌的發展中起著關鍵性的作用。目前，miR-612 在皮膚鱗癌中的功能尚不清楚，我們推測其在皮膚鱗癌中也具有相似的抑癌作用。CyclinD1、p21 均是細胞周期調控因子，CyclinD1 高表達，p21 低表達，提示細胞增殖增多［15］。Bcl-2、Bax 是凋亡相關蛋白，Bcl-2 抗凋亡，Bax 促凋亡［16］。MMP-2、MMP-9是基質金屬蛋白酶家族成員，其高表達可促進細胞外基質的降解，促進細胞遷移、侵襲［17］。本研究發現干擾LncRNA LEF1-AS1 表達和miR-612 過表達后，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低，p21、Bax蛋白表達顯著升高。表明干擾LncRNA LEF1-AS1表達和miR-612 過表達可抑制皮膚鱗癌細胞的增殖、遷移侵襲，促進凋亡。本研究發現，miR-612在皮膚鱗癌組織中的表達異常降低，過表達miR-612具有與干擾lncRNA LEF1-AS1 相類似的抑制皮膚鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲和促進凋亡的作用。

表7 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達對SCC13細胞相關蛋白表達的影響（±s）

表7 干擾長鏈非編碼RNALEF1-AS1并抑制miR-612的表達對SCC13細胞相關蛋白表達的影響（±s）

注：n=9。注：si-NC：轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾無意義序列；si-LEF1-AS1：轉染lncRNA LEF1-AS1的干擾序列；anti-miR-NC，轉染抑制miR-612表達的無意義序列；anti-miR-612，轉染抑制miR-612表達基因。a 與si-NC 組比較，P ＜0.05；b與si-LEF1-AS1+anti-miR-NC 組比較，P ＜0.05

分組 增殖相關蛋白cyclinD1 0.64±0.06 0.26±0.03a 0.25±0.03 0.53±0.05b p21 0.32±0.03 0.74±0.06a 0.75±0.07 0.43±0.03b凋亡相關蛋白Bcl-2 0.70±0.06 0.29±0.03a 0.28±0.03 0.59±0.05b Bax 0.35±0.03 0.79±0.06a 0.80±0.08 0.46±0.04b遷移、侵襲相關蛋白MMP-2 0.84±0.07 0.38±0.03a 0.37±0.04 0.72±0.07b MMP-9 0.59±0.06 0.23±0.03a 0.22±0.03 0.48±0.04b si-NC si-LEF1-AS1 si-LEF1-AS1+anti-miR-NC si-LEF1-AS1+anti-miR-612 174.68＜0.001 166.60＜0.001 206.13＜0.001 151.87＜0.001 167.10＜0.001 175.20＜0.001 F值P值

我們通過生物信息學預測、雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證，lncRNA LEF1-AS1 可靶向作用miR-612，猜測這可能與lncRNA LEF1-AS1在皮膚鱗癌中的功能具有聯系。本研究發現，抑制miR-612能夠逆轉干擾lncRNA LEF1-AS1 對皮膚鱗癌細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的調控作用。提示在皮膚鱗癌中，lncRNA LEF1-AS1 可能通過miR-612 發揮調控皮膚鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突