微生物代謝工程在花色苷生產過程中的應用現狀和前景

李 躍，李國瑞，陳永勝,,*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古 通遼 028000）

花色苷是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，促使許多植物和果實形成紅色、藍色和紫色，屬于類黃酮類物質，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤以及預防心腦血管疾病等多種生物活性，是植物界中重要的抗氧化劑和抗菌劑[1-2]。隨著人們對天然營養品需求的不斷提高，將天然提取色素（如花色苷）應用于食品加工中已成發展趨勢[3-4]。花色苷的結構如圖1所示，通過對花色苷R1、R2、R3、R4、R5和R6進行糖基化、羥基化、甲基化或乙酰化等修飾，可以產生多種花色苷同源物（表1）。

圖1 花色苷結構示意圖Fig. 1 Structure of anthocyanins

表1 代表性花色苷及其結構Table 1 Representative anthocyanins and their structures

傳統花色苷主要來源于植物材料的提取，如從水果、鮮花或其他植物組織中提取純化[5-7]。植物提取法具有原料廉價和技術先進等優點，同時，隨著人們對植物中花色苷合成及花色苷遺傳代謝工程的研究與應用，從植物中提取和純化花色苷的方式已取得較大發展[8]。然而，從植物中分離獲得的花色苷通常為含有多種分子與化學結構不同的混合物。此外，通過植物提取時，所得花色苷性質不穩定，同時也會受到生產力、季節以及環境條件變化的影響[9]。然而，微生物具有增長快速和容易培養等生產特性，并且自動化微生物處理技術使微生物生產天然產物更加便捷、可控和高效，因此，花色苷的微生物生產法越來越受到人們青睞[10-11]。迄今為止，已有多種植物來源的化合物利用原核和真核微生物加以生產，包括萜類、生物堿和類黃酮[12-13]。有研究表明，可通過添加特定的反應底物使微生物生產類黃酮化合物[14-15]。基因組測序、DNA合成、結構生物學、酶學和代謝網絡建模等技術使微生物代謝工程在食品、現代醫藥、生物能源方面發揮重要作用[16-17]。

本文主要綜述了轉基因微生物生產花色苷的最新研究進展，重點在于提高微生物產品產量的代謝工程策略。此外，還總結了微生物生產花色苷的流程優化和影響因素，以全面理解相關分子工程和生化生產過程，以期為提高微生物生產花色苷產量提供參考。

1 花色苷的應用

花色苷具有抗氧化和抗菌作用，在功能性食品[18]、化妝品[19]和制藥[20-21]等方面具有廣泛應用。花色苷是水溶性色素，能使許多水果、蔬菜、花卉和其他植物呈現誘人的橙色、紅色和藍色等顏色，且具有獨特的營養特性；因此，也被廣泛用于食品行業[22]。4 種花色苷基著色劑已免于美國食品藥品監督管理局的認證[23]。某些類型花色苷存在特定的多酚結構和側鏈基團，能強烈吸收可見光和紫外線，因此可減輕紫外線對人類皮膚的氧化損傷，這些新的發現大大提高了花色苷在化妝品中的應用價值[24]。花色苷通過阻斷白介素-1β、腫瘤壞死因子α和核因子κβ，抑制神經發炎、神經退化和腦衰老[25]，并在預防癌癥、心血管疾病、神經退行性疾病、肥胖癥和糖尿病以及抗腫瘤等方面發揮重要作用。花色苷還能夠抑制凝血酶受體激活肽誘導的血小板聚集，然而其作用機制仍不明確[26-27]。此外，花色苷還可作為光敏染料應用于太陽能電池中，以取代太陽能轉化為電力過程中有毒、復雜和昂貴的過渡金屬配合物[28-29]。

2 花色苷的生物合成

花色苷是植物中廣泛存在的次生代謝產物，在自然條件下，植物合成的花色苷有助于吸引授粉昆蟲，以及保護植物免受輻射危害及病原體侵蝕[30]。植物花色苷由莽草酸途徑合成（圖2）：來自于苯丙氨酸的3分子丙二酰輔酶A和來自于酪氨酸的1分子4-香豆酰輔酶A在查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）催化下生成柚皮素查耳酮，進一步由查耳酮異構酶（chalcone ammonia lyase，CHI）轉換為其異構體柚皮素；柚皮素通過羥化酶，如類黃酮3’-羥化酶（flavonoid 3’-hydroxylase，F3’H）和類黃酮3’,5’-羥化酶（flavonoid 3’,5’-hydroxylase，F3’,5’H）進行羥基化修飾，產生不同的二羥黃酮醇（二羥槲皮素、二氫楊梅素和二羥山柰酚）。這些分子在二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）催化下生成無色花色素，如無色矢車菊素、白天竺葵苷元和無色翠雀花素；花色苷合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）氧化無色花色素生成不穩定的陽離子花色苷，該產物在類黃酮葡萄糖基轉移酶（flavonoid glucosyltransferase，FGT）的作用下發生糖基化反應，生成花色苷。

圖2 植物中花色苷的合成代謝途徑Fig. 2 Anabolic pathways of anthocyanins in plants

在植物中，花色苷合成后被轉移并儲存在液泡中，不同液泡pH值存在差異，導致花色苷呈現不同顏色[4,27]。花色苷在堿性和中性pH值條件下不穩定，但植物可以通過對花色苷進行結構修飾，或降低液泡pH值以及共色作用調節其在液泡中的穩定性[31]。但由于花色苷生物合成的復雜性和不穩定性，其商業化生產過程仍是一項艱巨的挑戰。

3 微生物代謝工程生產花色苷

微生物工程生產天然化學物質是一種有前途的、滿足工業需求和可持續的生產方式。大腸桿菌（Escherichia coli）是代謝工程中最常用的菌株，具有遺傳背景清晰、操作技術簡便、培養條件簡單和可大規模發酵等優點，被廣泛應用于天然類黃酮化合物的生物合成中。Jones等[32]通過優化共培養過程中菌株、碳源、溫度、誘導點和接種率等條件，顯著提高了E. coli生產類黃酮化合物的產率。Yan Yajun等[33]發現，重組E.coli細胞生產2 種花色苷（天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和C3G）的產量可達到毫克級，為花色苷在藥物和營養品中的商業化應用提供可能。近年來，宿主菌株范圍已擴大到釀酒酵母和委內瑞拉鏈霉菌[33]。最近，德國科學家將植物來源的O-甲基轉移酶、黃烷酮3-羥化酶和黃酮醇合成酶在谷氨酸棒桿菌中進行功能性表達，得到高濃度和高純度的紫檀芪、山柰酚和槲皮素[34]。

作為重要的類黃酮物質，花色苷因其巨大的工業和商業價值而備受關注。Yan Yajun等[35]利用重組E. coli進行花色苷的生物合成，產物C3G產量高達110 mg/L。將ANS和類黃酮-3-O-糖基轉移酶（flavonoid-3-O-glycosyltransferase，F3GT）克隆到E.coliBL21中并進行表達[36]，該重組E. coli使用柚皮素和圣草酚為原料時，可分別產生6.0 μg/L C3G和5.6 μg/L氯化天竺葵素3-O-葡萄糖苷；對培養條件進行優化發現，當使用阿福豆素和兒茶酚作為前體物質時，這2 種產物的產量可分別提高到113 mg/L和350 mg/L。E. coli生物合成花色苷示意圖見圖3。

圖3 E. coli生物合成花色苷示意圖[23]Fig. 3 Schematic diagram of anthocyanins biosynthesis in Escherichia coli[23]

3.1 微生物生產花色苷時酶的篩選

由于不同植物中同源基因編碼的酶在催化反應時表現出不同的動力學和熱力學活性，當這些酶在外源微生物中表達時，會產生不同的代謝行為且目標化合物生產水平不同。因此，從不同物種中篩選合適的酶是提高花青素等黃酮化合物和花色苷等類黃酮化合物產量的關鍵[37]。Yan Yajun等[33]對來自非洲菊、矮牽牛、金魚草和蘋果的異源ANS活性進行體外測試，并比較其體內催化效率，發現使用矮牽牛ANS在E. coli中制備花色苷時產量最高。同樣，在E. coli中生產柚皮素時，通過對不同同源物上游酶組合可以提高E. coli中柚皮素的產量，如將不同來源的4-香豆酰輔酶A上游酶4-香豆酸輔酶A連接酶、柚皮苷查耳酮上游酶CHS以及柚皮素上游酶CHI進行組合，柚皮素產量發生顯著變化[32]。采用該方法利用E. coli生產白藜蘆醇時，白藜蘆醇產量提高了2 300 mg/L[38]。

即使最適酶系統中酶的來源和組合均為最佳，但在微生物生產花色苷時并不一定能夠提高產量，這是因為這些植物來源的酶在原核細胞中屬于異源表達。通常，這些酶的編碼基因在表達之前需要經過一定的修飾（圖3）。例如，P450還原酶的原核表達可在其C端融合來自長春花的F3’,5’H片段，通過刪除其N端膜錨定位點處的4 個密碼子，修改起始密碼子后第5～6個堿基，使其由亮氨酸變為丙氨酸，從而構造一個適合細菌的表達結構，形成C端融合了長春花來源的F3’,5’H-P450嵌合羥化酶，該酶能更好地催化槲皮素的形成[39]。

除對個別代謝途徑中的酶進行修改外，將多種酶融合表達也是一種有效提高微生物生產花色苷產量的方法。研究表明，將擬南芥F3GT與牽牛花ANS的N端通過五肽連接進行融合，與單獨的ANS或F3GT相比，2 種酶融合后可極大提高C3G的產量。與獨立的酶相比，這種復合酶能夠更有效地進行連續生化反應，催化產生大量中間產物，并迅速糖基化，從而減少了降解的可能，極大提高了花色苷的合成效率[33]。

3.2 輔因子和輔底物對微生物生產花色苷產量的影響

充足的輔因子和輔底物對花色苷生物合成中的電子轉移、酶活化以及穩定性有重要意義。亞鐵離子、抗壞血酸鈉是ANS的輔因子，2-酮戊二酸是ANS的輔底物，它們可以幫助ANS氧化底物，促進花色苷的生成[40-41]。研究表明，抗壞血酸鈉和亞鐵離子的加入顯著提高了兒茶素底物的消耗和C3G的產量[33,39]。但在微生物生產花色苷過程中，輔底物2-酮戊二酸的添加并不是必須的，這可能是由于2-酮戊二酸是三羧酸循環的中間產物，因此其供應豐富[33]。

尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖（uridine-5’-diphosphate glucose，UDP-G）是一種重要的葡萄糖供體，能催化C3位糖基化反應，使不穩定的花色苷變得穩定，UDP-G的含量可影響糖基化花色苷的生產。常用的處理方法是提高其生物合成基因的表達或對其降解途徑加以抑制，如在E. coli中上調UDP-G合成代謝途徑關鍵基因（pyrE、pyrR、cmk、ndk、pgm、galU）的表達或抑制UDP-G消耗通路，這些改造使C3G產量較對照組提高了20 倍以上（從4 mg/L增加至97 mg/L）[15,33]。另一項研究顯示，pgm、galU、ANS和3GT過表達可以使C3G產量增加57.8%[33]。

S-腺苷甲硫氨酸也是花色苷生產時必不可少的輔底物，如芍藥素3-O-葡萄糖甲基花色苷的生產。通過CRISPR干擾介導的轉錄阻遏物MetJ沉默技術可提高S-腺苷-L-蛋氨酸的可用性，利用UDP-G和S-腺苷甲硫氨酸的雙重改善技術可將E. coli中芍藥花色苷產量提高到56 mg/L[42]。

3.3 轉運蛋白對微生物生產花色苷產量的影響

轉運蛋白通常分為3 類：攝取泵、外排泵和調節劑[43]。許多工程微生物產生的目標產物對宿主菌株有害，從而抑制了目標產物的生成。解決該問題的有效方法是利用外排泵將細胞質內的目標化合物轉移到細胞外環境，使產物維持在適當的水平，從而達到減毒的作用。例如，為提高E. coli中生物燃料的產量，引入一系列外排泵，負責將細胞內產生的生物燃料排出細胞外[44]。這種方法已被廣泛用于多種生物系統中，包括花色苷的生物合成。Lim等[36]選擇4 種外排泵acrAB、tolC、aaeB和yadH，發現只有yadH過表達能將細胞外C3G產量提高15%，說明C3G可能是yadH外排泵的底物；而acrAB和aaeB過表達，細胞外兒茶素和花色苷的含量與野生型細胞相當；此外，去除1 種負責兒茶素的分泌外排泵可進一步提高C3G產量。

除微生物自身運輸的調節外，對植物運輸調節系統的引進也是改善工程微生物中花色苷產生的可能途徑。花色苷在天然植物中合成后，被特定的轉運蛋白轉運并積聚在液泡中[45]。在玉米中，花色苷的轉運主要是利用液泡膜中存在的ATP結合轉運體ZmMRP3實現的[46]，通過Bronze-2編碼的谷胱甘肽S-轉移酶實現花色苷在液泡中的沉積[47]。在其他植物中，花色苷的運輸也與H＋梯度有密切聯系。在擬南芥中，Testa12基因編碼1 種屬于MATE家族的二級轉運蛋白類蛋白，其可通過H＋梯度逆向轉運花色苷至液泡中，而缺乏這種基因的突變體會大大降低花色苷在液泡中的積累[48]。但關于這些植物中的轉運機制，目前鮮有在微生物生產花色苷的工程中得以應用或嘗試。

3.4 微生物生產花色苷培養條件的優化

花色苷的高度不穩定性是其微生物生產過程中面臨的一個難題。在植物中，花色苷合成后穩定的存儲在液泡中[8,49]，與植物不同的是，細菌細胞作為人工生產的宿主缺乏花色苷穩定機制。

圖4 E. coli兩步催化法生物合成花色苷[23]Fig. 4 Two-step catalytic biosynthesis of anthocyanins by E. coli[23]

由于代謝工程細菌細胞正常生長的pH值約為7，使得花色苷合成后極不穩定。為穩定微生物中花色苷的合成，有學者提出了兩步催化法（圖4）[33]：第1步，在pH 7的培養基中培養細胞，以維持細胞正常生長和外源酶表達；第2步，培養到一定階段后將細胞轉移到pH 5的新鮮培養基中，以減少花色苷降解。此外，也可以添加相應保護劑，如添加谷氨酸可在低pH值條件下維持細胞生存，該方法可使E. coli的C3G產量提高15 倍左右[33]。

除pH值外，其他因素在花色苷生產中也發揮重要作用，如誘導時間、補料量、溶解氧和溫度。Lim等[36]發現定期誘導時工程化E. coli中C3G的產量最高，并且UDP-G和兒茶素與定期誘導結合后花色苷產量的提高效果更佳。

溶解氧對花青素微生物生產具有雙重效應。一方面，氧是ANS發揮功能的關鍵因素；另一方面，氧會氧化花青素。因此，最佳溶解氧濃度是微生物生產花色苷的關鍵。在利用微生物生產圣草酚的研究中發現，通過增加溶解氧濃度能促進兒茶素的合成，這可能與充足的還原型輔酶II供應有關[37]。然而，目前還鮮有關于氧氣對花色苷產量影響的報道。

溫度是影響細胞活性和外源蛋白表達的關鍵因素。溫度的波動會影響蛋白折疊，進而影響某些蛋白質形成，從而間接影響微生物生產有用化合物。在E. coli中生產阿夫兒茶素時，反應溫度為20 ℃時其產量可達到22.9 mg/L，而溫度為10 ℃時只能達到6.1 mg/L[32]。微生物生產花色苷的研究進展如表2所示。

表2 E. coli生產花色苷的影響因素及優化方法Table 2 Optimization of factors influencing the production of anthocyanins by E. coli

4 結 語

微生物代謝工程在花色苷生產中具有廣闊前景，本文概述了微生物代謝工程在花色苷生產中的研究進展，特別側重于廣泛應用的E. coli，同時，對微生物生產花色苷過程中影響因素的優化策略進行綜述。

目前，重組微生物生產花色苷的成本仍然遠遠高于植物提取的成本，其中最重要的原因是微生物生產花色苷產量較低。因此，要實現生物合成途徑的潛力最大化而副作用最小化，就必須對微生物合成花色苷的過程進行系列調整與優化。充分利用基因組測序、基因擴增等技術發現新的酶，以及基于目前的研究成果重新設計關鍵酶，構建花色苷生物合成的新途徑。同時，進一步優化微生物生產花色苷中雙磷酸葡萄糖供應的調節，由于UDP-G可參與海藻糖、糖原、甘油聚合物及其他生物活性化合物的合成，是細胞新陳代謝、細胞信號傳導和防御體系至關重要的參與者，因此如何滿足UDP-G供應問題也將成為一個巨大的挑戰。Cas9依賴的工具酶已發展到可同時調控E. coli多個基因的表達[50-51]，可以利用此方法對多種酶的表達水平、與花色苷生產直接或間接相關的轉運蛋白和輔助因子、限速因素和潛在調節劑進行微調。

代謝平衡作為另一個重要因素，也應被納入花色苷生產的過程優化中。代謝平衡可減少對宿主菌株的代謝負擔，即使在花色苷生產過剩情況下也能最大程度地維持細胞的正常生長和代謝。目前許多技術和方法都已在平衡代謝途徑中得以應用，如ePathBrick載體、ePathOptimize計劃、組合啟動子工程、合成RNA開關和動態調節細胞內代謝物等[52-58]。

除途徑相關因子外，運輸效率低下和缺乏儲存器也能導致微生物生產過程中花色苷被破壞。與植物相比，微生物缺乏花色苷運輸和穩定的內在機制[59]。目前，對花色苷在微生物細胞內部和跨細胞膜移動的路徑知之甚少，對花色苷和微生物結構之間的相互作用研究也較少。這些機制的闡明以及特異運輸蛋白的引進，將對花色苷的微生物生產提供支持。此外，類黃酮化合物前體物質價格昂貴，也增加了花色苷生產的總成本。利用這一技術以葡萄糖為起始生產C3G，將極大降低微生物培養成本，使該生產過程商業化變得可行[60]。

微生物生產花色苷的優化是一個復雜和耗時的過程。目前，研究者已鑒別出對花色苷生物轉化有顯著影響的多種因素，包括菌株和基質的選擇、酶的表達、生長和誘導條件等。然而，仍存在很多亟待解決問題。例如，不同酶動力學對目標產品生產的影響；正常細胞代謝對酶活性的作用；以及花色苷生產過剩對宿主表觀遺傳學和細胞遺傳學的影響等。對這些信息加以了解，有助于調整與優化控制微生物生產花色苷過程，因此，利用多學科技術相結合的方法同時對多方面因素進行評價，將成為微生物花色苷合成關鍵路徑控制和優化的關鍵。