色譜及色譜-質(zhì)譜技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中赤霉素痕量分析中的應(yīng)用

姜長(zhǎng)嶺，代金霞，劉 新，魯成銀，陳紅平,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008）

赤霉素（gibberellins，GAs）是一種植物生長(zhǎng)激素，能夠刺激細(xì)胞伸長(zhǎng)并影響各種發(fā)育過(guò)程，如刺激莖伸長(zhǎng)、種子萌發(fā)、休眠、開花、性別表達(dá)、酶誘導(dǎo)以及葉和果實(shí)衰老等。1926年，Kurosawa[1]研究一種導(dǎo)致水稻過(guò)度生長(zhǎng)的常見疾病，發(fā)現(xiàn)患病水稻的過(guò)度生長(zhǎng)是由感染植物的真菌分泌的化學(xué)物質(zhì)所致。Yabuta[2]從培養(yǎng)真菌的濾液中分離出這種化學(xué)物質(zhì)，稱其為GAs。GAs是一類四環(huán)二萜酸，它的基本結(jié)構(gòu)是二十碳赤霉烷，根據(jù)赤霉烷上雙鍵和羥基的數(shù)目、位置不同，以及內(nèi)酯環(huán)的有無(wú)，形成了不同的GAs。根據(jù)分子中碳原子數(shù)目的不同，GAs可分為兩種類型：C-19 GA和C-20 GA，其對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)如圖1[3]所示。C-19 GA是由C-20 GA轉(zhuǎn)變而來(lái)，但是包含的種類多于C-20 GA。雖然在植物中發(fā)現(xiàn)了許多種GAs，但只有很少一部分GAs具有激素的生理活性。通常，C-19 GA是具有生物活性的GAs，其中最常見的具有生理活性的GAs有GA1、GA3、GA4和GA7[4]。GAs按照其發(fā)現(xiàn)的順序依次從GA1到GAn進(jìn)行命名，GA3是第一個(gè)在結(jié)構(gòu)上確認(rèn)的GAs。截止到目前，在植物、真菌及細(xì)菌中已經(jīng)確認(rèn)有136 種GAs[5]。

圖1 C-19 GA（A）和C-20 GA（B）的結(jié)構(gòu)[3]Fig. 1 Structures of C-19 (A) and C-20 (B) gibberellins[3]

GAs是一種廣譜性的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，被廣泛應(yīng)用于植物生長(zhǎng)和發(fā)育的各個(gè)階段。同時(shí)，GAs也屬于低毒農(nóng)藥，但若短期大量攝入或長(zhǎng)期在體內(nèi)蓄積，會(huì)對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，例如許春爽等[6]研究發(fā)現(xiàn)GAs會(huì)對(duì)精子造成損傷。Erin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，GAs與腫瘤形成也有一定關(guān)系。因此，植物源性食品中GAs的有效檢測(cè)、鑒定與監(jiān)測(cè)對(duì)于食品安全以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的意義。

GAs痕量分析一直是GAs合成途徑、生理活性和代謝調(diào)控研究的難點(diǎn)，隨著分析儀器和分析手段的不斷完善，分析方法靈敏度與精密度不斷提升。GAs分析包括樣品前處理與儀器分析兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。樣品前處理是整個(gè)分析周期中的關(guān)鍵過(guò)程，可以分離甚至富集分析物，實(shí)現(xiàn)超痕量分析，消除基質(zhì)干擾的影響。因此，選擇一種快速、簡(jiǎn)單和自動(dòng)化的樣品前處理方法，可以幫助節(jié)省時(shí)間和精力，降低偶然誤差和系統(tǒng)誤差，減少溶劑用量。GAs檢測(cè)的前處理技術(shù)經(jīng)歷了傳統(tǒng)的液液萃取（liquid liquid extraction，LLE）向固相萃取（solid phase extraction，SPE）、液相微萃取（liquid phase microextraction，LPME）以及一些新興的樣品前處理技術(shù)的發(fā)展過(guò)程[8]。此外，在過(guò)去20 年中已經(jīng)開發(fā)出固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）和LPME樣品制備的小型化裝置，這種裝置具有進(jìn)一步減少溶劑消耗的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于痕量分析和原位分析。這些創(chuàng)新性的樣品制備方法是GAs分析的有力工具，有希望用于植物內(nèi)源性GAs追蹤和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。

近年來(lái)，隨著儀器分析技術(shù)的高速發(fā)展，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜、高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）分析儀器在提高靈敏度、精密度以及分辨率方面取得突飛猛進(jìn)的進(jìn)步，使得GAs分析技術(shù)邁上一個(gè)新平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了快速、高通量、高靈敏的精準(zhǔn)定量分析，解決了植物激素含量低、結(jié)構(gòu)相近以及復(fù)雜基質(zhì)干擾等導(dǎo)致的傳統(tǒng)色譜法無(wú)法精準(zhǔn)定量的缺陷，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了植物組織微量樣品分析，以及微區(qū)域GAs分布特征分析等。

本文查閱了近10 年來(lái)關(guān)于GAs檢測(cè)分析的報(bào)道，從樣品前處理與儀器分析兩個(gè)方面分別介紹各種技術(shù)方法以及應(yīng)用的具體實(shí)例。此外，作為可行性更高且可以提高檢測(cè)靈敏度的補(bǔ)充方法，還將突出總結(jié)富集效果更好的改良SPE技術(shù)與化學(xué)標(biāo)記法這兩類前處理方法，以及基于液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）、新型納升電噴霧離子源（nano-electron spray ionization，Nano-ESI）技術(shù)與HRMS的應(yīng)用。

1 GAs前處理方法研究進(jìn)展

在最近10 年里，GAs檢測(cè)的樣品前處理技術(shù)已經(jīng)有了廣泛且深入的研究。對(duì)Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)中的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，總結(jié)了2012—2018年以來(lái)關(guān)于GAs檢測(cè)方法的文章，結(jié)果如圖2所示。平均每年發(fā)表10 篇關(guān)于GAs檢測(cè)方法的文章；前處理過(guò)程主要采用SPE與LLE，部分文獻(xiàn)開發(fā)了新型的前處理技術(shù)，或是在SPE與LLE的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，對(duì)于一些新型復(fù)雜的標(biāo)記技術(shù)以及一些快速檢測(cè)的傳感器技術(shù)都?xì)w于其他方法中；在分析手段方面，LC法依舊是近年來(lái)針對(duì)GAs檢測(cè)的主流方法，按照LC所連接檢測(cè)器的不同，其分為L(zhǎng)C-紫外光譜法、LC-熒光檢測(cè)法等，其中LC-MS是目前最常用的GAs分析方法。

圖2 基于Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的2012—2018年發(fā)表的關(guān)于GAs檢測(cè)的論文Fig. 2 Summary of published papers on gibberellin determination from 2012 to 2018 retrieved from the Web of Science database

1.1 固相萃取法

SPE是運(yùn)用最為廣泛的樣品純化除雜方法，它主要通過(guò)在SPE柱中填充吸附劑從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)化合物的凈化效果。根據(jù)弱酸類植物激素的極性進(jìn)行純化，常用的SPE柱按照其填充的吸附劑的不同有如下幾類：十八烷基硅烷鍵合硅膠反相吸附劑（如C18柱）、親水親脂復(fù)合物兩性吸附劑（如HLB柱）、混合模式陰離子交換吸附劑（如MAX柱）、混合模式陽(yáng)離子交換吸附劑（如MCX柱）。SPE技術(shù)因萃取柱以及提取試劑的不同，其萃取效果有顯著差異。如C18柱可以除去大量非極性的葉綠素基質(zhì)，同時(shí)也可以通過(guò)調(diào)節(jié)淋洗液和洗脫液來(lái)除去一些極性很強(qiáng)的基質(zhì)。但C18除雜能力有限，當(dāng)植物中含有大量非極性基質(zhì)時(shí)常常會(huì)產(chǎn)生很大的基質(zhì)干擾峰。所以單純采用C18柱僅適用于一些基質(zhì)不太復(fù)雜的樣品。

Cui Kuanyan等[9]利用LC-ESI-MS/MS檢測(cè)油菜中GA1、GA3、GA43 種GAs的回收率，比較MCX、MAX、C18與HLB這4 種SPE柱的凈化效果，結(jié)果顯示單獨(dú)使用情況下，MCX柱相對(duì)優(yōu)于MAX柱、C18柱與HLB柱（GA3除外，在使用MCX柱時(shí)其對(duì)應(yīng)回收率低至19.5%），而其他SPE柱對(duì)3 種GAs的回收率均小于50%。所以一般來(lái)講，單純采用SPE柱的凈化方法難以處理復(fù)雜的植物組織提取液，因此串聯(lián)SPE柱應(yīng)用更為廣泛。

Urbanová等[10]以擬南芥為材料，前處理過(guò)程以80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈＋4%甲酸作為提取液，運(yùn)用兩次SPE步驟（MCX柱串聯(lián)HLB柱和單一MAX柱）對(duì)GAs進(jìn)行凈化處理，隨后進(jìn)行超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）-ESI-MS/MS測(cè)定，得到一種可行性較高的對(duì)多種GAs進(jìn)行同時(shí)定量的方法。最終得到20 種GAs的內(nèi)標(biāo)平均回收率為72%，檢出限（limit of detection，LODs）小于0.1 pmol/mg。Liu Shichang等[11]也是采用類似的兩次SPE步驟（MCX柱和MAX柱），結(jié)合HPLC-ESI-MSn檢測(cè)，成功地對(duì)10 種GAs進(jìn)行定量分析。最終得到10 種GAs的LODs都小于400 fmol/mL（其中8 種GAs小于100 fmol/mL）。

圖3 串聯(lián)SPE結(jié)合LLE的前處理流程[12]Fig. 3 Scheme of sample preparation by tandem solid phase extraction followed by liquid liquid extraction[12]

除了單獨(dú)運(yùn)用SPE技術(shù)，SPE結(jié)合其他技術(shù)原理（如LLE）也常用于GAs檢測(cè)。Chen Mingluan等[12]利用SPE結(jié)合LLE對(duì)小麥葉中酸性植物激素進(jìn)行富集，結(jié)合納升LC-電噴霧離子源-飛行時(shí)間質(zhì)譜（nano-LC-ESI-quadrupole-time of flight-MS，Nano-LC-ESI-Q-TOF-MS）檢測(cè)，得到一種能夠有效檢測(cè)10 種GAs的前處理方法。其前處理過(guò)程如圖3所示，小麥提取液經(jīng)C18柱與SAX柱凈化后，再經(jīng)LLE萃取，最后通過(guò)衍生化試劑3-溴乙酰基三甲基溴化銨（3-bromoactonyltrimethylammonium bromide，BTA）進(jìn)行柱前衍生化反應(yīng)，最終得到10 種GAs的LODs均小于60 pg/mL，回收率在85%～105%之間。Cui Kuanyan等[9]用同樣的前處理方式，以SPE與LLE相結(jié)合的前處理方式，LC-EI-MS檢測(cè)，成功建立了一種同時(shí)測(cè)定GA1、GA3、GA43 種GAs的方法，方法回收率為80%～115%，LOD分別為0.012、0.004 2、0.016 ng/mL。

雖然單獨(dú)使用SPE柱對(duì)GAs的凈化效果并不理想，但是基于SPE的原理，進(jìn)行不同SPE柱組合或者SPE結(jié)合LLE卻能夠起到很好的凈化效果。這種改良SPE雖然增加了前處理過(guò)程復(fù)雜性，但卻有很好富集效果，可行性高，結(jié)合LC-MS可以對(duì)多種GAs進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，得到極低的檢出限。該方法是目前針對(duì)多種GAs痕量分析最穩(wěn)定、最可靠的方法之一。

1.2 基質(zhì)固相分散萃取法

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的MSPD是一種用于固體和黏稠液體樣品的前處理技術(shù)，它實(shí)際上是使SPE過(guò)程和浸提過(guò)程同步進(jìn)行，同時(shí)破碎樣品和提取目標(biāo)化合物，使得提取和凈化步驟合二為一[13]。MSPD首先利用機(jī)械混合研磨使樣品完全破裂，加快目標(biāo)化合物溶出、提取，再利用樣品基質(zhì)與化學(xué)固定相選擇性相互作用進(jìn)行初步分離。其操作步驟簡(jiǎn)單來(lái)講就是將樣品基質(zhì)與固定相材料混合研磨，并填裝到SPE柱中，再用溶劑將分析物洗脫。

王璐[14]利用MSPD技術(shù)開發(fā)了一種同時(shí)檢測(cè)3 種GAs（GA1、GA3、GA4）的方法，該方法以擬南芥為材料，將樣品與C18填料混合研磨，80%冷甲醇-水溶液作為提取液，最終得到的3 種GAs回收率在69.2%～87.0%之間，GA1、GA3、GA4檢出限分別為4.1、1.1、1.5 ng/g。Deng Ting等[15]利用微尺度基質(zhì)固相分散萃取結(jié)合柱前衍生化技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)8 種GAs前處理方法，如圖4所示，在極低取樣量下通過(guò)在單一試管里進(jìn)行提取以及凈化過(guò)程，該方法成功地用于極低濃度下檢測(cè)單個(gè)葉片中GAs的分布規(guī)律，凸顯了高靈敏度（8 種GAs的LODs均小于1.4 pg/mL）與低樣品消耗量的特點(diǎn)，而且該前處理方法始終在一個(gè)試管中進(jìn)行，有效地避免了樣品的損失，整體回收率在80%～105%。

由于MSPD操作簡(jiǎn)單、前處理時(shí)間短，尤其適用于穩(wěn)定性較差的化合物，因此MSPD已經(jīng)得到越來(lái)越多的關(guān)注。且MSPD與其他前處理技術(shù)具有很強(qiáng)的兼容性，MSPD與離心、超聲波、微波和磁力等工藝結(jié)合，可以提高M(jìn)SPD的提取效率。它還可以與其他提取技術(shù)相結(jié)合，特別是一些微萃取技術(shù)[16]。目前應(yīng)用MSPD對(duì)GAs進(jìn)行檢測(cè)的研究還相對(duì)較少，但MSPD對(duì)于GAs的痕量檢測(cè)卻是具有很大的應(yīng)用前景。

1.3 QuEChERS法

2003年Anastassiades等[17]提出了一種農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘檢測(cè)中快速簡(jiǎn)便的QuEChERS前處理方法，該方法采用乙腈萃取/分配結(jié)合“分散SPE”。該方法巧妙地將提取與純化的步驟結(jié)合在一起，溶劑、鹽與吸附劑的獨(dú)特組合使得提取效率得到很大提升。直到目前，QuEChERS法仍是水果蔬菜中農(nóng)殘檢測(cè)最為常用的前處理方式。由于該方法具有“綠色化學(xué)”特征，因此被迅速應(yīng)用到環(huán)境、農(nóng)業(yè)和生物分析等領(lǐng)域[18]。該方法因其極大的靈活性可以形成很多不同版本的QuEChERS技術(shù)，這些改良QuEChERS技術(shù)，結(jié)合高靈敏、高選擇性的色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)，使得農(nóng)殘檢測(cè)前處理技術(shù)邁上一個(gè)新臺(tái)階。

Chen Yaling等[19]采用改良QuEChERS方法建立了5 種水果中GA3的檢測(cè)方法，該技術(shù)采用含4%鹽酸的乙腈為提取溶劑結(jié)合適量的N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）吸附劑，最終得到GA3的LOD為5.68 μg/kg，回收率在78.5%～106%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于15%。Liu Shaoying等[20]以含有1%醋酸的乙腈為提取溶劑結(jié)合C18吸附劑的QuEChERS技術(shù)，建立4 種水果中14 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或殺菌劑的檢測(cè)方法，其中GA3的LOD為0.6 μg/kg，回收率在70%～85%之間，RSD小于12%。

QuEChERS是目前使用非常普遍的前處理方法，正如其名稱所含的特點(diǎn)，相對(duì)于其他前處理方式，它的靈活性更好。不同的吸附劑組合配合不同的提取溶劑，可以開發(fā)出適合于不同樣品材料的改良QuEChERS技術(shù)。盡管如此，QuEChERS技術(shù)存在一些缺陷，如凈化效果不佳、方法靈敏度不足（通常是稀釋樣液）等導(dǎo)致QuEChERS技術(shù)難以適用于復(fù)雜基質(zhì)中多種GAs的痕量分析，尤其是微量樣品中GAs痕量分析。

圖4 微尺度下樣品制備方案[15]Fig. 4 Schematic illustration of the microscale sample preparation method[15]

1.4 液液萃取法

LLE的原理是基于目標(biāo)分析物在兩種液相之間的溶解度差異，該技術(shù)基于相似相溶解的原理，具有高極性的溶劑可以更好地溶解和提取植物基質(zhì)中植物激素分子。最經(jīng)典的LLE是在分液漏斗中將目標(biāo)分析物從含水樣品溶液中提取到非極性或極性較小的有機(jī)溶劑中。樣品可單獨(dú)進(jìn)行LLE作為前處理過(guò)程，也可反復(fù)LLE后再進(jìn)行檢測(cè)，更多的是LLE與SPE聯(lián)用來(lái)提高純化效果。

Wang Qing等[21]通過(guò)一種反復(fù)LLE的方式，利用HPLC-MS/MS成功建立了蜂蜜中49 種植物激素的定量方法，其中包括利用乙腈和水相進(jìn)行LLE建立起的對(duì)19 種GAs同時(shí)定量的方法。19 種GAs的檢出限為2.1～628.2 pg/mL，回收率在84%～124%之間，日內(nèi)及日間RSD都小于15%。該方法利用LLE的原理，成功對(duì)19 種GAs同時(shí)進(jìn)行了檢測(cè)。

傳統(tǒng)的LLE顯然不符合對(duì)GAs進(jìn)行痕量分析的要求，除了可以反復(fù)利用LLE步驟之外，LLE與SPE結(jié)合或許更具優(yōu)勢(shì)，而且反復(fù)的LLE步驟是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易產(chǎn)生誤差的過(guò)程。所以LLE與其他凈化方式結(jié)合起來(lái)或許更適合用于GAs的檢測(cè)。

1.5 液液微萃取法

LLME是一項(xiàng)新型樣品前處理技術(shù)，克服了傳統(tǒng)LLE消耗大量溶劑以及SPME萃取頭較昂貴、壽命短、多次使用存在交叉污染等缺點(diǎn)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊裝置，具有成本低、富集倍數(shù)高、有機(jī)溶劑用量少等特點(diǎn)，是一種環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)，因適應(yīng)了當(dāng)前綠色化學(xué)發(fā)展的需要而受到分析人員的廣泛關(guān)注[22]。LLME主要有3 種操作模式：?jiǎn)我旱挝⑤腿　⒅锌绽w維膜LPME和分散液液微萃取等形式。

近年來(lái)中空纖維膜的引入使得LLME穩(wěn)定性得到很大提升，應(yīng)用更為簡(jiǎn)便。Wu Qian等[23]引入中空纖維膜液-液-液微萃取（hollow fiber-based liquid-liquid-liquid micro-extraction，HF-LLLME）結(jié)合滲透法對(duì)水稻中的8 種GAs進(jìn)行富集，再用HPLC-MS/MS檢測(cè)，提高了萃取方法對(duì)GAs的選擇性，成功建立了8 種GAs的定量方法，檢出限（0.001 6～0.061 ng/mL）極低，回收率在62%～166%之間。

LLME技術(shù)由于其綠色化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)具有很大的發(fā)展前景。但是由于微萃取所用的材料量很少，所以造成的誤差較大，穩(wěn)定性較差，且其對(duì)前處理過(guò)程的精確度要求較高。LLME目前通常結(jié)合其他技術(shù)來(lái)提高準(zhǔn)確度，對(duì)GAs檢測(cè)更多的是采用LLME結(jié)合其他處理方式[23-24]。這種與其他技術(shù)結(jié)合的方式將來(lái)可能會(huì)成為GAs檢測(cè)的主流前處理方法。

1.6 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technique，MIT）是源于20世紀(jì)中期的一種新方法。由于其具有結(jié)構(gòu)可預(yù)測(cè)性、廣泛適用性、特異識(shí)別性三大特點(diǎn)，發(fā)展極為迅速。近年來(lái)MIT由于其高選擇性、簡(jiǎn)便快速性、高穩(wěn)定性以及低成本和環(huán)保等顯著優(yōu)勢(shì)，大量地應(yīng)用到了食品中化學(xué)污染物的檢測(cè)中。MIT是制備具有某種空間結(jié)構(gòu)的分子印跡聚合物（molecularly imprinted ploymers，MIPs）的技術(shù)，該聚合物可特異性地結(jié)合模板分子。制備出的MIPs對(duì)模板分子的親和性和選擇性高，對(duì)惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗能力，穩(wěn)定性強(qiáng)、使用壽命長(zhǎng)，已被廣泛的應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、材料、食品等多個(gè)領(lǐng)域[25]。而MIPs作為SPE吸附劑可以特異性的吸附目標(biāo)產(chǎn)物，在食品分析中得到了較為廣泛的應(yīng)用。

Zhang Zhuomin等[26]采用快速簡(jiǎn)便的微波輻射方法，在最佳制備條件下合成了新型GA3磁性MIP，聚合過(guò)程見圖5。該方法用含有丁基化羥基甲苯的80%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液作為提取溶劑，以GA3磁性MIP對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集，利用HPLC-MS分析，建立了4 種GAs的定量方法。最終得到4 種GAs的LODs均小于5 μg/L，對(duì)小麥和黃瓜檢測(cè)回收率分別為76.0%～109.1%與79.9%～93.6%，RSD分別為2.8%～8.8%、3.1%～7.7%。該方法合成的新型GA3磁性MIP有效地對(duì)樣品目標(biāo)物進(jìn)行了富集，得到了極低的檢出限且有較好的回收率，可以作為MIT應(yīng)用于多種GAs分析的可行性參考。

圖5 GA3磁性MIP珠粒聚合過(guò)程的示意圖[26]Fig. 5 Schematic representation of the polymerization process of GA3 mag-molecularly imprinted ploymer beads[26]

MIT是一種新興的應(yīng)用于樣品前處理的技術(shù)，由于其廣泛的應(yīng)用前景得到越來(lái)越多的關(guān)注。雖然已有相關(guān)研究將該方法應(yīng)用于對(duì)GAs的檢測(cè)中，但吸附劑的制備過(guò)程太過(guò)復(fù)雜，且還沒(méi)有制備出成功應(yīng)用于多種GAs痕量分析的MIPs。但該方法高親和性與選擇性十分有利于目標(biāo)物的富集，因此對(duì)于多種GAs的痕量分析還需進(jìn)一步研制出更為有效的MIPs。

1.7 化學(xué)標(biāo)記

化學(xué)標(biāo)記（包括衍生化、熒光標(biāo)記和同位素標(biāo)記）以其高靈敏度成為目前研究前處理技術(shù)的熱門方法。該方法通過(guò)一些特殊的試劑對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行標(biāo)記，這些標(biāo)記可以顯著降低實(shí)際樣品中初級(jí)和次級(jí)代謝物的干擾，并提高檢測(cè)選擇性與靈敏度。目前化學(xué)標(biāo)記的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物激素的痕量分析方面。

Zhu Guimei等[27]提出了一種基于叔胺標(biāo)記的毛細(xì)管電泳結(jié)合電化學(xué)發(fā)光技術(shù)（capillary electrophoresis combined with electrochemical luminescence，CE-ECL）用于檢測(cè)GAs的新方法，該方法以2-(2-氨乙基)-1-甲基吡咯烷作為衍生化試劑，樣品經(jīng)LLE與SPE處理后，采用CE-ECL檢測(cè)。對(duì)黃豆中GA3的檢出限為8×10-8mol/L，回收率在89.6%～99.3%之間。Li Guoliang等[24]提出了一種采用2-(11H-苯[a]咔唑)乙基對(duì)甲苯磺酸酯作為標(biāo)記試劑的新型柱前熒光標(biāo)記方法，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）結(jié)合熒光檢測(cè)器對(duì)7 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行定量分析。最終得到5 種水果GA3的回收率為90%～105%，檢出限為2.1 nmol/L。

Cai Wenjing等[28]建立了一步式多功能衍生化的方法，對(duì)31 種植物激素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，其中包括14 種GAs，該方法采用乙腈進(jìn)行提取，以N,N-二乙基乙二胺（N,N-diethyl ethylenediamine，DEED）作為GAs的衍生化試劑，衍生化條件在40 ℃持續(xù)10 min，最后由UPLC-MS/MS檢測(cè)。最終得到14 種GAs的檢出限為1.8～20.0 fg/mL，回收率為80.7%～120.4%，日內(nèi)以及日間RSD都小于11.8%。該方法充分利用衍生化過(guò)程來(lái)對(duì)多種GAs進(jìn)行痕量分析，結(jié)果顯示該方法可行、簡(jiǎn)便且具有高靈敏度。

Hao Yanhong等[29]提出了一種穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法，成功對(duì)水稻中的11 種GAs進(jìn)行定量分析。該方法以N,N-二甲基乙二胺（N,N-dimethyl ethylenediamine，DMED）及其氘代對(duì)應(yīng)物d4-DMED為衍生化試劑標(biāo)記GAs，經(jīng)SPE結(jié)合LLE的前處理富集、凈化后，再由HPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)。其前處理過(guò)程及同位素標(biāo)記衍生化過(guò)程如圖6所示。該方法最終得到水稻中11 種GAs的LODs為0.02～0.74 pg/mL，回收率為72%～128%，RSD為1.0%～13.9%。

圖6 樣品前處理和穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化的程序[29]Fig. 6 Procedure for sample pretreatment and stable isotope labeled derivatization[29]

Sun Xiaohong等[30]提出了一種穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法用于8 種酸性植物激素的定量分析。該方法以溴化溴代膽酰（bromocholine bromide，BETA）對(duì)經(jīng)過(guò)SPE與LLE之后的樣品提取液進(jìn)行衍生化標(biāo)記，以其氘代對(duì)應(yīng)物d9-BETA對(duì)標(biāo)樣進(jìn)行衍生化標(biāo)記，然后將兩組已經(jīng)衍生化的提取液（一個(gè)輕標(biāo)記、一個(gè)重標(biāo)記）合并，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。最終得到GA4的檢出限為0.754 pg/mL，回收率為79%～92%。該方法實(shí)現(xiàn)了基于內(nèi)標(biāo)的多種植物激素的相對(duì)定量，與每種分析物的內(nèi)標(biāo)可用性無(wú)關(guān)，靈敏度提高了1～3 個(gè)數(shù)量級(jí)。

化學(xué)標(biāo)記方法已經(jīng)成功應(yīng)用于GAs的痕量分析中，這些方法都具有很高的靈敏度和極低的檢出限，是目前對(duì)于多種GAs痕量分析極為有效的方法。化學(xué)標(biāo)記法關(guān)鍵在于衍生化試劑的選擇，不同的試劑決定了其所能分析目標(biāo)化合物種類和最終的檢測(cè)靈敏度。化學(xué)標(biāo)記法通常需要與其他前處理技術(shù)相結(jié)合，甚至可以將化學(xué)標(biāo)記法看作是其他前處理技術(shù)的一個(gè)補(bǔ)充。化學(xué)標(biāo)記法是目前對(duì)于植物痕量分析的主流趨勢(shì)，更合適的衍生化試劑結(jié)合富集效果更好的提取和凈化過(guò)程將會(huì)是決定多種GAs痕量分析的關(guān)鍵，也是目前研究的熱點(diǎn)。

2 GAs分析方法研究進(jìn)展

目前植物激素的檢測(cè)方法較多，主要可分為生物鑒定法、免疫分析法和色譜分析法3 類[31]。生物鑒定法是一種非常經(jīng)典的植物激素檢測(cè)分析法。例如油菜素內(nèi)酯的水稻葉彎曲測(cè)試法可達(dá)到0.05 ng/mL的檢測(cè)限[32]。但它只是一種半定量方法，而且其耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)檢測(cè)條件要求嚴(yán)苛，一般的化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。而免疫分析法近年來(lái)顯示出較低的檢測(cè)限，但是其仍需解決制備的抗體的交叉反應(yīng)問(wèn)題。目前，色譜法應(yīng)用最廣，可同時(shí)檢測(cè)多種植物激素，且定量準(zhǔn)確。近年來(lái)，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速發(fā)展極大提高了對(duì)植物激素的選擇性檢測(cè)能力，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的定性與定量分析[33]。

基于色譜法針對(duì)多種GAs痕量分析方法的研究，主要是對(duì)GAs定性問(wèn)題以及檢出限問(wèn)題研究。由于樣品基質(zhì)種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，在色譜圖上往往會(huì)出現(xiàn)干擾峰，影響樣品的定性定量分析。同時(shí)，由于GAs在植物體內(nèi)含量極低，因此對(duì)GAs分析方法的精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度提出了非常高的要求。以下將從GC和GC-MS、LC和LC-MS兩方面綜述近年來(lái)GAs痕量分析手段的優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1 氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法

GC是利用氣體作流動(dòng)相的色譜分離方法。汽化的樣品被載氣帶入色譜柱中，柱中的固定相與試樣中各組分分子作用力不同，各組分從色譜柱中流出時(shí)間不同，組分彼此分離。GC與火焰離子化檢測(cè)儀（flame ionization detector，F(xiàn)ID）或MS等檢測(cè)器相結(jié)合已被廣泛用于分析植物激素及其相關(guān)代謝物。其中，MS由于其較高的靈敏度和選擇性已經(jīng)成為最常用的一種檢測(cè)工具。GAs是一類具有高沸點(diǎn)的極性化合物，難以被汽化，所以不能直接采用GC-MS分析。對(duì)于非揮發(fā)性化合物而言，在GC-MS之前通常需要衍生化步驟以產(chǎn)生揮發(fā)性產(chǎn)物并改善色譜信號(hào)[34]。因此，合適且穩(wěn)定的衍生化過(guò)程對(duì)于GC-MS成功分析GAs至關(guān)重要。衍生化過(guò)程可以被認(rèn)為是一種特殊類型的微尺度化學(xué)合成過(guò)程，其可能需要在極端溫度和壓力條件下持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)[35]。現(xiàn)有的GAs衍生化反應(yīng)原理通常是利用GAs都含有羧酸基團(tuán)的化學(xué)特征，利用衍生化的過(guò)程對(duì)GAs的羧基進(jìn)行反應(yīng)[24,27-28,30]，進(jìn)而得到相應(yīng)的衍生化產(chǎn)物。

Nehela等[36]利用GC-MS建立一種對(duì)甜橙（Citrus sinensis (L.) Osbeck）葉和根進(jìn)行植物激素分析的方法，該方法采用混合溶劑（V（甲醇）∶V（水）∶V（鹽酸）＝80∶19.9∶0.1）作為提取液，以N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide，MSTFA）作為衍生化試劑對(duì)GAs進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程在加熱至85 ℃的條件下持續(xù)45 min，再通過(guò)GC-MS以選擇性離子檢測(cè)模式分析。最終得到3 種GAs的LODs為0.02～0.07 ng/g，回收率也穩(wěn)定在110%左右。該方法有效地利用GC-MS結(jié)合衍生化過(guò)程對(duì)3 種GAs進(jìn)行分析，檢出限極低，為GC-MS對(duì)多種GAs痕量分析提供了非常重要的參考。GC-MS是用于分析GAs的標(biāo)準(zhǔn)方法。到目前為止，有超過(guò)100 個(gè)GAs的標(biāo)準(zhǔn)MS譜圖，它們構(gòu)成了GAs鑒定的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。但是，GAs是具有高沸點(diǎn)的非揮發(fā)性化合物，因此通常需要耗時(shí)且復(fù)雜的衍生程序，以便GC-MS檢測(cè)。利用GC-MS對(duì)多種GAs的痕量分析，關(guān)鍵在于衍生化過(guò)程，而目前用于GC-MS分析的GAs衍生化試劑研究太少，無(wú)法滿足對(duì)多種GAs痕量分析的要求。但卻存在許多用于提高LC-MS檢測(cè)信號(hào)的GAs衍生化試劑，這些試劑增強(qiáng)了目標(biāo)物的信號(hào)強(qiáng)度，提高了利用LC-MS檢測(cè)的靈敏度。近年來(lái)，LC-MS已經(jīng)成為了檢查GAs的主要分析手段之一。

2.2 液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜法

LC由于其高分辨率己成為一個(gè)強(qiáng)大的分離工具，從1970年代初以來(lái)，已廣泛用于痕量植物激素的分析。傳統(tǒng)的檢測(cè)器如紫外、熒光檢測(cè)器通常不能提供目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)信息，且很難實(shí)現(xiàn)多種分析物的同時(shí)檢測(cè)[37]，LC-MS由于其高靈敏度和選擇性成為目前最常見與最實(shí)用的結(jié)合方式。LC-MS結(jié)合了LC有效分離熱不穩(wěn)性及高沸點(diǎn)化合物的分離能力與MS很強(qiáng)的組分鑒定能力，是一種分析復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段。LC-MS具有良好的重現(xiàn)性和廣泛的覆蓋率，LC-MS技術(shù)通常不需要衍生化步驟，相比于GC-MS節(jié)省了時(shí)間。LC-MS還具有可與不同質(zhì)量分析器配合使用的優(yōu)點(diǎn)，使大分子物質(zhì)（如Nano-ESI源）、極性（ESI源）與非極性（大氣壓化學(xué)電離源）物質(zhì)都能夠有效離子化[38]。隨著近年來(lái)對(duì)LC-MS的需求進(jìn)一步提升，一些新技術(shù)的引入使得LC-MS得到進(jìn)一步發(fā)展，如立體選擇性LC-MS[39]對(duì)手性農(nóng)殘的分析，以及多維LC[40]對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的樣品的有效分離。

GAs是一種二萜類酸，屬于中等極性的分子，因而在LC中固定相宜選擇極性較小的鍵合固定相，流動(dòng)相宜選擇極性較強(qiáng)的溶劑[41]。因此，目前較多采用反相色譜柱C18柱進(jìn)行分離。流動(dòng)相一般采用甲醇-水、乙腈-水兩大體系。乙腈洗脫能力強(qiáng)，黏度比甲醇低，系統(tǒng)壓力較低，但價(jià)格較高，毒性較強(qiáng)。甲醇的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在經(jīng)濟(jì)、低毒等環(huán)保優(yōu)勢(shì)上，但系統(tǒng)壓力高，洗脫能力較差。GAs在LC中的流動(dòng)相通常都含有低濃度的甲酸，有助于酸性目標(biāo)化合物的分離。

Cao Zhaoyun等[42]利用LC-MS結(jié)合SPE（PAX小柱）的前處理過(guò)程有效測(cè)定小麥中43 種植物激素（包括10 種GAs）。其中LC采C18色譜柱，流動(dòng)相包含甲醇和5×10-3mol/L甲酸銨，以梯度洗脫的方式進(jìn)行目標(biāo)物分離。該方法檢測(cè)10 種GAs的回收率穩(wěn)定在70%～110%之間，LODs為0.19～7.57 fmol/mL，日內(nèi)及日間的RSD都小于15%。

本文總結(jié)了近10 年國(guó)內(nèi)部分應(yīng)用LC-MS檢測(cè)不同作物中GAs含量的文章（表1），發(fā)現(xiàn)其中前處理絕大部分都是應(yīng)用SPE，色譜的色譜柱基本為C18柱，流動(dòng)相大多用酸化的甲醇。

表1 LC-MS在檢測(cè)GAs中的應(yīng)用Table 1 Applications of liquid chromatography coupled with mass spectrometry in the detection of gibberellins

GAs檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)，不僅包括檢出限以及回收率，能檢測(cè)的GAs數(shù)量也是一個(gè)重要指標(biāo)。近年來(lái)，植物激素檢測(cè)方法研究中取得突破性進(jìn)展，GAs不僅在檢測(cè)限（即靈敏度）取得較大突破，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了GAs高通量檢測(cè)，表2總結(jié)了近10 年來(lái)利用LC檢測(cè)多種GAs的部分文獻(xiàn)。

表2所示利用LC檢測(cè)GAs的研究中，均同時(shí)檢測(cè)了3 種以上的GAs，且檢測(cè)限都很低，穩(wěn)定性較好。這些文獻(xiàn)中LC的色譜柱大多使用C18柱，流動(dòng)相以酸化的甲醇使用較多，也有采用乙腈與水作為流動(dòng)相。上述文獻(xiàn)所用材料以擬南芥與小麥為主，這類材料的基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)與一些內(nèi)含物質(zhì)豐富的材料（如茶葉）要小很多，因而在針對(duì)不同材料的定量分析時(shí)，要調(diào)整相對(duì)應(yīng)的樣品前處理方式。

在LC-ESI-MS檢測(cè)GAs的基礎(chǔ)上，近些年來(lái)，一種新型的Nano-ESI結(jié)合MS被應(yīng)用于GAs的痕量分析。Chen Mingluan等[12]采用一種甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯（methacrylic acid-co-ethylene glycol dimethacrylate，MAA-co-EDMA）整體柱代替常規(guī)的C18色譜柱，利用Nano-LC-ESI-Q-TOF-MS檢測(cè)（圖7）。該方法首先采用50 nL樣品環(huán)（定量環(huán)），通過(guò)直接進(jìn)樣方式優(yōu)化目標(biāo)分析物在MAA-co-EDMA整體柱上的分離條件（流動(dòng)相與洗脫梯度），然后用約85 μL MAA-co-EDMA（長(zhǎng)7 cm、內(nèi)徑100 μm、外徑360 μm）捕集柱代替50 nL樣品環(huán)，20 μL樣品液體以10 μL/min流速進(jìn)樣9 min后，15 種酸性植物激素衍生物通過(guò)MAA-co-EDMA整體柱被有效分離與富集（流速為0.6 μL/min），經(jīng)TOF MS檢測(cè)，從而提高目標(biāo)化合物的進(jìn)樣量，克服樣品液體中大量陽(yáng)離子對(duì)免疫親和色譜柱分離和TOF MS離子化效率的影響。該方法利用Nano-ESI-MS超高靈敏度的檢測(cè)，成功對(duì)15 種植物激素（包括10 種GAs）進(jìn)行定量分析。Zhang Zheng等[50]也采用相似的Nano-LC-MS系統(tǒng)，成功建立了對(duì)10 種GAs定量分析的方法，10 種GAs的檢出限為0.004～0.032 ng/mL，回收率為80%～105%。該方法采用PT-SPE結(jié)合衍生化過(guò)程（衍生化試劑為DEED）的前處理，再結(jié)合基于陽(yáng)離子交換/反相（cation exchange/reversed-phase，CX/RP）整體毛細(xì)管柱的Nano-LC-MS進(jìn)行檢測(cè)。該CX/RP整體柱的制備原理是基于“硫醇-烯”點(diǎn)擊化學(xué)和微乳液體系中的溶膠-凝膠方法。但該CX/RP整體柱使用不同于Chen Mingluan等[12]以單一MAA-co-EDMA整體柱在線捕獲后再以另一MAA-co-EDMA整體柱進(jìn)行分離，而是C18色譜柱在線捕獲目標(biāo)物后，再采用CX/RP整體柱進(jìn)行分離。這種基于Nano-ESI的新型分析技術(shù)由于其樣品消耗少與超高靈敏度已經(jīng)得到越來(lái)越多的關(guān)注，且已成功應(yīng)用于植物激素的痕量分析。Nano-ESI發(fā)射器具有微尺度孔，可降低分析物消耗，具有很高的離子轉(zhuǎn)移效率，十分有利于對(duì)有限可用性分析物的質(zhì)譜分析[51]。針對(duì)多種GAs痕量分析，該技術(shù)具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

表2 LC法在檢測(cè)多種GAs中的應(yīng)用Table 2 Applications of liquid chromatography in the detection of gibberellins

圖7 Nano-LC-ESI-Q-TOF-MS系統(tǒng)原理圖[12]Fig. 7 Schematic diagram of nano-liquid chromatography-electron spray ionization-Q-quadrupole-time of flight-mass spectrometry system[12]

除了Nano-ESI這種新型技術(shù)應(yīng)用于MS的分析中，近年來(lái)，越來(lái)越多的HRMS代替了傳統(tǒng)的MS。如磁偏轉(zhuǎn)質(zhì)譜、TOF-MS、靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜以及傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等，這些高分辨質(zhì)譜的分辨率都大于10 000，質(zhì)量精度均小于5×10-6[52]。而在GAs檢測(cè)中被常應(yīng)用到的高分辨質(zhì)譜為Q-TOF-MS[12]，Q-TOF-MS是一種強(qiáng)大的工具，通過(guò)建立每種化合物的碎裂過(guò)程來(lái)表征痕量化合物。Zhao Hongzhi等[53]利用ESI-Q-TOF-MS首次建立了植物激素（包括GA3、GA4、GA9）的綜合MS/MS譜庫(kù)。謝寒冰等[54]利用HPLC-Q-TOF-MS測(cè)定了豆芽中的3 種外源植物激素殘留，該方法采用QuEChERS的前處理技術(shù)，以酸化的乙醇-乙腈溶液提取目標(biāo)物，經(jīng)硅藻土分散固相凈化。LC以甲醇-水作為流動(dòng)相梯度洗脫，C18色譜柱分離。MS采用高分辨質(zhì)譜、負(fù)離子模式，以精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)特征離子定性，以準(zhǔn)分子離子峰面積定量。最終檢測(cè)大豆芽和綠豆芽?jī)蓚€(gè)品種，得到GA3的回收率為79%～87%，LOD為5.0 μg/kg，3 種加標(biāo)水平（10、50、100 μg/kg）下RSD小于10%。這種高分辨質(zhì)譜可通過(guò)多級(jí)掃描結(jié)合譜庫(kù)檢索使得目標(biāo)物的分析更加準(zhǔn)確，可以有效區(qū)分混合物，大幅降低了對(duì)前處理的要求，相較于傳統(tǒng)的MS/MS，HRMS也降低了對(duì)色譜分離的要求，可同時(shí)對(duì)數(shù)百種化合物進(jìn)行分析，是對(duì)多種GAs痕量分析極為有效的手段。

3 結(jié) 語(yǔ)

GAs檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了從最開始的傳統(tǒng)生物測(cè)定法[55]到免疫測(cè)定法，又隨著20世紀(jì)60年代GC-MS的興起以及GC-MS被普遍應(yīng)用于GAs檢測(cè)[56-57]，到現(xiàn)在以LC-MS為主的過(guò)程。在LC-MS的基礎(chǔ)上，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型Nano-ESI因其低消耗和超高靈敏度在植物激素痕量分析方面得到越來(lái)越多的關(guān)注，并且已成功應(yīng)用于多種GAs的痕量分析[12,50]。同時(shí)，隨著HRMS的發(fā)展及其對(duì)傳統(tǒng)MS/MS的影響，近年來(lái)也逐漸被應(yīng)用于GAs的痕量分析[12]。在利用色譜法分析GAs的前提下，GAs檢測(cè)的前處理技術(shù)也得到了極大的發(fā)展。創(chuàng)新性的SPE技術(shù)（如高效、高選擇性的新型吸附劑或SPME技術(shù)）以及化學(xué)標(biāo)記法的應(yīng)用，使得目標(biāo)物的凈化與富集效果得到很大的提升，提高了分析方法的靈敏度。

雖然目前已經(jīng)存在許多檢測(cè)GAs的優(yōu)秀方法，尤其是隨著Nano-ESI與HRMS的引入之后，GAs分析方法的靈敏度得到很大提升。但對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的植物成分進(jìn)行GAs的痕量、精準(zhǔn)及高通量分析仍有缺陷，表現(xiàn)在靈敏度還需要進(jìn)一步提高，從而實(shí)現(xiàn)超低的痕量分析，解決極低樣品取樣量下GAs的痕量分析。同時(shí)，由于GAs同系物存在同分異構(gòu)體，因此對(duì)GAs光學(xué)異構(gòu)體鑒別與定量分析技術(shù)有待于進(jìn)一步開發(fā)。另外，GAs代謝產(chǎn)物研究極少，主要是由于分析手段不足，代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析是今后GAs分析技術(shù)需要克服的難點(diǎn)。

針對(duì)上述存在的問(wèn)題，可以從不同的方向進(jìn)行解決。在前處理上，高通量、選擇性的材料在GAs分析的應(yīng)用能夠提高GAs的富集能力，從而提高GAs分析的靈敏度。如功能性石墨烯材料在GAs分析的應(yīng)用，一方面提高了SPE與QuEChERS的凈化能力；另一方面也增加了前處理方法的富集系數(shù)，提高了方法靈敏度。在同系物、同分異構(gòu)體分析上，新型色譜柱在GAs的應(yīng)用提高了色譜分離度，高分辨MS或MS/MS的高選擇性有望解決GAs同分異構(gòu)體或光學(xué)異構(gòu)體的分析。利用HRMS結(jié)合體外模擬實(shí)驗(yàn)，可以初步推斷GAs降解產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物，再將核磁共振以及紅外光譜等技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，是今后研究GAs代謝行為的方向。