偽基因和長鏈非編碼RNA在腎透明細胞癌患者血漿中的表達與臨床意義

鄒元章， 何宜宸， 陳兵海

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

腎透明細胞癌占腎腫瘤的比例高達90%，是臨床上最常見的腎細胞癌類型，通常簡稱為腎癌[1]。腎癌起病隱匿，缺乏早期癥狀，約有30%的患者在首次確診時已處于晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，且對傳統(tǒng)的放化療方法并不敏感[2]。盡管局部腎癌可通過手術(shù)予以切除，但仍有20%～40%的患者最終會發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。自2006年國際臨床指南中將靶向藥物(如舒尼替尼、索拉非尼等)作為一、二線治療藥物用于晚期腎癌和轉(zhuǎn)移性腎癌，腎癌患者的治療及預(yù)后得到了改善[4]。然而，近年來不少患者對靶向治療也表現(xiàn)出耐藥的現(xiàn)象[5]。目前，腎癌尚缺乏長期有效的治療方法，因此，尋找特異的、有效的生物指標(biāo)對治療和改善腎癌患者的預(yù)后具有重要意義。

近年來，研究證實偽基因不僅存在于實體惡性腫瘤中，也可在液體腫瘤中檢測到[6-7]；研究也已發(fā)現(xiàn)很多偽基因在多種腫瘤中發(fā)生突變并與患者預(yù)后相關(guān)，具有作為腫瘤患者預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能[8]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤生物學(xué)過程中也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，并有可能作為腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷[9-10]。我們的前期研究已報道了45個偽基因和27個lncRNAs在腎癌患者血漿中差異表達，且與腎癌患者預(yù)后相關(guān)[11]，本研究對相關(guān)性最顯著的前10個偽基因(PLEKHA8P1、OR2A9P、CXCR2P1、KLRAP1、PDXDC2P、SPACA6P、RNF216P、CFL1P1、FER1L4、PIPSL)和前8個lncRNA(TLX1NB、LINC00623、LINC001565、CDKN2A-AS1、DIO3OS、LINC00482、FAM225B、HAR1A)作進一步分析和驗證,分析它們在腎癌發(fā)展中的功能以及與患者預(yù)后的關(guān)系，以探索腎癌的無創(chuàng)性篩查指標(biāo)和評估預(yù)后的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 病例

收集2016年11月至2019年4月本院病理科確診為腎癌患者50例，年齡30～89歲，中位年齡62歲；對照組26例同期體檢健康者，年齡20～77歲，中位年齡61歲。所有腎癌患者在采血前無其他腫瘤病史且術(shù)前均未行放射或化學(xué)藥物治療，術(shù)后病理診斷明確，手術(shù)后順利出院并且在住院期間無死亡。本研究獲得本院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有檢測樣本均在采血前征得研究對象的知情同意。

1.2 細胞系及培養(yǎng)

人胚腎上皮293T細胞系和腎癌786-O細胞系源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，分別用含10% 胎牛血清的RPMI DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2溫箱中進行培養(yǎng)。

1.3 儀器與試劑

大型臺式離心機、低溫高速離心機(美國賽默飛世爾科技公司)；普通PCR儀和QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Trizol試劑(美國Life Technologies公司)；REV、GAG、VSVG質(zhì)粒(上海漢恒生物科技有限公司)；qRT-PCR相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄及擴增試劑盒(南京諾唯贊有限公司)；細胞RNA快速提取試劑盒(上海超研生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM、RPMI 1640和CCK-8試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；隨機引物(日本TaKaRa公司)；引物序列均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 血漿樣本采集與處理 采用乙二胺四乙酸抗凝的15 mL離心管收集受試者空腹靜脈血標(biāo)本5 mL,于4℃大型臺式離心機5 000×g離心10 min后，用移液器吸取上層血漿850 μL至1.5 mL無酶EP管內(nèi)，再置于4℃高速離心機12 000×g離心10 min，移液器吸取上清液轉(zhuǎn)至新的EP管中，存儲于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血漿RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 取出凍存血漿，解凍后用常規(guī)Trizol試劑提取血漿總RNA，用核酸蛋白紫外檢測儀測定所提取的總RNA濃度和純度，遵照血漿逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA 保存于-20℃冰箱或直接用于后續(xù)實驗。反應(yīng)條件：25℃ 10 min，42℃ 45 min，85℃ 5 min，4℃ 2 min。

1.4.3 細胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 胰酶消化處理并收集786-O細胞，按組織/細胞RNA快速提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，測定總RNA濃度和純度，隨后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 保存于-20℃冰箱或直接用于后續(xù)實驗。反應(yīng)條件：50℃ 15 min，85℃ 2 min，4℃ 2 min。

1.4.4 qRT-PCR 選擇5S RNA作為內(nèi)參，參考qRT-PCR試劑盒說明書加樣，取3～4個復(fù)孔。采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。血漿qRT-PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Green預(yù)混液5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，雙蒸水3 μL。反應(yīng)程序：95℃ 1 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。細胞qRT-PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Green預(yù)混液10 μL，ROX參比染料0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，雙蒸水7.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)條件均設(shè)為95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s；通過熔解曲線評估引物的特異性。

表1 檢測基因引物序列

1.4.5 差異表達基因與腎癌患者預(yù)后分析 進入cBioPortal(https:∥www.cbioportal.org/)，oncolnc(http:∥www.oncolnc.org/)，GEPIA(http:∥gepia.cancer-pku.cn/)，UALCAN(http:∥ualcan.path.uab.edu/)，Kaplan-Meier plotter(https:∥kmplot.com/analysis/)等數(shù)據(jù)庫，選擇或下載腎細胞癌(kidney renal cell carcinoma)臨床信息數(shù)據(jù)，輸入目的偽基因和lncRNA，選擇survival進行生存分析。

1.4.6 MPH-dCase9介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控實驗 用REV、GAG、VSVG質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒載體，攜載目的質(zhì)粒感染密度為70%～80%的293T細胞，48 h后用EP管收集培養(yǎng)基，300×g離心5 min后將上清液轉(zhuǎn)至新的EP管，即獲得目的質(zhì)粒病毒液；用該病毒液轉(zhuǎn)染786-O細胞，加入適當(dāng)濃度嘌呤霉素篩選能夠穩(wěn)定表達目的質(zhì)粒的細胞。依此方法依次將dCase9、MPH、目的基因gRNA-FER1L4和gRNA-DIO3OS導(dǎo)入786-O細胞，PCR驗證轉(zhuǎn)染后786-O細胞中FER1L4和DIO3OS的表達。

1.4.7 CCK-8增殖實驗觀察目的基因上調(diào)后786-O細胞的增殖活性 收集密度80%～90%的786-O細胞，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，按10 000個細胞/孔接種到96孔板中，每組細胞4個復(fù)孔，設(shè)空白對照組，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2～4 h使細胞貼壁；加入10 μL CCK-8試劑，放入37℃溫箱孵育1 h，使用酶標(biāo)儀(450 nm)測量其光密度(D)值作為0 h的結(jié)果。隨后每24 h通過相同方法測定D值。相對增殖活性=(實驗組D值-空白對照D值)/(對照組D值-空白對照D值)。

1.4.8FER1L4和DIO3OS的miRNA靶標(biāo)預(yù)測及分析 進入StarBase version 3.0數(shù)據(jù)庫(http:∥starbase.sysu.edu.cn/)，輸入目的基因FER1L4和DIO3OS進行miRNA靶標(biāo)預(yù)測，并分析預(yù)測的miRNA在腎癌組織與正常組織中的表達情況；在Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(https:∥kmplot.com/analysis/)輸入相應(yīng)目標(biāo)miRNA，選擇腎癌樣本，分析miRNA表達與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS Statistics 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8軟件進行圖像繪制。選用雙側(cè)t檢驗進行兩獨立樣本比較分析，以P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌患者血漿偽基因和lncRNA表達水平

實時熒光定量PCR結(jié)果表明，50例腎癌患者和26例體檢健康者的血漿樣本10個偽基因和8個lncRNA中，有5個偽基因和3個lncRNA差異表達，即偽基因：PLEKHA8P1(t=4.591，P<0.05)，CXCR2P1(t=16.134，P<0.01)，KLRAP1(t=4.033，P<0.05)，PDXDC2P(t=8.492，P<0.01)，F(xiàn)ER1L4(t=4.523，P<0.05)均高表達。lncRNA：TLX1NB(t=6.261，P<0.01)、DIO3OS(t=6.701，P<0.01)高表達；LINC00482(t=3.925，P<0.05)低表達。見圖1。

#：P<0.05，*：P<0.01

2.2 差異表達偽基因和lncRNA與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系

通過cBioPortal、GEPIA、oncolnc、UALCAN等數(shù)據(jù)庫分析差異表達的5個偽基因和3個lncRNA在腎癌臨床樣本中的突變、表達與腎癌患者預(yù)后關(guān)系。結(jié)果顯示偽基因PLEKHA8P1、CXCR2P1、FER1L4和lncRNALINC00482、TLX1NB、DIO3OS發(fā)生不同頻率的突變(圖2)，且與患者總體生存期相關(guān)(圖3)，其中，偽基因CXCR2P1、FER1L4和lncRNATLX1NB突變還與患者無病生存期相關(guān)(圖4)。此外，偽基因PLEKHA8P1、KLRAP1、PDXDC2P、FER1L4和lncRNADIO3OS在腎癌中高表達與患者不良預(yù)后相關(guān)，TLX1NB低表達與患者不良預(yù)后相關(guān)，見圖5。LINC00482表達與患者預(yù)后無關(guān)(P=0.73)。

圖2 偽基因和lncRNA的突變頻率

圖3 基因突變與總體生存期的關(guān)系

圖4 基因突變與無病生存期的關(guān)系

2.3 成功在786-O細胞系中上調(diào)FER1L4和DIO3OS表達

本研究通過MPH-dCase9介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控實驗，使dCase9和MPH成功導(dǎo)入786-O腎癌細胞系，即獲得786-OdCase9+MPH+細胞系，通過慢病毒載體分別攜載gRNA-FER1L4和gRNA-DIO3OS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-OdCase9+MPH+細胞，使其在該細胞系中過表達。PCR結(jié)果顯示FER1L4(t=5.702，P<0.01)和DIO3OS(t=10.954，P<0.01)在實驗組細胞的表達明顯高于母系786-OdCase9+MPH+細胞，見圖6。

2.4 FER1L4和DIO3OS的異常表達與腎癌增殖密切相關(guān)

基于目前對偽基因FER1L4和lncRNADIO3OS在腫瘤中的研究相對較多，我們對兩者在腎癌發(fā)展中的功能作了進一步研究。分析TCGA臨床樣本發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，F(xiàn)ER1L4和DIO3OS在腎癌組織中高表達，見圖7；CCK-8實驗結(jié)果顯示FER1L4和DIO3OS上調(diào)可促進腎癌細胞增殖，見圖8。

圖5 基因在腎癌中的表達與總體生存期的關(guān)系

*：P<0.01

2.5 FER1L4和DIO3OS在腎癌中分別通過調(diào)節(jié)hsa-miR-556-5p和hsa-miR-660-5p而發(fā)揮功能

我們通過StarBase Version 3.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測了FER1L4和DIO3OS的miRNA靶基因，分別獲得24個和13個miRNA；其中，在腎癌中與FER1L4呈負(fù)相關(guān)的miRNA有2個，即hsa-miR-556-5p(r=-0.150,P=6.49×10-4)和hsa-miR-874-3p(r=-0.389,P=4.18×10-20)，而與DIO3OS呈負(fù)相關(guān)的miRNA為hsa-miR-660-5p(r=-0.133,P=2.52×10-3)。進一步的分析結(jié)果表明3個miRNA在腎癌組織中的表達均較正常組織明顯降低，見圖9。通過Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫進一步分析3個miRNA與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示hsa-miR-556-5p和hsa-miR-660-5p低表達與患者不良預(yù)后相關(guān)，而hsa-miR-874-3p表達與患者預(yù)后無關(guān)，見圖10。綜上所述，hsa-miR-556-5p和hsa-miR-660-5p可能是FER1L4和DIO3OS在腎癌中的潛在作用靶點。

*：t=21.130，P<0.01；#：t=2.682，P<0.05

*：t=6.786，P<0.01；#：t=4.221，P<0.05

3 討論

偽基因是與已知的編碼基因序列非常相似的片段，這些編碼基因稱為母基因或真基因，據(jù)HGNC數(shù)據(jù)庫(https:∥www.genenames.org/)最新統(tǒng)計，已有13 511個偽基因被發(fā)現(xiàn)。偽基因具有過早的終止密碼子、缺失、插入和突變而缺乏母基因編碼蛋白質(zhì)或多肽的功能，因而曾被認(rèn)為是生物分子過程中無關(guān)緊要的基因片段[12]。然而，隨著首個偽基因PTENP1的功能鑒定和報道，偽基因在人類疾病尤其是腫瘤中的功能逐漸受到關(guān)注[8，13]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌樣本中偽基因RACGAP1P表達水平較正常肝組織明顯升高，且與腫瘤大小、臨床分期、甲胎蛋白水平、早期復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)。類似地，Weng等[15]研究結(jié)果顯示胃癌組織偽基因PTTG3P較正常組織表達明顯升高，PTTG3P高表達可促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)；此外，PTTG3P高表達還與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)[16]。這些結(jié)果提示偽基因在腫瘤組織中表達異常，具有作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物的潛能。與偽基因類似，lncRNA也曾被認(rèn)為是不發(fā)揮作用的長度大于200 bp且不具備蛋白編碼功能的轉(zhuǎn)錄本。然而，隨著研究的深入，lncRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤生物過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用甚至是關(guān)鍵作用，而且lncRNA的功能仍不斷被揭示[17-18]。目前，已有大量研究顯示lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個方面發(fā)揮作用，包括腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、凋亡、化療藥物及靶向藥物耐藥等[19]。因而lncRNA很有可能成為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，以及為腫瘤治療提供特異性靶點。

圖9 hsa-miR-556-5p、hsa-miR-660-5p和hsa-miR-874-3p在TCGA腎癌樣本中的表達

圖10 hsa-miR-556-5p、hsa-miR-874-3p和hsa-miR-660-5p與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系

已有許多文獻報道在血漿中也可檢測到異常表達且較為穩(wěn)定的偽基因和lncRNA，可作為無創(chuàng)性檢測方法[20-22]。本研究在腎癌患者血漿中檢測到偽基因PLEKHA8P1、CXCR2P1、FER1L4、KLRAP1、PDXDC2P和lncRNATLX1NB、DIO3OS均高表達，并與患者預(yù)后顯著相關(guān)，而LINC00482在腎癌患者血漿中表達下降，但LINC00482和TLX1NB與總體生存期的關(guān)系與血漿檢測結(jié)果的預(yù)期不符，因而LINC00482和TLX1NB不作為我們進一步深入研究的目的基因。

有文獻報道偽基因FER1L4在膠質(zhì)瘤中高表達，并與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)，可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后風(fēng)險信號之一；另外，miR-372高表達可導(dǎo)致FER1L4和E2F1下調(diào)，從而可抑制細胞周期進程進而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖[23-24]；因此，F(xiàn)ER1L4不僅與預(yù)后相關(guān)，還與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CXCR2P1僅在肝細胞癌差異基因分析中報道可能作為肝癌分期的特異指標(biāo)之一，而偽基因PLEKHA8P1僅被報道在一名10歲智能障礙男孩12號染色體上出現(xiàn)缺失[25]，PDXDC2P僅在心力衰竭中被報道[26]，它們在腫瘤中的研究尚未見報道。關(guān)于偽基因KLRAP1相關(guān)研究尚未見報道。已有文獻報道lncRNADIO3OS在胰腺癌組織和細胞中均高表達，DIO3OS通過與miR-122直接結(jié)合并抑制其表達進而促進胰腺癌細胞增殖和侵襲，發(fā)揮促癌基因的作用[27]；DIO3OS也與肝細胞癌預(yù)后相關(guān)，可能為肝細胞癌預(yù)后標(biāo)志物[28]。內(nèi)源性競爭RNA是lncRNA和偽基因的重要調(diào)節(jié)機制[29]，而這些研究結(jié)果也提示FER1L4和DIO3OS作為內(nèi)源性競爭RNA與miRNA結(jié)合進而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。

本研究對腎癌樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)FER1L4和DIO3OS在腎癌組織中高表達且與患者不良預(yù)后相關(guān)；體外實驗結(jié)果表明它們的過表達還可促進腎癌細胞增殖。進一步探索它們的機制顯示FER1L4和DIO3OS可能是分別通過調(diào)節(jié)hsa-miR-556-5p和hsa-miR-660-5p而發(fā)揮作用。

綜上所述，偽基因PLEKHA8P1、CXCR2P1、KLRAP1、FER1L4、PDXDC2P和lncRNADIO3OS可能作為腎癌的無創(chuàng)性分子生物指標(biāo)。然而，目前對偽基因PLEKHA8P1、CXCR2P1、KLRAP1、PDXDC2P的研究還很少，它們在腫瘤生物過程中的作用尚不清楚，因此有待于更多的研究和樣本進一步論證；而偽基因FER1L4和lncRNADIO3OS在腎癌中的作用和機制也需更多實驗數(shù)據(jù)進一步證實和支持。