表面等離子體共振傳感器在食品安全檢測中的應用

黃 昭，曹亞男，李 跑，趙 振，劉 霞*

（湖南農業大學食品科技學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

隨著人們對食品由需求型向質量型轉變，食品安全問題已成為全世界關注的一個焦點。食品安全問題主要包括農獸藥殘留超標、重金屬超標、生物毒素、微生物性危害和食品摻假等安全性問題。近年來食品安全問題頻發，這不僅威脅到人類的健康和生命財產安全，同時還制約著整個國家的進出口貿易及經濟發展。實施有效的食品安全監管是保障食品安全的重要手段，而有效的食品安全監管離不開相應的食品安全監測技術[1]，國內食品安全監管部門也將監管模式由部門監督逐步向技術監管轉變[2]。因此，發展快速、高靈敏食品安全檢測方法顯得尤其重要。

目前常用的食品安全檢測技術主要有色譜分析法[3]、免疫分析法[4]、熒光分析法[5]和傳感器技術[6]。色譜法是目前國家標準中的常規檢測技術之一，與質譜技術的聯用是我國大部分食品安全監測的重要手段[7]，但是該分析方法操作相對繁瑣、處理時間長、儀器設備昂貴、維護成本高，需要操作熟練的技術人員。免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析方法，最常見的就是酶聯免疫吸附測試法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），是目前一類重要的快速篩選方法，適用于現場檢測，但靈敏度有待提高。熒光分析法是使用熒光物質或潛熒光物質作為標記物的分析方法，由于背景干擾較大等原因，靈敏度不高，適合做定性分析，而在定量分析方面難以實現較高精密度[8]。目前快速發展的傳感器是一種能感受到被測量的信息，并能將感受到的信息按一定規律變換成為電信號或其他所需形式的信息輸出的檢測裝置。它具有簡單快速、靈敏和易操作等特點。傳感器通常由敏感元件和轉換元件組成。依據敏感元件的不同可分為三大類：第一類是基于力、熱、光、電、磁和聲等物理效應的物理傳感器；第二類是基于化學反應的化學傳感器；第三類是基于酶、抗體等分子識別功能的生物傳感器。研究者借助傳感器可以直接獲取大量人類感官無法直接獲取的信息，這使得它在科學研究中具有非常重要的地位。隨著化學、生物、計算機等學科的快速發展，目前開發的傳感器與納米材料、生物材料等相結合，在食品安全檢測領域發揮了越來越重要的作用。

食品基質復雜且大部分有害殘留物殘留濃度低，現有的食品安全檢測技術很難滿足既快速又靈敏的檢測要求，故急需發展更快、更敏感的檢測方法，以保證食品安全。傳感器技術是目前研究較多的食品安全快速檢測方法。其中表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器因靈敏度高、檢測速度快、檢測限低、可連續監測、所需試劑量少等優點在食品安全檢測領域發展迅速[9-11]。SPR傳感器技術于20世紀80年代由瑞典科學家Liedberg等首次運用于免疫球蛋白G抗體與其抗原相互反應的測定，隨后該技術被引入生物傳感器領域并迅速滲透到其中，在20世紀90年代開始陸續出現了較為成熟的SPR技術測量的商業化產品[12]，此后SPR傳感器的研究進入飛速發展的階段[13-14]。SPR傳感器相對于傳統的檢測手段更加快速靈敏，不僅能通過檢測獲得被分析物的濃度、親和力、動力學常數和特異性等信息，還能對其進行實時監測，在食品安全檢測領域得到了廣泛的關注。

1 SPR傳感器的基本原理

SPR是一種光學物理現象，一束P偏振光在一定的角度范圍內（入射角大于臨界角）入射到棱鏡端面，在棱鏡與金屬膜表面發生全反射現象，會形成消逝波進入到光疏介質中，并引發金屬薄膜中的自由電子形成表面等離子體（surface plasmon，SP）。SP的集體振蕩能夠產生一種沿著界面傳播的橫向電磁波，即表面等離子波（surface plasmon wave，SPW）。當消逝波的波矢量與SPW的波矢量相等時，引起金屬膜內自由電子產生共振，即SPR。當發生SPR時，檢測到的反射光強會大幅度減弱。此時，光子轉移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，使反射光的能量急劇減少，其中反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角隨金屬薄膜表面折射率的改變而改變，任何附著在金屬薄膜表面物質的量、構型等發生改變時，均可被檢測出來[8]，其原理見圖1。在對樣品分析檢測時，先在傳感芯片表面固定一層分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的分子識別膜相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導致SPR角度變化。通過檢測SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學常數和特異性等信息，并且能夠實時直接觀察分子相互作用[8-9,15]。

圖1 SPR傳感器原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the principle of SPR sensor

2 SPR傳感器在食品檢測中的應用

SPR傳感器由于其快速、高靈敏且無需標記的特點已成為食品安全檢測中一項先進的檢測技術[16]。目前SPR傳感器在食品安全檢測中的應用研究主要在檢測農獸藥殘留、重金屬、有害微生物及生物毒素等方面。

SPR傳感器的檢測方法主要有3 種，即直接法、夾心法和競爭法（圖2）[8,17]。直接法是將可特異性識別待測物的配體（如抗體、適配體等大分子物質）偶聯到SPR傳感芯片上直接與受體（待測物）結合，適用于檢測分子質量大于10 kDa的物質，因為分子質量小的物質引起的折射率小，使檢測的靈敏度降低。夾心法也稱為三明治法，該方法在直接法的基礎上再引入第二種配體，用兩個配體來固定待測物，提高了檢測的靈敏度和特異性。這種方法只適用于檢測至少有兩個抗原決定簇的分子。競爭法也稱為間接法，分為表面競爭法和溶液競爭法，常用于檢測小分子。表面競爭法是將配體固定到傳感芯片表面上，讓混合有待測物以及與待測物結合的大分子物質的溶液流過傳感芯片表面，使待測物同時與芯片表面的配體和溶液中的大分子物質競爭結合，因為大分子物質的用量是一定的，故可間接檢測到待測物的濃度。溶液競爭法是將待測物通過一定的方法固定到傳感器芯片，注入的樣品溶液混合有待測物和能與待測物特異性結合的配體，樣品溶液中待測物與芯片表面固定的待測物競爭性的結合溶液中的配體，此時SPR響應信號與樣品溶液待測物濃度成反比，可間接獲得待測物濃度。

圖2 SPR傳感器檢測待測物的方法示意圖Fig. 2 Schematic diagram of using SPR sensor for detecting targets

2.1 食品中農藥殘留的檢測

隨著農藥大量生產和廣泛使用，農藥殘留問題逐漸成為影響食品安全的重要隱患。果蔬中殘留農藥在人體內長期蓄積、滯留還會引發慢性中毒，誘發許多慢性疾病。目前，用SPR傳感技術檢測食品中農藥殘留已取得了很好的效果。

21世紀初，Oyama等[18]建立了一種基于核酸適配體來檢測阿特拉津的新型的SPR傳感器方法。該方法將含有P450 mRNA部分互補序列的DNA和肽核酸兩種探針固定在傳感器芯片上，成功檢測到了10 ng/L的阿特拉津，這種方法可以敏感、快速和簡單地檢測農藥殘留。為了提高SPR傳感器的靈敏度，降低檢測下限，金屬納米材料常用來增強SPR響應信號[19]。如Li Qian等[20]利用Au/Fe3O4納米復合材料和單克隆抗體對SPR傳感器金片表面進行進一步修飾，獲得了多菌靈的實時檢測傳感器，由于使用了納米復合材料，進而放大了SPR響應信號，獲得了更高的靈敏度。結果表明，該方法檢測多菌靈在0.05～150 ng/mL范圍內線性關系良好，檢出限為0.44 ng/mL。枸杞樣品的加標回收率為102.4%～115.0%，證明了這種基于Au/Fe3O4納米復合材料的SPR傳感器方法，對于微量分析物的檢測具有很大的潛力。

近年來，納米材料與分子印跡技術的結合給SPR傳感器帶來了創新的檢測方法，如基于磁納米粒子與分子印跡技術的磁分子印跡納米粒子，相對于抗體檢測成本得到了極大得降低，又保持了一定的分子特異性識別和放大SPR信號的能力，且磁性可以加快樣品前處理的速度，節省時間。Yao Guihong等[21]報道了一種應用磁分子印跡聚合物提高SPR傳感器檢測毒死蜱靈敏度的方法，該方法在0.001～10 mmol/L范圍內顯示出良好的線性關系，檢出限為0.76 nmol/L。Liu Xia等[22]發明了一種將SPR傳感器技術與磁性納米粒子相結合的直接檢測大豆中溴氰菊酯的新方法。與抗原特異性結合的免疫磁性納米粒子既可作為標記，又能夠增強SPR的折射率變化。結果表明，在0.01～1 ng/mL范圍內SPR的折射率變化與溴氰菊酯質量濃度呈良好的線性關系，檢測下限為0.01 ng/mL，與SPR傳感器直接檢測相比，靈敏度提高了4 個數量級。上述SPR傳感器的成功構建，實現了樣品前處理和傳感器檢測的完美結合，不僅檢測時間大大縮短，且檢測的準確性和靈敏度也得到了提高，為樣品前處理與傳感器檢測一體化開辟了新的途徑。

2018年，Hirakawa等[23]開發了多通道同時測定3 種農藥——啶酰菌胺、噻蟲胺和烯啶蟲胺的SPR免疫傳感器。他們將3 種農藥與牛血清白蛋白的綴合物固定在同一傳感器芯片的不同通道上。當3 種單克隆抗體的混合物注入SPR免疫傳感器時，每種通道會顯示出特異性反應性。該方法對啶酰菌胺、噻蟲胺和烯敏丙胺的檢測線性范圍分別為15～93、6.7～27 ng/mL和7.3～62 ng/mL。使用摻有啶酰菌胺、噻蟲胺和烯啶蟲胺混合物的蔬菜進行的回收率實驗顯示出良好的結果，回收率分別為75%～90%、88%～104%和72%～105%。該方法論證了SPR傳感器可用于同時測定蔬菜中的多種農藥殘留。同年，Thepudom等[24]將SPR與化學傳感器相結合，成功開發了使用SPR增強的光電化學傳感系統檢測農藥毒死蜱。當樣品以不同濃度注入電解質時，基于短路光電流的增加能夠檢測到毒死蜱的存在。通過金納米顆粒的局部SPR和光柵耦合傳播SPR的效果增強了短路光電流信號，使其可檢測濃度低至7.5 nmol/L的毒死蜱。這項工作表明，多種傳感的結合是傳統檢測農藥殘留技術的有前途的替代品。他們所提出的基于短路光電流信號的設計思想，可為傳感器敏感元件的創新構建提供新的方向。

2.2 食品中獸藥殘留的檢測

動物源食品中的獸藥殘留對人體健康產生了潛在的危險[25-26]，而待測物質具有濃度低、濃度差異大、樣品基質復雜、干擾物質多、殘留種類及代謝產物多樣等特點。目前動物源食品中主要的獸藥殘留包括四環素類、磺胺類、大環內酯類和喹諾酮類抗生素。SPR傳感器在獸藥殘留檢測中的應用非常早，20世紀90年代Sternesj?等[27]就應用SPR傳感器建立了一種測定牛奶中磺胺嘧啶（sulfamethazine，SMZ）的方法，該方法將SMZ共價固定到羧甲基右旋糖酐修飾的金膜上，添加了已知濃度SMZ的牛奶樣品，并建立了標準曲線。在樣品中加入SMZ的多克隆抗體，利用固定表面通過SPR傳感器檢測確定游離抗體的量。在牛奶樣品檢測中，該方法的平均相對標準偏差約為2%，檢出限小于1 mg/kg。

芯片表面的再生是很困難的，而不適當的再生也會縮短傳感器芯片的使用壽命，造成結果的不準確性，Li Hui等[28]建立了磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMT）的SPR傳感器連續檢測方法。將SMT-牛血清白蛋白偶聯物固定在羧甲基右旋糖酐修飾的金膜上，通過研究抗原的固定條件和優化抗體的稀釋濃度實現了金片再生和連續檢測。用磷酸鹽緩沖液配制不同濃度的SMT抗體，建立了標準曲線，檢出限為0.5 ng/mL。近年來，科研人員開發了更低廉更靈敏的SPR檢測獸藥殘留的方法，用于檢測動物源食品中的獸藥殘留，如蜂蜜[29]、牛奶[30]等樣品。在2013年，Verma等[31]利用SPR傳感器和分子印跡聚合物，以鹽酸四環素和鹽酸氧四環素兩種四環素作為模板分子，構建了SPR檢測四環素類抗生素的新方法，檢測范圍為0.0～0.96 mmol/L，該傳感器適用于食品中四環素類抗生素的商業化檢測，具有成本低、操作方便、探頭小型化、響應速度快、選擇性高、可重復性好等優點。Shrivastav等[32]開發了一種利用表層有分子印跡納米鍍銀涂層的光纖芯來檢測紅霉素的SPR傳感器，線性范圍為1.62 nmol/L～100 μmol/L，最低檢測限為1.62 nmol/L，該團隊還對傳感器在實際樣品中的適用性進行了研究，發現該傳感器與工業應用吻合較好、響應速度快（響應時間不到15 s）、簡單、成本低、選擇性強等優點，具有對分析物進行在線監測和遙感的能力。隨后，Sari等[33]在2018年開發了一種新的SPR納米傳感器，其結合了微乳液聚合、分子印跡和SPR這3 種技術，建立了更快速、更有選擇性地測定水溶液中紅霉素的傳感器檢測方法。SPR在食品獸藥殘留檢測中的開發利用，使得痕量的殘留能被檢測，提高了食品安全檢測的靈敏度，更加利于對食品安全的監督管理，也為以后食品安全標準法規的建立提供了參考。

2.3 食品中致病菌的檢測

致病菌的檢測是預防發生食源性疾病的關鍵。如果不能及時發現致病菌污染，可能會產生極其嚴重的食源性疾病。這要求在盡可能短的時間內獲得致病菌檢測分析的結果，但傳統和標準的致病菌檢測方法可能需要7～8 d才能得到結果。

20世紀90年代，科學家們對用SPR傳感器檢測致病菌已進行了初步的探索并取得了很好的效果。1998年，Fratamico等[34]開發了用于快速、實時檢測大腸桿菌O157:H7的SPR傳感器。他們在芯片上固定了蛋白A或蛋白G捕獲抗體，這些抗體又能與大腸桿菌結合，從而實現對大腸桿菌的檢測。此后，應用SPR傳感器檢測致病菌成為了熱門的研究方向[35-37]。2006年，Zezza等[38]開發了一種基于DNA分子雜交的SPR傳感器，對小麥中的真菌病原體黃色鐮孢菌進行檢測。以0.57 kb的黃色鐮孢菌DNA雜交片段的聚合酶鏈式反應擴增產物作為核苷酸探針，將探針固定在鏈球菌傳感器芯片上，并測試其與黃色鐮孢菌聚合酶鏈式反應產物的生物特異性相互作用。該傳感器成功用于檢測不同培養方式以及小麥樣品中自然感染的黃色鐮孢菌，結果表明，該傳感器對黃色鐮孢菌具有良好的特異性，對檢測溶液中含30 ng硬質小麥的樣品，其檢測下限為0.06 pg，所開發的SPR傳感器顯示了更高的靈敏度。在2012年，Torun等[39]對基于4 種不同傳感芯片檢測大腸桿菌的SPR傳感器進行了比對分析：1）將抗體非特異性地固定到SPR芯片表面檢測大腸桿菌；2）通過親和素-生物素相互作用將抗體定向固定到SPR芯片表面檢測大腸桿菌；3）自組裝單層共價固定抗體到SPR芯片表面檢測大腸桿菌；4）大腸桿菌用免疫鍍金磁納米分離并進行SPR傳感器測量（圖3）。結果表明，4 種方法中最有效的方法是基于鍍金磁納米粒子的方法。這種方法可以從樣品中快速簡單分離大腸桿菌，并在沒有任何標記的情況下快速檢測量化。該方法的線性范圍在30～3.0×104CFU/mL之間，檢測限為3 CFU/mL。

此后，Vaisocherová-Lísalová等[40]也報道了一種利用三步檢測法快速、靈敏地檢測食品中致病菌的多通道SPR傳感器，該傳感器可以同時檢測大腸桿菌O157:H7和沙門氏菌，并在對實際樣品漢堡包和黃瓜檢測時顯示了良好的敏感性和特異性。對黃瓜和漢堡提取物中大腸桿菌O157:H7的檢出限分別為57、17 CFU/mL和7 CFU/mL，沙門氏菌分別為4×103CFU/mL和11.7×103CFU/mL。此后，開發多通道SPR傳感器致病菌檢測技術成為了熱門[41-42]。

SPR傳感器在致病菌檢測方法的開發和創新，已經實現了快速、高靈敏、低檢測限和多通道檢測，因此可以在初期就能發現致病菌的存在，對于預防食源性疾病的發生具有重要意義。

圖3 SPR生物傳感器傳感策略示意圖Fig. 3 Schematic illustration of sensing strategies in SPR biosensors

2.4 食品中重金屬的檢測

食品中重金屬主要包括汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷等生物毒性顯著的金屬元素，由于重金屬難以被生物降解，因此會通過食物鏈成千百倍地富集進入人體，對人體造成嚴重的健康危害。利用SPR傳感技術檢測食品中的重金屬殘留是日漸成熟的一種方法。

Wu等[43]開發了基于哺乳動物金屬硫蛋白（metallothionein，MT）檢測金屬離子的SPR傳感器。該方法通過在傳感器芯片上的羧甲基葡聚糖固定MT，可以結合鎘、鋅或鎳，而不結合鎂、錳和鈣。他們在確定了MT固定化的最適pH值（pH 4.0）和結合金屬離子的最佳溫度（30 ℃）的條件下，檢測鎘、鋅或鎳的濃度可以達到mmol/L水平，可以用于定性和定量檢測金屬離子鎘、鋅和鎳。Caglayan等[44]采用自組裝方法將牛血清白蛋白和特異性適配體固定在傳感器芯片上，開發了兩種檢測汞離子的SPR傳感器方法。結果顯示，基于蛋白質的SPR傳感器檢測限為40.7 nmol/L，而基于適配體的SPR傳感器檢測限為26.0 pmol/L，且基于適配體的SPR傳感器的選擇性高于基于蛋白質的SPR傳感器。銀與汞離子可以形成汞合金，汞離子的吸附、氧化還原反應以及汞齊化會影響銀納米粒子的SPR效應，而大多數過渡金屬離子不會發生這種反應。基于該原理，Ramesh等[45]制備了銀納米粒子包埋聚乙烯醇的薄膜，并將其作為SPR傳感器芯片，對金屬汞離子進行了快速、高效和選擇性的檢測。該傳感器檢測汞離子的線性范圍為10 μg/kg～1 mg/kg，檢測下限為1 μg/kg，有效解決了檢出的汞濃度難以達到微克級的問題。更重要的是，這種傳感器可以在現場使用，可用于監管部門現場檢測以便及時發現食品安全隱患，也可以應用在食品原產地、工廠和市場的檢驗過程，篩選出不合格產品。

2.5 食品中生物毒素的檢測

生物毒素又稱天然毒素，是指生物來源并不可自復制的有毒化學物質，包括動物、植物、微生物產生的對其他生物物種有毒害作用的各種化學物質。早在1998年，Hsieh等[46]就利用SPR傳感器建立了一種快速檢測產氣莢膜梭菌β毒素的分析方法，通過傳感器芯片對產氣莢膜梭菌β毒素單克隆抗體的發酵液進行離線免疫，在20 min內可以得到結果，在實驗過程中還可實時監測生產過程中β毒素的積累。同期，Mullett等[47]開發一種用來測定真菌毒素——伏馬菌素B1的SPR傳感器。將伏馬菌素B1的多克隆抗體固定在金膜表面后，通入含有伏馬菌素B1的樣品，進行直接檢測。在抗體固定化步驟優化后，SPR傳感器直接檢測的檢出限為50 ng/mL，分析時間短于10 min。

此后，Homola等[48]開發了一種用于檢測牛奶中葡萄球菌腸毒素B的SPR傳感器，并用直接法和夾心法兩種方法檢測了葡萄球菌腸毒素B。結果表明該傳感器可直接檢測葡萄球菌腸毒素B，最低檢測限為5 ng/mL，而在夾心檢測模式下最低檢測限為0.5 ng/mL，可用于檢測復雜食品基質中各種微量的生物毒素。此后，SPR傳感器檢測生物毒素的檢測技術也在不斷地發展成熟[49]。所構建的SPR傳感器檢測時間短、靈敏度高、特異性強，能夠及時檢測出食品中含有的微量生物毒素，避免食品中毒事件的發生。

2.6 SPR在食品中其他有害物檢測中的應用

除了農獸藥殘留、致病菌、重金屬和生物毒素以外，SPR傳感器還被應用到檢測食品中其他有害物質，如非法添加物[50]、過敏原[51]和其他化學成分[52]等。2008年，Thompson等[53]為了監測歐洲境內非法使用萊克多巴胺的狀況，建立了一種基于溶液競爭法的SPR免疫傳感器。將所建立的方法與液相色譜-串聯質譜驗證性方法進行了比較。結果表明，兩種檢測方法都能夠檢測出尿液和肝臟中低含量（μg/kg）的萊克多巴胺，且結果一致。Li Ying等[54]建立了一種基于SPR的鹽酸克倫特羅快速檢測技術。他們首先應用直接法，通過研究鹽酸克倫特羅與抗體相結合的動力學過程，獲得其親和力，對鹽酸克倫特羅的抗體進行了篩選和。選用親和力最強的抗體，應用競爭方法對鹽酸克倫特羅進行了檢測，該方法的檢出限低于2 μg/L。檢測豬肉提取物樣品中鹽酸克倫特羅的質量濃度為2.75 μg/L。

此后，Kabiraz等[55]開發了一種用于高靈敏度檢測鹽酸克倫特羅的SPR免疫傳感器。由于尿液中含有免疫反應抑制劑，而這種抑制劑不能通過物理方法去除。該研究提出了用羧基改性的二氧化硅去除尿樣中抑制劑的過濾方法，有效地除去了免疫反應抑制劑。結果顯示，去除免疫反應抑制劑后，該傳感器對鹽酸克倫特羅的檢測限達到了100 fg/mL。牛奶中非法添加三聚氰胺，導致嬰幼兒健康受到極大的威脅，近年來研究人員開發了多種SPR傳感器檢測三聚氰胺的方法。其中，Zhang Lili等[56]在2018年開發了用于檢測牛奶和奶粉中痕量的三聚氰胺的SPR傳感器方法，該方法在0.1～10.0 nmol/L范圍線性關系良好，相關系數為0.999 1，用于檢測牛奶和奶粉的檢測限分別為62.6 pmol/L和56.4 pmol/L。這些研究為食品中其他有害物的檢測提供了新的思路，通過不斷地創新發展，實現了從低濃度檢測到痕量檢測的飛躍，極大提高了檢測的靈敏度，保障了食品安全。

3 結 語

經過幾十年的發展與應用，SPR傳感器儀器及其檢測方法得到了進一步發展與成熟。從單通道SPR傳感器到多通道SPR傳感器，實現了高靈敏多組分同時檢測。而便攜式SPR傳感器可實現現場實時篩選與監測，有望走出實驗室走向大眾化。隨著SPR儀器的不斷完善和分子識別芯片構建能力的不斷增強，未來SPR傳感器儀器更加便攜和智能化，可實現大量樣品的實時檢測和分子水平的快速、超痕量分析。同時，與電化學傳感技術、色譜技術等的聯用也必將拓寬SPR傳感器在檢測領域的應用。雖然目前國內外用于食品安全檢測的主要儀器還是液相色譜、質譜等傳統儀器，相信在不久的將來，SPR傳感器在食品安全領域會得到更加廣泛的應用。可以期待SPR傳感器在現場對食品中危害物進行篩查和快速定性定量檢測，以消除食品安全隱患，保障國民的生命健康。