產前超聲診斷胎兒房室間隔缺損及基因檢測分析

谷孝艷，楊喜惠，郝曉艷，張 燁，孫 琳，韓建成，劉曉偉，何怡華*

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院超聲科 胎兒心臟病母胎醫學北京市重點實驗室，北京 100029；2.中國新疆維吾爾自治區婦幼保健院超聲科，新疆 烏魯木齊 830001)

房室間隔缺損(artioventricular septal defect, AVSD)是心內膜墊發育異常導致的一組心臟畸形，在活產兒中的發生率為0.024%～0.031%[1]。目前產前AVSD檢出率已達57%～92%[2-3]。AVSD常與染色體異常相關，尤其唐氏綜合征，其在唐氏綜合征患兒中的發生率比染色體正常兒童高1 000倍。隨著基因測序技術的發展，對胎兒AVSD遺傳學檢測不再局限于染色體水平，可有更多、更精準的發現，如單基因突變。本研究評估胎兒AVSD的分型及其合并心內及心外畸形，并以二代測序技術低深蓋度全基因組測序及全外顯子測序檢測AVSD基因的特征。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2013年9月—2017年6月首都醫科大學附屬北京安貞醫院超聲產前檢查資料，孕婦年齡21～35歲，平均(28.3±3.5)歲；共21 179胎，孕周為16～37周，平均(25.0±5.9)周；共診斷150胎AVSD，47胎具有遺傳學檢測結果。

1.2 儀器與方法 采用GE Voluson E8/E10彩色多普勒超聲診斷儀進行胎兒超聲心動圖檢查，頻率4～8 MHz 2D/3D容積探頭，按美國超聲心動圖協會胎兒超聲心動圖檢查指南進行規范化操作。由2名具有5年以上超聲心動圖診斷經驗的副主任醫師分析圖像，評估AVSD分型及其合并畸形。

以DP318基因組提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行遺傳學檢測。取引產胎兒臍帶組織，同時抽取父母外周靜脈血各5 ml(乙二胺四乙酸抗凝)，即刻置于-80°C冰箱冷凍，并送檢進行低深度全基因組測序及全外顯子測序。按照試劑盒步驟說明提取胎兒臍帶組織的基因組DNA(gDNA)。基因測序分2步完成：先以低深度全基因組測序，測序平臺為Illumina Hiseq 2500，檢測100 kb以上的拷貝數變異，對檢出的染色體異常進行注釋，并根據DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、Decipher(https://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)數據庫綜合分析檢出的變異；之后采用全外顯子組測序序列捕獲技術測序，捕捉全基因組外顯子區域DNA，富集后進行外顯子目標區域捕獲測序(Illumina Hiseq 2500，測序類型:PEl00 bp)，對原始測序數據進行低質量過濾，采用標準生物信息分析流程檢測單核苷酸變異和小的插入缺失，對變異位點進行檢出、過濾和注釋。變異位點過濾標準包括人群數據庫中頻率(ExAC或千人基因組)<5%、最小覆蓋深度為10 X，變異功能變化(非同義突變、剪切位點變化、無義突變、移碼突變等)等。最終對變異的家系進行Sanger測序驗證。

以上檢查均經孕婦及家屬同意，并簽署引產胎兒生物標本提取及遺傳學檢測知情同意書。

2 結果

2.1 產前超聲心動圖 47胎AVSD中，7胎(7/47,14.89%)為部分型AVSD，2胎(2/47,4.26%)為過渡型AVSD，38胎(38/47,80.85%)為完全型AVSD(圖1)。38胎完全型AVSD中，10胎(10/38，26.32%)為非均衡型AVSD，28胎(28/38，73.68%)為均衡型AVSD。

圖1 孕婦30歲，妊娠24周，胎兒完全型AVSD A.胎兒超聲心動圖四腔心切面圖示十字交叉消失(RA:右心房；RV:右心室；LA:左心房；LV:左心室)； B.彩色多普勒圖像示共同房室瓣反流

13胎(13/47，27.66%)合并單純心內畸形，5胎(5/47，10.64%)合并單純心外畸形，14胎(14/47，29.79%)合并心內及心外畸形，15胎(15/47，39.91%)無合并心內及心外畸形。共27胎存在心內畸形(27/47，57.45%)，其中23胎(23/27，85.19%)錐干系統畸形，包括11胎右室雙出口(11/23，47.83%)、4胎(4/23，17.39%肺動脈閉鎖)、2胎肺動脈狹窄(2/23，8.70%)、4胎大動脈轉位(4/23，17.39%)、1胎左肺動脈懸吊(1/23，4.35%)和1胎共同動脈干(1/23，4.35%)；2胎肺靜脈畸形引流(2/27，7.41%)，2胎主動脈縮窄(2/27，7.41%)。

47胎AVSD中，18胎完全型AVSD、1胎部分型AVSD，共19胎合并心外畸形(19/47，40.43%)，包括內臟異位17胎(17/19，89.47%)和頭部淋巴管囊腫(1/19，5.26%)及雙手足內翻并多指/趾畸形各1胎(1/19，5.26%)。

2.2 基因檢測 對47胎臍帶組織提取DNA建庫，其中4胎組織降解。43胎接受低深度全基因組測序及全外顯子測序，結果顯示22胎(22/43，51.16%)基因陽性，包括11胎21三體，2胎18三體(圖2)，1例13三體，2胎染色體大片段重復，6胎單基因突變。單基因突變包括CCDC14、EVC、PQBP1、ZFPM2、ARMC4、DNAH11。

圖2 孕婦30歲，妊娠24周，胎兒完全型AVSD A.胎兒臍帶組織低深度全基因組測序分析電子核型圖示18號染色體大片段重復； B.胎兒臍帶組織低深度全基因組測序結果示意圖示18號染色體拷貝數明顯增多

27胎AVSD合并心內畸形，其中11胎(11/27，40.74%)基因檢測結果陽性；19胎AVSD合并心外畸形，其中15胎(15/19，73.68%)基因檢測結果陽性；14胎AVSD合并心內及心外畸形，其中11胎(11/14，78.57%)基因檢測結果陽性。

3 討論

AVSD是胚胎發育過程中心內膜墊發育異常所致先天性心臟畸形，主要特征為房室瓣周圍間隔組織部分缺如及房室瓣發育異常；根據間隔水平分流情況分為部分型、過渡型及完全型AVSD[4-5]。胎兒AVSD與染色體非整倍體關系密切，尤其21三體，約40%的AVSD胎兒合并21三體[6]，而AVSD為21三體患者最常見畸形，提示一旦超聲發現胎兒AVSD，非常有必要進行遺傳學檢測。

本研究采用超聲心動圖評估胎兒AVSD分型及其合并畸形，并分析二代測序技術低深度全基因組測序及全外顯子測序檢測AVSD基因的特點，以期為制定圍產期管理策略提供依據。活產兒AVSD發生率0.024%～0.031%[1]，胎兒期AVSD發生率尚未見報道。本組胎兒期AVSD發病率0.71%(150/21 179)，可能與本院為胎兒心臟病轉會診中心有關；且一經診斷胎兒AVSD，大部分孕婦選擇終止妊娠，而AVSD胎兒可能胎死宮內，使得本組胎兒期AVSD發病率明顯高于活產兒。本組超聲心動圖明確診斷胎兒AVSD后，均提示孕婦接受母胎醫學會診及咨詢；基于對預后及可能發生的遺傳學異常的了解，大部分孕婦及家庭選擇終止妊娠。

本組47胎AVSD接受遺傳學檢測，超聲診斷時孕周為16～37周，平均(25.0±5.9)周，其中80%為22周超聲排查畸形發現異常而經胎兒超聲心動圖專項檢查檢出。超聲可于妊娠早期發現AVSD，常在彩色多普勒檢查基礎上聯合其他危險因素，如頸項透明層增加、三尖瓣反流、異常靜脈導管血流頻譜及母體血清學檢測異常等進行提示性診斷，再以有創檢查如羊水穿刺等進行染色體非整倍體檢測[2,7]。對妊娠早期檢查未見異常的大部分胎兒AVSD，超聲診斷時間為孕18～24周，即在中孕期排畸檢查時發現異常后經胎兒心臟專項檢查診斷。

隨著技術的發展，目前胎兒超聲心動圖對18～24周胎兒AVSD已不易漏診，但需注意合并心內外畸形。AVSD胎兒易合并心內畸形，王琰等[8]報道其發生率為67.6%，以錐干系統畸形發生率最高；繆偉等[9]發現胎兒AVSD發生大血管畸形的概率53.6%，本研究結果與之相近，提示產前診斷AVSD時應警惕其他心內畸形，尤其錐干系統畸形。完全型AVSD發生心外畸形的概率約57.4%[8]，主要包括胎兒水腫、頸部淋巴管囊腫、胎兒鼻骨發育不良、內臟反位、十二指腸閉鎖或狹窄等[8,10]。本研究中40.43%的AVSD胎兒合并心外畸形，其中89.47%為內臟異位，其他系統畸形發生率低，推測與本組進行胎兒心臟專項檢查時孕周為(25.0±5.9)周有關：妊娠早期檢出的AVSD胎兒可能存在多系統畸形，后經遺傳學檢測明確診斷；而不存在多系統畸形的AVSD胎兒多于孕22～24周經心臟專項檢查發現心臟結構異常而獲得明確診斷，此時其他系統畸形往往不明顯，而心臟異常相關的內臟異位發生率高。

以往胎兒異常遺傳學檢測多局限于染色體層面[11]。隨著基因測序技術的發展，特別是二代測序技術的快速發展，目前對于AVSD的遺傳學檢測趨于精準深入。既往研究[12]認為約1/4唐氏兒合并AVSD，58%的完全型AVSD與21三體相關，亦常合并其他染色體異常，如18三體，13三體，22q11微缺失，8p21-p23缺失，46XY等，或為某一綜合征的心臟表現，如Charge綜合征，其致病基因系CHD7，75%合并先天性心臟病，最常見者為法樂氏四聯癥和完全型AVSD；Noonan綜合征致病基因系PTPN11，約18.3%合并完全型AVSD；部分型AVSD常與Ellis-van Crevel(EVC)綜合征相關，其致病基因系EVC/EVC，50～60%存在心臟異常，最常見者為單心房、AVSD及肺靜脈畸形引流[2,7]。

AVSD亦可單發，即不作為某綜合征的心臟表型，或不合并其他表型，其遺傳學機制可能為多因素遺傳或新發變異，發生率為1/10 000[13]，已發現主要致病基因為ALK3、BMP4、GATA4、CRELD1、NKX2.5等[14-15]。本研究采用低覆蓋度全基因組測序及全外顯子測序發現AVSD的遺傳學異常不僅包括非整倍體、染色體大片段重復，同時存在單基因突變，包括CCDC14、EVC、PQBP1、ZFPM2、ARMC4、DNAH11，進一步證實AVSD基因改變可能發生在不同基因水平，同時受多因素影響；AVSD合并心內畸形胎兒基因檢測結果陽性率40.74%，合并心外畸形胎兒基因檢測結果陽性率高達73.68%，高度提示AVSD合并心外畸形胎兒更多存在基因異常。

綜上所述，胎兒AVSD、尤其完全型AVSD易合并心內外畸形。AVSD胎兒基因異常發生率較高，合并心外畸形時更易合并染色體異常，產前超聲診斷AVSD后應行遺傳學檢測。二代測序技術有助于發現不同水平基因異常。