不同方式干制龍眼果肉的粗多糖理化及生化特性比較

王詩琪，黃曉蕓，易 陽,*，黃 菲，王麗梅，王宏勛

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東 廣州 510610；3.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023）

作為代表性的亞熱帶水果和藥食同源食品，龍眼（Dimocarpus longan Lour.）具有較高的營養價值和獨特的風味，尤其是含有豐富的活性多酚和多糖，深受消費者喜愛[1-2]。龍眼鮮果采收上市時間集中且極易褐變腐爛，大部分通過干制以實現農產品保藏與轉化[3-4]，故干制加工技術研發對產業發展有重要現實意義。近年來，龍眼干制技術研究的方向發生明顯轉變，即由“高效節能技術的設計與創新”[5-7]轉向“基于高品質產品制備的技術評價與優化”[8-9]。目前，對于龍眼干果肉的品質控制研究主要側重于其食用特征（色澤、質地、外形、風味等）、基本營養成分以及抗氧化活性多酚的工藝影響[3-4,8-10]，而對果肉營養功能有重要貢獻的多糖則鮮有關注。

現代藥理學研究證實，龍眼果肉多糖具有良好的抗氧化、抗腫瘤和免疫調節活性[2,11]。而本課題組前期研究發現，具有免疫調節活性的龍眼多糖含有少量蛋白質或氨基酸[12-13]，這部分氨基化合物可能是在果肉熱風干制過程中與多糖通過美拉德反應共價結合，并在一定程度上增強多糖的體外免疫刺激活性[14-17]。Huang Fei[18]和郭亞娟[19]等研究發現，不同方式干制荔枝果肉中多糖的理化特征、抗氧化和免疫調節活性呈現顯著差異。直接的多糖提取液干制研究發現，因溫度、時間和脫水機理等的差異，不同方法干制所得多糖的結構和活性有明顯區別[20-23]。龍眼干果肉中多糖的存在狀態對于其營養功能品質提升有重要意義，而不同干制方法對多糖理化特征和功能活性的影響鮮見報道。為此，本實驗采用熱風、真空、紅外和冷凍方法分別干制龍眼果肉，提取分離其多糖組分，分析粗多糖的理化及生化特性，明確干制方式對龍眼果肉中多糖的影響，旨為龍眼果肉干制品質“提質增效”提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮龍眼（‘儲良’）購于茂名市粵云山農業發展有限公司。

鄰苯二甲醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮 北京化學試劑公司；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍試劑盒 南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrythydrazyl，DPPH） 東京化成工業株式會社；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 北京博奧拓達科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

人源胃癌細胞SGC7901、人源肝癌細胞HepG2、小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 湖北百奧斯生物科技有限公司；細胞活力檢測試劑盒CCK-8 南京恩晶生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）酶聯免疫試劑盒 武漢基因美科技有限公司；α-淀粉酶（酶活力50 U/g）、胃蛋白酶（1∶30 000）、胰酶（1∶4 000） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏設備有限公司；12N冷凍干燥儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；WS70-1紅外快速干燥箱 杭州齊威儀器有限公司；SUNRISE酶標定量測定儀 瑞士Tecan公司；NEXUS-670傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，FTIR）光譜儀 美國尼高力儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；1260高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）系統、ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、PL aquagel-OH 40色譜柱（7.5 mm×300 mm，8 μm） 美國Agilent公司；DAWN HELEOS-II18多角度激光光散射（multi-angle laser light scattering，MALLS）檢測器和Optilab rEX示差折光率（refractive index，RI）檢測器 美國Wyatt公司。

1.3 方法

1.3.1 龍眼果肉干制及其粗多糖制備

1.3.1.1 龍眼果肉干制

熱風干制（hot-air drying，HD）：參考徐玉娟等[9]的方法，將龍眼果實采用60 ℃熱風干制60 h，干制過程中間隔12 h靜置回軟12 h（回軟時間不計入干制時間），干制果實于-20 ℃冰箱保存備用。

真空干制（vacuum drying，VD）：參考肖維強等[24]的方法，將龍眼果實在80 ℃（真空度不高于0.07 MPa）下初焙12 h，在65 ℃（真空度不高于0.07 MPa）下復焙42 h，干制過程中間隔12 h靜置回軟處理12 h，干制果實于-20 ℃冰箱保存備用。

紅外干制（infrared drying，ID）：將龍眼果實在500 W功率下輻射干制6 h，干制過程中間隔1 h靜置回軟處理3 h，干制果實于-20 ℃冰箱保存備用。

冷凍干制（freeze drying，FD）：將龍眼果實置于-20 ℃預凍12 h，在真空度約51 Pa及冷阱溫度約-40 ℃的條件下干制39 h，干制果實于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.1.2 龍眼粗多糖制備

參考韓苗苗等[14]的方法提取制備龍眼多糖（longan polysaccharide，LP）。從新鮮（fresh，F）、熱風干制、真空干制、紅外干制和冷凍干制的果肉中制備所得的粗多糖分別記為FLP、HDLP、VDLP、IDLP和FDLP。

1.3.2 龍眼粗多糖的理化分析

總糖質量分數采用苯酚-硫酸法測定[25]，以葡萄糖當量計算；蛋白質質量分數采用考馬斯亮藍試劑盒測定；氨基酸組成參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[26]，采用氨基酸自動分析儀測定；單糖組成采用反相HPLC法測定[27]；在4 000～400 cm-1波數范圍內掃描多糖的FTIR光譜，并采用高效分子排阻色譜（high-pressure size exclusion chromatography，HPSEC）法結合MALLS和RI檢測器分析多糖的分子質量[16]。

1.3.3 龍眼粗多糖的活性評價

多糖的DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力參考Yi Yang等[16]的方法。多糖的巨噬細胞免疫刺激活性參考韓苗苗等[14]的方法，將實驗分為空白對照組、LPS刺激組、FLP組、HDLP組、VDLP組、IDLP組和FDLP組。采用一氧化氮（nitric oxide，NO）生成量和TNF-α表達量評價。

1.3.4 龍眼粗多糖的消化特性

參考Yi Yang等[28]的方法：制備模擬唾液、胃液和腸液；在各消化液中處理多糖，再進行消化液的檢測前處理。消化液中的還原糖含量采用二硝基水楊酸法測定[29]，而游離單糖組成采用反相HPLC法測定[27]。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用平均值±標準偏差表示，組間數據在0.05水平的顯著性差異通過SPSS 19.0軟件進行S-N-K檢驗分析。FTIR光譜圖通過ChemPattern 2017化學計量學分析軟件積分，統計相對峰高值大于0.5的特征譜帶。

2 結果與分析

2.1 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的理化特征比較

表1 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的基本組成Table 1 Chemical composition of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

不同方式干制龍眼果肉制備所得粗多糖的基本組成存在明顯差異，如表1所示。前期研究發現，龍眼果肉經連續熱風干制60 h后粗多糖的多糖質量分數顯著下降（P＜0.05），而蛋白質量分數顯著增加（P＜0.05）[14]，可能與大分子發生美拉德反應有關。然而，FLP與HDLP的總糖和蛋白質量分數無明顯差異（P＞0.05），相比之下，VDLP和IDLP具有更高的總糖和蛋白質量分數，FDLP的總糖質量分數最低。不同粗多糖中蛋白質的氨基酸組成也存在明顯區別，FDLP中疏水性氨基酸占總氨基酸的質量分數（37.15%）明顯低于其他4 種粗多糖。HDLP果肉所得粗多糖中疏水性氨基酸質量分數略高于FLP，可能與蛋白質的糖基化有關，導致蛋白質量分數增加。而對于不同方式干制荔枝果肉中粗多糖的組成差異，郭亞娟[19]認為與干制條件對多糖結構和蛋白質結構的影響以及進一步的大分子靜電相互作用改變有關。

采用柱前衍生化HPLC法測定8 種單糖混合標準品的色譜峰依次為：甘露糖（13.151 min）、核糖（17.357 min）、鼠李糖（18.760 min）、葡萄糖醛酸（19.999 min）、半乳糖醛酸（22.751 min）、葡萄糖（27.106 min）、半乳糖（30.458 min）、阿拉伯糖（32.508 min）（圖1）。同時，確定5 種龍眼粗多糖主要由葡萄糖組成，文獻[14,16]報道的其余7 種單糖可能因含量過低而未被檢出。

圖1 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的單糖組成HPLC分析圖譜Fig. 1 HPLC chromatograms of monosaccharide compositions of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

采用HPSEC-MALLS-RI法測定龍眼粗多糖的分子質量分布，結果如表2所示。5 種粗多糖的分子質量分布存在明顯差異，FLP、HDLP、VDLP、IDLP和FDLP的平均分子質量之比為51.37∶28.33∶5.95∶7.86∶1.00；FLP以105～106Da組分為主（相對含量70.4%），且大于107Da組分相對含量達29.6%；干制龍眼果肉所得粗多糖中大于107Da組分明顯減少，105～106Da組分增加，106～107Da組分含量相對穩定；FDLP的分子質量分布明顯不同于其他多糖，其組分主要集中在小于105Da范圍，相對含量達72.8%。研究表明，冷凍、真空、微波、熱泵和熱風干制均不同程度導致荔枝果肉中多糖分子質量降低[19]。韓苗苗等[14]研究發現，龍眼果肉經熱風干制60 h后，多糖與蛋白質結合形成大分子復合物，導致分子質量增加。此外，Yan Jingkun等[30]研究發現，苦瓜片在熱風干制和紅外輻射干制過程中，其多糖均發生一定程度熱降解。由此推測，龍眼果肉粗多糖分子質量分布存在差異的主要原因可能涉及3 個方面：1）熱干制過程中多糖分子的降解使其分子質量降低；2）熱干制過程中多糖和蛋白質可能發生羰氨縮合、Amadori重排、分子裂解、Strecker降解等反應，導致復合物的生成與分解，使分子質量先升后降；3）干制過程導致多糖和蛋白質分子結構改變，減弱了濃縮、醇沉及復溶冷凍干燥等制備過程中分子間的靜電、氫鍵或疏水相互作用，導致大分子纏結、聚集或結合減弱，使分子質量降低。

表2 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的分子質量分布Table 2 Molecular mass distribution of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

圖2 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的FTIR光譜特征Fig. 2 FTIR characteristics of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

5 種龍眼多糖的紅外光譜圖都具有多糖和蛋白質的特征吸收（圖2A）。糖類特征峰包括[14]：羥基O—H在3 422 cm-1附近產生的特征吸收峰屬于分子間或分子內的伸縮、彎曲振動吸收峰；烷基C—H在2 926 cm-1附近產生的伸縮振動吸收峰；在1 180～953 cm-1范圍由C—C和C—O伸縮振動以及C—H彎曲振動產生“糖帶”吸收峰。蛋白質特征吸收峰包括：在1 616 cm-1附近產生的酰胺I區C＝O伸縮振動吸收峰；在1 480 cm-1附近產生的酰胺II區N—H彎曲振動和C—N伸縮振動吸收峰；在1 330～1 260 cm-1范圍的酰胺III區O—H彎曲振動吸收峰[14]。對FTIR光譜圖進行積分，統計相對峰高值大于0.5的共有特征峰（圖2B）。相比FLP，HDLP、VDLP、IDLP的烷基C—H特征吸收強度與酰胺區特征吸收強度均略有減弱，而FDLP的相關特征吸收均明顯增強，說明熱法干制（熱風、真空、紅外干制）和冷法干制（冷凍干制）對多糖和蛋白官能團產生不同的影響。

2.2 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的活性評價

抗氧化和免疫調節是龍眼多糖的重要生物功效[2,11]，故對不同龍眼多糖的自由基清除能力和巨噬細胞刺激活性進行比較，結果如圖3所示。5 種龍眼多糖對DPPH自由基和羥自由基的清除率隨其質量濃度的增大而增加，但當質量濃度超過4 mg/mL后FDLP和FLP的DPPH清除率明顯下降。相比熱法干制果肉所得多糖，FDLP和FLD可能引入的取代基少，高濃度下反應體系中多糖的分子內或分子間氫鍵作用較強，活性羥基含量減少導致多糖作為氫供體的自由基清除能力減弱[31]。對于DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力，5 種多糖的強弱表現有所不同，可能與不同的反應機理有關（多糖的金屬離子螯合能力直接影響羥自由基的產生）。HDLP的DPPH自由基清除能力最弱，FDLP的羥自由基清除能力最強。FDLP的自由基能力綜合較強，可能因其分子質量較低，暴露的活性羥基較多。而果肉長時間熱風干制過程中，HDLP的活性羥基可能被部分取代，導致其自由基清除能力減弱。

空白對照組和LPS刺激組的巨噬細胞NO生成量分別為55.60 μmol/L和71.62 μmol/L。由圖3C可見，除FLP外，其他4 種粗多糖均能顯著刺激巨噬細胞NO生成（P＜0.05），且呈現量效正相關性。在相同質量濃度（100～400 μg/mL）下，VDLP與IDLP和FDLP刺激巨噬細胞NO生成量無顯著差異（P＞0.05），而HDLP在質量濃度400 μg/mL下NO生成量最高（P＜0.05）。空白對照組和LPS刺激組的巨噬細胞TNF-α分泌量分別為63.45 pg/mL和183.14 pg/mL。由圖3D可見，5 種多糖均能有效刺激巨噬細胞分泌TNF-α（P＜0.05）。在100 μg/mL下，FLP刺激TNF-α分泌量與HDLP、VDLP和IDLP均無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于FDLP（P＜0.05）。在400 μg/mL下，VDLP、IDLP和FDLP的TNF-α分泌量無顯著差異（P＞0.05），且顯著低于HDLP（P＜0.05），而FLP的TNF-α分泌量最高（P＜0.05）。與羥自由基清除能力相反，龍眼多糖刺激巨噬細胞分泌TNF-α與分子質量呈正相關。前期研究發現，龍眼多糖主要通過Toll樣受體4引發刺激信號轉導[13]，而Toll樣受體4更易與高分子質量多糖親合[32]。

圖3 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的抗氧化活性和巨噬細胞刺激活性Fig. 3 Antioxidant and macrophage-stimulating activities of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

2.3 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的消化特性比較

多糖在消化過程可能因pH值、消化酶等作用發生降解，釋放出還原糖，而結構上的變化可能改變其活性[28,33]。由圖4可見，模擬唾液、胃液和腸液對5 種龍眼多糖有不同程度的消解作用，釋放的還原糖質量濃度存在一定差異。模擬唾液消化2 h后，還原糖質量濃度均顯著增加（P＜0.05），但進一步延長消化時間其質量濃度未顯著改變（P＞0.05），而IDLP的消解程度明顯低于其他多糖。相反，IDLP在模擬胃液中消解的還原糖質量濃度最高（P＜0.05）。相比之下，龍眼多糖在模擬腸液中的消解程度微乎其微。采用HPLC法檢測龍眼多糖經模擬消化6 h后的游離葡萄糖（圖5），通過峰面積比較發現，胃液中游離葡萄糖含量最高，唾液次之，而腸液中的含量極低。唾液和胃液中還原糖和葡萄糖的含量高低不一致，說明龍眼多糖在不同消化體系中的消解機理存在差異。蓮藕多糖為分子質量1.33～5.30 kDa的α-(1→6)-D-葡聚糖（或雜葡聚糖）[28]，與龍眼多糖的組成相近[13,34]，兩者的消化特性存在異同：均在胃液中的葡萄糖消解量較高；蓮藕多糖在腸液和胃液中的消解程度相近，且經腸液消解后分子質量降低。相對較高的分子質量可能是龍眼多糖消化特性有別于蓮藕多糖的關鍵。

圖4 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的消化特性Fig. 4 Digestive characteristics of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

圖5 龍眼粗多糖模擬消化6 h后消解單糖的HPLC分析圖譜Fig. 5 HPLC chromatograms of monosaccharides released from crude longan polysaccharides after simulated digestion for 6 hours

3 結 論

從新鮮和干制龍眼果肉中分別提取分離粗多糖，即FLP、HDLP、VDLP、IDLP、FDLP，通過分析其基本組成、FTIR光譜特征和分子質量分布發現，不同干制方式對粗多糖組成及結構的影響有所差異，尤其是冷凍干制果肉所得多糖的分子質量明顯低于其他多糖。同時，5 種粗多糖的抗氧化活性和免疫刺激活性也存在明顯差異，綜合比較，FDLP具有較強的自由基清除能力，而HDLP刺激巨噬細胞NO和TNF-α生成的能力更強。龍眼多糖在模擬唾液和胃液消化過程中發生不同程度消解，釋放出以葡萄糖為主的少量還原糖。而不同方式干制可能導致其消化特性的改變，模擬唾液和胃液消化對IDLP的影響明顯不同于其他多糖。干制工藝對龍眼果肉中活性多糖的理化和生化特性有一定影響，而多糖結構變化機制及相關構效關系有待于進一步探析。