腸溶性白藜蘆醇電紡纖維的制備、性能及其體外抗氧化活性

周 軍，向 舒，鄧 姣，劉 鑫，李湘洲,*

（1.中南林業科技大學材料科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.中南林業科技大學天然產物加工利用研究所，湖南 長沙 410004）

隨著人們生活水平的提高，食品的營養、質量和安全越來越備受關注。通過向食品中添加如VE、姜黃素、白藜蘆醇（resveratrol，Res）等功能因子，有助于提高食品的品質[1-3]。Res是一種天然的多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖、桑葚等植物中[4-5]，具有明顯的抗氧化、抗炎、預防衰老等功能活性[6-7]，被譽為“100 種最熱門有效抗衰老物質”之一[8]。Res是脂溶性成分，其水溶性差、遇光和熱等不穩定，導致Res在人體內的吸收差、生物利用度低，這些都限制了Res的廣泛開發與應用[9]。

通過乳劑制備技術、微膠囊技術等[10-11]可以將脂溶性成分包裹在親水性結構中，以提高脂溶性成分的水溶性和穩定性。近年來，新的包封技術不斷涌現，包括靜電紡絲技術等[12]。靜電紡絲是一種利用靜電作用使聚合物溶液產生纖維的新型納米封裝方法，其制備的纖維粒徑在十到數百納米之間。納米纖維具有比表面積大、孔隙率高、承載能力強、包封效率高等優點，是一種理想的包封體系[13]。此外，由于靜電紡絲一般在中等溫度下進行，因此對所包封的熱不穩定抗氧化成分活性的影響較小[14]。

生物高分子材料如環糊精及其衍生物、蛋白和多糖等[15-16]常被用于靜電紡絲中制備納米藥物封裝體系的基材，其中羥丙基-β-環糊精（hydroxypropyl-betacyclodextrin，HB-β-CD）是一種生物相容性極好的環糊精衍生物，其不僅能有效提高脂溶性成分的溶解度和穩定性，還能增強納米纖維的可紡性[17]。然而，環糊精材料本身不具有pH值敏感特性，往往不能實現靶向遞送的目的。因此，需要對環糊精材料進行化學改性，改性方法主要包括接枝改性、交聯反應和共混改性等。共混改性是指向基材中加入pH值敏感材料，通過適宜的技術制備藥物封裝體系的方法，因具有簡便易行、效果好等優點而被廣泛應用[18-19]。

本實驗以HB-β-CD和Res形成的包合物為基礎，加入聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和水楊酸（salicylic acid，SA）后共混得到電紡前驅液，利用靜電紡絲技術制備負載Res的電紡纖維SA/NFs-Res，優化電紡前驅液的配方，獲得具有良好穩定性和抗氧化活性的Res電紡纖維，促進其在模擬腸液中的釋放，為Res功能產品的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

98% Res 湖南健源生物科技有限責任公司；HP-β-CD（食品級） 山東智源生物技術有限公司；PVP、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、鹽酸和SA（均為分析純） 國藥化學試劑有限公司；溴化鉀（光譜級）美國Sigma公司；2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機 昆山美美超聲儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；NANON-01A靜電紡絲機 日本MECC公司；Sigma HD場發射掃描電子顯微鏡 德國Zeiss公司；Auto Cressington 108濺射涂布機 英國Cressington科技公司；Alpha傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀美國Bruker公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司；RC-3溶出度測定儀 天津新天光分析儀器技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Res電紡纖維的制備

精密稱取定量HP-β-CD溶于10 mL無水乙醇中，室溫下攪拌至溶液透明，按要求分別加入投料比為0%、5.00%和10.00%（占固形物總質量的比例）的Res，繼續攪拌至其完全溶解，添加0.15 mL SA飽和液，快速攪拌30 min，再加入一定量的PVP繼續攪拌0.5～1.0 h至完全溶解。將制備好的電紡溶液超聲處理30 s，排除氣泡。NANON-01A靜電紡絲機制備Res電紡纖維，用規格為5 mL的醫用無菌注射器吸取適量電紡液并安裝至靜電紡絲機內，設置電壓26.5 kV、流速0.2 mL/h、收集間距12.3 cm、針頭清洗頻率15 s/次、溫度（25±5）℃、相對濕度（50±5）%，通過鋁箔錫紙收集制備的樣品。

1.3.2 SEM分析

對待測樣品表面進行噴金處理，所有樣品均在0.06 mA噴金20 s，制備樣品，利用場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）對樣品的形貌進行掃描分析，掃描加速電壓為5 kV，放大倍率分別為3 000、10 000。利用Nano Measurer Software軟件對SEM掃描得到的圖片進行處理，隨機選擇SEM圖像，測量每個圖像中100 條單個纖維的粒徑，得到樣品粒徑分布圖、樣品平均粒徑和標準方差。

1.3.3 水溶性相關性能測定

采用相溶解度法測定Res的溶解度[20-21]，精確稱取過量待測樣品加入至1 mL H2O中，密封后在37 ℃的條件下放置于恒溫振蕩箱中，振蕩3 d，振蕩過程中連續或間歇攪拌以促進固體的溶解，直至達到固液平衡狀態，靜置，吸取飽和上清液并利用紫外分光光度法在305 nm波長處測定并獲得Res的溶解度。

負載率及包封率的測定：精確稱取一定量的待測樣品溶于500 mL乙醇中，并將溶液稀釋100 倍，超聲處理30 s，利用紫外分光光度法在305 nm波長處測定吸光度，并按標準曲線A＝0.131 5ρ-0.000 4（R2＝0.999 6，A為吸光度，ρ為質量濃度/（mg/mL））計算樣品中Res的含量。按式（1）和式（2）分別計算樣品的負載率和包封率[22]。

含水率的測定：精密稱取一定量的樣品置于冷凍干燥機中至干燥恒質量后，再測定樣品的質量，按式（3）計算樣品的含水率。

式中：m0為樣品初始稱取的質量/g；m為樣品中Res的理論投料量/g；m1為樣品中實際包封的Res質量/g；m2為樣品干燥至恒質量后的質量/g。

1.3.4 FTIR分析

利用溴化鉀壓片法對待測樣品進行壓片，室溫下，利用FTIR儀對樣品進行測試表征，設定檢測光譜范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描32 次。

1.3.5 DSC分析

室溫下，稱取5～10 mg樣品置于定位坩堝中制樣，封入鋁板中。通過DSC儀在30～350 ℃范圍內進行檢測分析，記錄樣品的差示掃描量熱曲線。升溫降溫速率均為10 ℃/min。整個實驗在氮氣保護下進行，氮氣流速50 mL/min，壓強0.5 MPa。

1.3.6 體外釋放性能測定

利用透析法測定體外釋放效果[23-24]。精確稱取含10 mg Res的NFs-Res（不含SA的負載Res納米纖維，102.69 mg）、SA/NFs-Res（103.84 mg）和10 mg純Res樣品分別分散在5 mL的緩沖溶液中，然后置于預處理后的MD3500透析袋內，兩端封閉后置于500 mL pH值分別為1.0和7.4的模擬胃液、模擬腸液中，在50 r/min、37 ℃下攪拌。按照預定的時間間隔，分別在15、30、60、120、240、360、480、600、720 min和1 440 min時從溶出介質中取出5.0 mL樣品，并立即加入37 ℃的等量新鮮介質以保持溶液體積恒定。利用紫外分光光度計在305 nm波長處測定吸光度，得到樣品在相應介質中的釋放曲線。

1.3.7 體外抗氧化活性測定

通過經典的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除實驗對樣品的體外抗氧化活性進行評價[25]。配制79 mg/L的DPPH-乙醇溶液，低溫下避光保存備用。分別取定量的純Res和SA/NFs-Res溶于乙醇中，使兩者的Res終質量濃度均分別為200、400、600、800、1 000 μg/mL。取0.5 mL待測樣品，加入5.0 mL DPPH-乙醇溶液，振蕩均勻后于37 ℃下反應1 h，以不加待測樣品的DPPH-乙醇溶液為空白，在517 nm波長處進行測定吸光度，按式（4）分別計算樣品對DPPH自由基的清除率[26]。

式中：A樣品為樣品反應后在517 nm波長處的吸光度；A空白為DPPH-乙醇在517 nm波長處的吸光度。

分別配制3.84 g/L的ABTS-乙醇溶液和1.34 g/L的過硫酸鉀溶液，兩者按體積比為1∶1混合，置于暗處避光12 h后即得ABTS陽離子自由基溶液，低溫下避光保存備用。臨用前將上述溶液稀釋得到在734 nm波長處吸光度為0.7的工作液。分別取定量的純Res和SA/NFs-Res溶于乙醇中，使兩者的Res實際質量濃度均分別為40、60、80、100、120 μg/mL。取0.5 mL待測樣液，加入10.0 mL ABTS陽離子自由基溶液并混合均勻，在37 ℃下反應1 h，以不加待測樣品的ABTS-乙醇溶液為空白，在734 nm波長處進行比色，按式（5）分別計算樣品對ABTS陽離子自由基的清除率[27]。

式中：A樣品為樣品反應后在734 nm波長處的吸光度。

1.4 數據統計與分析

所有數據均采用Origin 8.0軟件進行數據分析與作圖，每組實驗設置3 次平行實驗，結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 配方優化結果

按1.3.1節中所述方法，以靜電紡絲制備纖維的粒徑分布和形貌特征為指標，研究了前驅液中PVP、HP-β-CD添加量以及Res投料比對電紡纖維形貌的影響，結果見表1。

表1 不同配方條件下的電紡纖維形貌特征Table 1 Morphological characteristics of electrospunning fibers under different formulations

由表1可知，固定PVP用量為2.00 g、Res投料比為5%，當HP-β-CD用量為0.50 g時，電紡纖維的粒徑較小，但纖維呈紡錘狀，形貌不均一且離散程度較大；當HP-β-CD的用量為1.00 g時，纖維粒徑增大，但仍屬于納米級，且纖維表面較光滑，形貌均一；當HP-β-CD的用量為1.50 g時，雖然纖維成絲性和均勻性更好，但纖維粒徑已接近微米級，且離散程度增大；繼續增大HP-β-CD的用量，纖維粒徑增大至微米級，并出現一定程度的扭結現象。當固定PVP與HP-β-CD的用量時，增大Res的投料比，電紡纖維的粒徑逐步增大，表面光滑性和均勻性逐漸降低，當Res的投料比為10.00%時，纖維粒徑為（748.53±84.01）nm，纖維表面較光滑，纖維之間有少許纏結。根據形貌特征和Res的負載效果，初步確定電紡液配方中PVP用量為2.00 g、HP-β-CD的用量為1.50 g，Res的投料比為10.00%。

2.2 SEM分析結果

在2.1節的優化配方條件下，以配方5和配方6為基礎，按1.3.1節中所述方法分別摻入0.15 mL SA飽和溶液，制備得到含SA的空白纖維（SA/NFs）和含SA的SA/NFs-Res，并對上述2 種纖維和純Res的形貌進行SEM觀察，利用Nano Measurer Software軟件分別對SEM圖進行處理，得到樣品的粒徑分布，結果見圖1。

圖1 電紡纖維SEM分析Fig. 1 SEM analysis of electrospinning fibers

由圖1可知，純Res為細長型的晶體結構，大小分布不均勻，而SA/NFs表面較粗糙、形貌均一，平均粒徑為（539.23±114.36）nm。加入10%的Res后制備的SA/NFs-Res的平均粒徑增大至（776.59±131.22）nm，離散程度也隨之變大，但纖維表面較光滑，纖維之間有少量纏結現象，這可能是由于Res的加入增大了電紡溶液的黏度。電紡溶液黏度是影響纖維形貌的重要因素之一。當溶液黏度達到某一臨界值時，溶液射流由于分子鏈間纏結程度的增加而被電場力拉伸，并具有較長的松弛時間，纏結的分子鏈沿射流產生軸向取向化，有效地抑制了射流中一些分子鏈的斷裂，因此得到了連續的電紡纖維結構[28]。當溶液的分子鏈高度纏結后，受力拉伸相對均勻，由于表面電荷和電場力的作用，射流在電場中而發生鞭動，溶劑揮發并固化成纖維。通過形態學觀察表明，具有不規則晶體結構的Res通過靜電紡絲后變成光滑均一的電紡纖維。

2.3 物理性能分析結果

表2 電紡纖維的物理性能Table 2 Physical properties of electrospinning fibers

由表2可知，通過靜電紡絲技術制備的SA/NFs-Res中Res的包封率為（96.32±1.06）%、負載率（9.63±1.07）%，說明納米纖維對Res具有較高的包封率和負載率。在37 ℃下，SA/NFs-Res中Res在水中的相平衡溶解度為（18.88±0.34） mg/mL，較純Res的溶解度提高了近630 倍。這主要與HP-β-CD的增溶作用和納米纖維具有更大的比表面積有關[29-30]。水溶性的增大將有效促進Res在人體的吸收與利用。SA/NFs-Res含水率為（4.77±0.19）%，納米纖維含水率較低，易于保存。

2.4 FTIR分析結果

圖2 電紡纖維FTIRFig. 2 FTIR of electrospinning fibers

由圖2可知，純Res的FTIR曲線中3 230 cm-1附近為酚羥基吸收峰，1 582 cm-1和1 507 cm-1附近為芳環上的C＝C伸縮振動，965 cm-1附近為反式—C＝C—吸收峰[31]，這些特征吸收峰在物理混合物的FTIR圖中均有體現。說明在物理混合物中，各原料和Res之間并未發生化學作用，只是簡單的物理混合，分子間作用力形式未發生改變[32]。與SA/NFs的FTIR圖相比，SA/NFs-Res不僅具有SA/NFs所有的特征吸收峰，其在1 582 cm-1和1 507 cm-1附近也出現較弱的特征吸收峰，分別對應于純Res中1 582 cm-1和1 507 cm-1處的吸收峰，且SA/NFs-Res未出現新的特征吸收峰，說明Res與載體之間未發生化學反應，而是通過物理作用力被包裹于電紡纖維中。

2.5 DSC分析結果

圖3 電紡纖維DSC分析Fig. 3 DSC analysis of electrospinning fibers

由圖3可知，純Res粉末在大約266.98 ℃附近顯示出尖銳的吸熱峰，這與Res的熱分解溫度相對應[33]，而SA/NFs-Res在此溫度下沒有明顯的吸熱峰，熔融峰消失，說明Res和HP-β-CD/PVP載體形成了混合物，SA/NFs-Res中Res的存在形式為非晶體結構[32]。加入Res后制備的SA/NFs-Res，其玻璃化轉變溫度（Tg）由112.60 ℃升高至117.46 ℃，比SA/NFs的Tg升高將近4.86 ℃，這可能是由于混合在SA/NFs中的Res會阻礙纖維分子鏈片段的移動，從而導致玻璃化轉變溫度升高[19]。

2.6 Res電紡纖維體外釋放性能

圖4 電紡纖維體外釋放效果Fig. 4 In vitro release curves of loaded Res from electrospinning fibers

由圖4可知，純Res在模擬胃液和模擬腸液的釋放效果基本一致，4 h內，Res的釋放速度較快，其累積釋放率分別達到29.28%和26.49%，純Res主要通過擴散作用溶解于介質中[34]，而后溶解趨勢逐漸趨于平穩，說明純Res對模擬胃液和模擬腸液不敏感。NFs-Res中Res在模擬腸液中的累積釋放率略高于同期在模擬胃液中的累積釋放率，與純Res的釋放效果相比，其在模擬腸液和模擬胃液中均表現出明顯的緩釋作用，4 h內NFs-Res中Res的累積釋放率分別為10.04%和12.06%，均低于同期純Res在模擬腸液和模擬胃液中的累積釋放率，這可能是由于釋放過程中，納米纖維中的PVP和HP-β-CD溶解于介質后，包封在其中的Res才能釋放出來。SA/NFs-Res在模擬胃液中具有緩釋效果，4 h內，Res的累積釋放率僅為9.84%；而在模擬腸液中的釋放較快，8 h內Res的累積釋放率達到29.30%，24 h內Res的累積釋放率42.80%，這可能是由于納米纖維在模擬腸液（pH 7.4）溶解的過程中，包封在其中的SA在弱堿介質中發生反應，加速了纖維的崩解，使Res快速從納米纖維中釋放出來[35]。結果表明，通過靜電紡絲技術制備的SA/NFs-Res具有一定的腸溶敏感特性，能在模擬胃液中緩釋而在模擬腸液中實現快速釋放。

2.7 Res電紡纖維體外抗氧化活性

圖5 電紡纖維對DPPH自由基的清除效果Fig. 5 Scavenging effect of electrospunning fibers on DPPH radicals

圖6 電紡纖維對ABTS陽離子自由基的清除效果Fig. 6 Scavenging effect of electrospunning fibers on ABTS cation radicals

由圖5和圖6可知，隨著Res質量濃度的提高，純Res和SA/NFs-Res對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率均呈上升趨勢，相同質量濃度下，SA/NFs-Res對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除率略高于純Res。通過擬合得到純Res清除DPPH自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為410.49 μg/mL，而SA/NFs-Res清除DPPH自由基的IC50為403.21 μg/mL；純Res清除ABTS陽離子自由基的IC50為39.72 μg/mL，SA/NFs-Res清除ABTS陽離子自由基的IC50為38.97 μg/mL。綜上，靜電紡絲制備的SA/NFs-Res抗氧化能力略高于純Res。這可能是由于相對于游離態的Res，SA/NFs-Res在反應介質中具有較大的表面積所致[36]。上述結果表明利用靜電紡絲制備的SA/NFs-Res性能穩定，具有良好的體外抗氧化活性。

3 結 論

本實驗利用靜電紡絲技術制備了負載Res的電紡纖維，通過優化電紡前驅液中PVP、HB-β-CD和Res的用量，獲得適宜的制備工藝：PVP為2.00 g、HB-β-CD為1.00 g和Res的投料比10.00%，在上述配方中摻入0.15 mL SA飽合溶液制備的SA/NFs-Res中Res包封率為96.32%，負載率為9.63%，水中溶解度為18.88 mg/mL，較純Res提高近630 倍。

利用SEM、FTIR、DSC技術對SA/NFs-Res的性能進行表征，結果表明，Res成功地負載于電紡纖維中，纖維表面光滑、均一，粒徑為（776.59±131.22） nm，其熱力學性質更穩定。SA/NFs-Res的抗氧化能力高于未包封前的純Res的抗氧化能力，其清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的IC50分別為403.21 μg/mL和38.97 μg/mL。SA/NFs-Res具有一定的pH值響應性，其在模擬胃液環境下保持緩釋，而在模擬腸液中釋放速度較快，具有促進Res在模擬腸液中的吸收及提高其生物利用度的潛在作用，在功能食品、保健品和藥品輸送載體方面具有較好的應用前景。