女陰硬化性苔蘚皮損黑素細胞和表皮厚度分析

高小曼 李子媛 孫凱律 常建民

北京醫院皮膚科 國家老年醫學中心 中國醫學科學院老年醫學研究院100730

硬化性苔蘚（lichen sclerosus，LS）是一種慢性炎癥性皮膚疾病，可發生于全身各部位，其中以女性外陰部位最為常見［1-2］。女陰LS（VLS）多表現為對稱分布的瓷白色或灰白色斑片，同時可伴有水腫、糜爛、血皰、紫癜等［3］。由于本病以皮膚萎縮為特征，故以往稱為“硬化萎縮性苔蘚”，但近年發現，部分病例沒有發生皮膚萎縮，故將“萎縮”去除。我們通過分析LS皮損表皮黑素細胞以及厚度變化，探討LS最為突出的兩種臨床表現——色素減退和皮膚萎縮可能的病理學機制。

一、對象

VLS 組：2018 年6- 12 月于北京醫院皮膚科診治的15 例成年VLS 患者，年齡19 ～59 歲，經臨床及病理活檢確診。根據外陰典型皮損病理表現分為初期組7例和后期組8例。分組標準：初期皮損可見棘層輕度不規則增厚，真皮淺層水腫，但尚無明顯均質帶形成，大量淋巴細胞浸潤，淋巴細胞接近表皮；后期皮損可見表皮角化過度，棘層細胞減少，基底細胞液化，真皮淺層膠原纖維變性形成均質帶，其下方大量淋巴細胞呈帶狀浸潤（圖1）。

對照組：隨機選擇2018 年6-12 月于中國醫學科學院整形外科醫院婦科整形中心行外陰整形手術的15 例成年女性的外陰標本，所有標本經蘇木精-伊紅（HE）染色證實為正常皮膚組織。術前診斷分別為先天性陰唇肥厚11例、陰蒂包皮過長2例、陰道松弛2例。

本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》（www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html）的要求，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.試劑：一抗為大鼠抗人多巴色素異構酶（DCT）多克隆抗體和大鼠抗人細胞角蛋白14（Krt14）單克隆抗體，均由北京生命科學研究所制備，稀釋度1∶200。二抗為Alexa Fluor 546 驢抗大鼠IgG（H + L），產自美國ThermoFisher 公司，稀釋度1∶500。

2.免疫熒光染色檢測黑素細胞、角質形成細胞、表皮全層厚度和表皮細胞層厚度：OCT包埋標本，-80 ℃液氮冷凍，制作16 μm 厚冰凍切片，2.4%多聚甲醛溶液固定標本，0.3%H2O2-甲醇溶液透膜處理，封閉液封閉，加入一抗，4 ℃下孵育8～24 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次15 min，加入二抗，4 ℃下孵育2 h，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色30 min，50%甘油-DAPI溶液封片，-20 ℃條件保存。

圖1 不同時期女陰硬化性苔蘚皮損組織病理（HE×40） 1A：初期可見棘層不規則增厚，真皮淺層水腫，大量淋巴細胞浸潤，淋巴細胞接近表皮；1B：后期可見角化過度，表皮萎縮，基底細胞液化，真皮淺層均質帶形成，其下方大量淋巴細胞呈帶狀浸潤

用Zeiss-M1 正置熒光顯微鏡（德國Zeiss 公司）拍攝免疫熒光染色圖像。使用Imaris x64 7.4 軟件（Bitplane 公司，瑞士）和ZEN blue edition 2012軟件（德國Zeiss公司）進行圖像處理。在DCT染色切片中計算表皮黑素細胞數與基底層細胞總數的比值作為黑素細胞密度；在Krt14染色切片中測量表皮全層厚度和細胞層厚度，表皮全層厚度為皮膚表面至基底層最下方的垂直距離，表皮細胞層厚度為角質層最下方至基底層最下方的垂直距離。每張切片選擇3 個視野，每個視野測量3 組真皮乳頭處和表皮突處的表皮全層厚度及表皮細胞層厚度，取平均值。

3.統計分析：應用SPSS Statistics 20軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗進行組間兩兩比較；采用Welch′s anova方法比較3組間年齡和表皮細胞層厚度，采用Games-Howell檢驗對表皮細胞層厚度進行組間兩兩比較。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

三、結果

1.年齡比較：初期組（39.71±14.33）歲，后期組（35.25±11.20）歲，對照組（30.40±8.14）歲，3 組間差異無統計學意義（F=1.535，P=0.257）。

2.表皮黑素細胞密度：免疫熒光染色顯示，黑素細胞分布在表皮基底層（圖2）。VLS 初期和后期組表皮黑素細胞密度均低于對照組（t = 4.952、8.203，均P＜0.001），且后期組低于初期組（t=2.560，P=0.016）。見表1。

3.表皮厚度：見圖3、表1。3組間表皮全層厚度差異無統計學意義（P=0.487）。表皮細胞層厚度差異有統計學意義（P=0.007），其中，初期組與對照組（t=0.443，P=0.899）和后期組（t=1.484，P=0.354）差異均無統計學意義，但后期組顯著低于對照組（t=3.811，P=0.003）。

四、討論

皮膚色素減退在臨床上非常常見，出現的原因可能是原發性黑素細胞結構或功能破壞，如白癜風［4］，或繼發于其他皮膚病，如銀屑病、接觸性皮炎、特應性皮炎等［5-6］。大部分VLS患者可出現色素減退［7］，但機制尚不完全明確，可能是多種原因共同作用的結果，包括：①黑素細胞數目減少；②黑素顆粒產生減少；③黑素顆粒向角質形成細胞轉運障礙等［8］。DCT 是黑素合成過程中的一種特異性酶，我們選用DCT 標記黑素細胞，發現正常對照組外陰皮膚表皮黑素細胞密度平均值為0.275，VLS 初期組為0.170，后期組為0.110。無論初期還是后期VLS 表皮黑素細胞密度均較對照組明顯減少，說明黑素細胞數目減少是VLS 出現色素減退的機制之一。另外，本研究顯示，后期VLS表皮黑素細胞密度較初期減少，提示隨著病情進展，黑素細胞在逐漸減少。這一現象的出現可能是VLS 患者皮膚免疫反應誘導產生的多種炎癥因子抑制黑素細胞生成或造成黑素細胞損傷、凋亡等所致［8］。而對于VLS皮損中是否存在黑素顆粒產生減少或黑素顆粒向角質形成細胞轉運障礙等其他機制，還有待進一步研究證實。

圖2 不同時期女陰硬化性苔蘚（VLS）皮損表皮黑素細胞熒光染色圖 2A：初期VLS；2B：后期VLS；2C：正常對照 圖3 不同時期女陰期硬化性苔蘚（VLS）皮損表皮角質形成細胞熒光染色圖 3A：初期VLS；3B：后期VLS；3C：正常對照

表1 不同時期女陰硬化性苔蘚（VLS）表皮黑素細胞密度、表皮厚度（±s）

表1 不同時期女陰硬化性苔蘚（VLS）表皮黑素細胞密度、表皮厚度（±s）

組別初期VLS組后期VLS組對照組F值P值例數78 15表皮黑素細胞密度0.170±0.071 0.110±0.035 0.275±0.036 36.426＜0.001表皮全層厚度（μm）203.682±137.997 150.020±70.914 194.030±82.996 0.738 0.487表皮細胞層厚度（μm）154.603±121.984 83.455±37.129 176.974±80.296 7.330 0.007

既往很多研究表明，VLS患者常出現表皮萎縮，但多通過HE 染色證實，僅一項研究測量了VLS 皮損表皮厚度［9］。我們將VLS 病例分為初期和后期兩組，測量表皮全層厚度與細胞層厚度，分析表皮細胞增殖與角質層厚度的變化。本研究中所用的ZEN blue和Imaris成像分析軟件可直接精確測量皮膚組織切片的直接免疫熒光圖像，滿足實驗對精確度的要求。由于表皮厚度與年齡關系尚不明確，外陰皮膚厚度可能受年齡的影響［10-11］，故我們比較3組受試者年齡，發現差異無統計學意義，提示3組具有可比性。研究結果表明，VLS初期和后期皮損表皮全層厚度與正常皮膚均無明顯差異，但隨著病情進展，VLS表皮細胞層厚度逐漸減少，提示角質層厚度在逐漸增加。既往有研究顯示，VLS表皮的棘細胞層與真皮乳頭層厚度較健康人明顯變薄［9］，本研究中LS 皮損表皮細胞層厚度減少與上述文獻一致。我們推測VLS表皮細胞層減少可能是由于發病過程中免疫細胞產生的炎癥介質對基底層細胞產生破壞作用，使基底細胞出現液化變性，從而影響角質形成細胞的正常增殖；而角質層的增厚則可能與搔抓、摩擦等外界因素有關。

本研究表明，初期和后期VLS 表皮黑素細胞密度均較對照組減少，初期VLS 皮損表皮全層厚度和細胞層厚度均與對照組無明顯差異，而后期病例表皮細胞層厚度明顯減少。但是，外陰結構復雜，不同部位黑素細胞數量及皮膚厚度存在差異，本研究納入樣本量較少，未能區分具體的取材部位，所得結果有一定的局限性，將來還有待開展更多大樣本量的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突