酸熱誘導大豆分離蛋白納米顆粒形成及其荷載姜黃素的特性

袁 丹,趙謀明,張思銳,黃 燚,周非白

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東 廣州 510640)

隨著人們對膳食營養與健康的日益重視,功能性食品的開發己成為食品領域研究者的關注熱點。姜黃素(curcumin,Cur)是一種天然來源的疏水性多酚,具有一系列潛在有益的生物和藥理作用,包括抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等活性[1],在功能性食品領域發展前景廣闊。然而,Cur存在水溶性低、加工穩定性差以及生物利用度低等問題,嚴重制約了產業化應用及人群積極性反饋。大量研究表明,通過包埋荷載技術可有效實現Cur等功能因子的穩態化。包括納米顆粒[2]、乳液[3]、脂質體[4]、膠束[5]以及凝膠[6]等多種輸送載體不僅可以提高Cur的水溶性和環境穩定性,還能增強其在腸道細胞內的滲透性,提高Cur的生物利用度。與合成聚合物及其他生物大分子相比,蛋白質在生物相容性及環境友好等方面更具優勢[7]。其中通過納米技術制備納米級的蛋白載體還利于發揮Cur的尺度效應[8-10]。相比于動物蛋白,植物蛋白來源廣泛、價格低廉、資源可再生且營養價值可觀,是蛋白基納米輸送載體的理想原料。作為現今食品工業生產和利用最廣泛的植物蛋白,大豆蛋白市場可接受度高,且己有研究將其用于β-類胡蘿卜素[11]、香草醛[12]和白藜蘆醇[13]等多種疏水活性物質的荷載。

基于Cur在有機溶劑中的溶解特性,為了提高其包埋率,反溶劑法被廣泛應用。但是反溶劑過程中消耗大量的有機試劑以及純水,不符合現代食品工業環保綠色的生產原則。此外,許多研究表明經反溶劑法制得的高荷載Cur納米顆粒,容易發生因本身結構性質不夠穩定導致的橋連聚集或解離,一般還需通過加入化學試劑進行二次交聯[14-15]。因此,研究操作簡便且綠色環保的物理方法制備大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)-Cur納米顆粒極具工業應用價值。通過粉碎、研磨、均質、超聲、X射線處理均可制備出包載Cur的納米顆粒,其中均質和超聲處理工序簡單、綠色環保,可在工業生產中得到大規模應用[16-17]。Tapal等[18]利用均質成功制備了穩定的SPICur納米顆粒,提高了Cur的水溶性和生物利用率。Zhang Yuanhong等[19]利用超聲技術誘導SPI酶解不溶性聚集體與Cur共組裝,制備出了大豆肽-Cur納米復合顆粒,顯著提高了Cur在細胞內的生物活性。

關于Cur穩態化的研究表明,SPI的結構很大程度上影響其與Cur之間的相互作用,進而影響蛋白質-Cur顆粒形成并對Cur溶解度的提高起關鍵作用。SPI疏水性氨基酸含量較高(＞60%),還含有相當大比例的極性和帶電殘基,這為其與生物活性小分子通過疏水相互作用、氫鍵以及經典相互作用提供了可能[20-21]。Chen Feiping等[22]發現蛋白質的疏水性質是影響SPI與Cur結合的重要因素,其中疏水相互作用和二硫鍵是保證結合親和力的必要條件。Chang Chao等[23]則發現氫鍵、疏水相互作用和靜電作用在蛋白-多糖復合體系中對Cur穩定性的提高起決定作用。實驗室前期研究不同pH值、加熱溫度和時間條件下蛋白的粒徑、多分散系數(polydispersity index,PDI)、濁度、電位等的變化,發現通過在等電點附近加熱處理(pH 5.9,95 ℃,30 min)SPI可誘導蛋白自組裝,形成最大量的、穩定的、球形的、具有核-殼結構的SPI納米顆粒[24]。結合蛋白結構對Cur穩態化的影響,上述通過二硫鍵和疏水相互作用穩定且具有疏水內核的蛋白結構為荷載以Cur為例的疏水性活性物質提供了可行性。

本實驗以SPI為原料,在特定pH值條件下(pH 7.0、5.9)靜態加熱處理(95 ℃、30 min)誘導SPI自組裝形成納米顆粒,分別記作HSPI及HSPI(pH 5.9),系統表征了它們的粒徑、PDI、表面疏水性以及表觀形貌,并利用熒光光譜研究它們與Cur的相互作用。通過均質或超聲處理制備SPI-Cur納米顆粒,探究蛋白-Cur納米顆粒中Cur的水溶解度以及顆粒的性質和貯藏穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍脫脂豆粕(蛋白質質量分數約為45%) 山東禹王實業有限公司;Cur 上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇(分析純) 廣州市叢源儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

SL2000A多功能粉碎機 青島納麗雅廚具設備有限公司;RW20電動攪拌機 德國IKA公司;pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;CR22N高速冷凍離心機日本Hitachi公司;UH-150A超聲波細胞破碎儀 天津Autoscience公司;WN7501V紫外-可見分光光度計上海佑科工業設備有限公司;Zetasizer Nano ZSP納米粒度儀 英國Malvrern公司;JEM-2100F透射電鏡(transmission electron microscope,TEM) 日本電子株式會社;熒光光譜儀 芬蘭Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

采用傳統堿溶酸沉的方法[25]。將脫脂低溫豆粕粉碎至粉末,過篩,然后以1∶10的質量比加入去離子水分散,將分散液調節至pH 8.0,室溫下攪拌2 h,然后10 000×g離心20 min,上清液經紗布過濾后調至pH 4.5,于4 ℃靜置30 min后10 000×g離心20 min,收集沉淀,將沉淀用去離子水洗2～3 遍后稱質量,再以1∶7的質量比加入去離子水緩慢攪拌,該過程溶液調至pH 7.5,充分溶解后4 ℃透析48 h,最后冷凍干燥備用。

1.3.2 SPI納米顆粒的制備

特定pH值條件下熱處理蛋白制備蛋白納米顆粒的方法參照課題組己有的條件開展[24]。稱取一定量的SPI溶解于去離子水中配成質量分數1%的SPI溶液,室溫下攪拌2～3 h,4 ℃水化過夜,待恢復至室溫后,一部分SPI溶液用1 mol/L NaOH溶液調至pH 5.9,剩余SPI溶液調節至pH 7.0。取一定量pH 5.9和pH 7.0的SPI溶液置于95 ℃的水浴鍋中靜態加熱處理30 min,冷卻至室溫,所得溶液即為熱處理SPI溶液,分別記為HSPI和HSPI(pH 5.9)。

1.3.3 SPI納米顆粒的結構表征

1.3.3.1 顆粒粒徑分布及PDI的測定

采用動態光散射(dynamic light scattering,DLS)技術,蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(10 mmol/L、pH 7.0)稀釋至0.5 mg/mL后用納米粒度儀測定。所有樣品均在25 ℃進行測定,平行測定3 次。

1.3.3.2 蛋白質表面疏水性測定

SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)的表面疏水性采用1-苯胺基萘-8-磺酸鹽(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)法[26]。ANS-和蛋白溶液分別用10 mmol/L、pH 7.0的PBS配制成濃度為8 mmol/L和質量濃度1 mg/mL,蛋白溶液再稀釋至0～0.5 mg/mL,在試管中分別加入3 mL稀釋后的蛋白溶液和20 μL ANS-溶液,振蕩混勻后測定混合液的熒光強度,測定條件為:激發波長365 nm、發射波長484 nm、狹縫寬度2.5 nm。以熒光強度為縱坐標、蛋白濃度為橫坐標作圖,線性擬合后得到的斜率即為樣品的表面疏水性。

1.3.3.3 顆粒形貌

蛋白顆粒的形貌特點通過TEM進行觀察。將蛋白溶液稀釋至0.5 mg/mL后取一滴置于碳支持膜銅網上,于白熾燈下照射30 s后立即用濾紙吸去過量的樣品,然后在銅網上滴加一滴磷鎢酸(20 mg/mL)繼續在白熾燈下照射60 s,然后用濾紙吸去過量的磷鎢酸,過夜晾干后用TEM進行觀察,掃描電壓為80 kV。

1.3.4 熒光光譜分析

蛋白質與Cur之間的相互作用通過蛋白質內源熒光和Cur熒光光譜分析,參考Tapal等[18]的方法。SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)蛋白溶液用10 mmol/L、pH 7.0的PBS稀釋至蛋白質質量濃度為0.5 mg/mL,Cur溶于無水乙醇至0～200 μmol/L,取一定體積稀釋后的蛋白溶液和Cur溶液,使得最終Cur濃度分別為0～10 μmol/L,攪拌5 min后用熒光光譜儀測定,測定條件為:激發波長280 nm,發射波長300～450 nm,激發和發射狹縫寬度均為2.5 nm。等體積PBS與Cur溶液混合作為空白對照,最終樣品實際熒光光譜為減去空白對照后的光譜。

Cur用Tris-HCl(50 mmol/L、pH 7.4)溶解至10 μmol/L,將SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)蛋白溶液用去離子水稀釋至蛋白質質量濃度為0～10 mg/mL,然后將蛋白溶液與Cur溶液等體積混合攪拌1 h后測定其熒光光譜,測定條件為:激發波長420 nm,發射波長450～700 nm,激發和發射狹縫寬度分別為2.5 nm和5 nm。等體積蛋白溶液與Tris-HCl混合后作為空白對照,最終樣品實際熒光光譜為減去空白對照后的光譜。

1.3.5 SPI-Cur納米顆粒的制備

將新鮮制備好的10 mg/mL的SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)蛋白分散液,加入過量的Cur粉末,攪拌20 min混合均勻后,將混合液進行均質或超聲處理。均質條件為12 000×g、2.5 min,均質后在20 ℃、3 000×g離心15 min去除游離的Cur,得到的上清液即為均質后樣品,分別記為SPI-Cur、HSPI-Cur和HSPI(pH 5.9)-Cur。超聲條件為:超聲功率150 W、輸出頻率22 kHz、時間5 min,超聲后離心,離心條件同上,得到的上清液即為超聲后樣品,分別記為U-SPI-Cur、U-HSPI-Cur和U-HSPI(pH 5.9)-Cur。

1.3.6 SPI-Cur納米顆粒的形成與表征

1.3.6.1 SPI-Cur納米顆粒中Cur水溶性的測定

SPI-Cur納米顆粒中Cur的質量濃度即為Cur在水溶液中的溶解度,通過如下方法測得:將均質和超聲后離心得到的上清液用無水乙醇充分萃取出其中的Cur,在10 000×g、20 min條件下離心除去蛋白質后,測定上清液于426 nm波長處的吸光度,并根據標準曲線y＝0.084x+0.000 7(R2=0.999 9)計算Cur的濃度。

1.3.6.2 蛋白-Cur納米顆粒粒徑及其分布的測定

SPI-Cur納米顆粒的顆粒粒徑及其分布的測定方法同1.3.3.1節。

1.3.6.3 SPI-Cur納米顆粒熒光光譜分析

將均質和超聲后得到的SPI-Cur樣品稀釋20 倍后測定其蛋白質內源熒光及Cur熒光光譜,測定條件同1.3.4節。

1.3.7 超聲后SPI-Cur納米顆粒的貯藏穩定性

將新鮮制備的超聲后SPI-Cur樣品等分分裝至同樣的實驗瓶中,密封后在室溫(25 ℃)避光貯藏,定期測定顆粒粒徑的大小、分散性以及其上清液中Cur的含量。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 SPI納米顆粒的形成與表征

2.1.1 顆粒粒徑、分散性和表面疏水性

實驗首先利用DLS探究了pH 7.0及pH 5.9條件下加熱對蛋白粒徑及PDI的影響。如表1所示,SPI雖然平均粒徑小(＜80 nm),但是粒徑分布不均勻(PDI＞0.5),與相關報道一致。熱作用使得SPI發生熱變性形成聚集體,顯著增加其平均粒徑,但是同時增加其分散均一性。這是由于熱處理引起了蛋白構象部分去折疊而誘導聚集,同時過程中形成了更多的二硫鍵使得顆粒相對穩定均一[27]。其中,經pH 5.9加熱得到的樣品HSPI(pH 5.9)因加熱后回調至pH 7.0過程中吸水溶脹導致粒徑增大[24];而加熱后暴露出來的α’-、α-亞基具有延伸區域,己被證明可以抑制SPI的聚集,所以使顆粒能夠維持均一[28]。進一步通過ANS－法測定3 個蛋白樣品的表面疏水性,結果表明,熱處理可顯著增加蛋白表面疏水性(P＜0.05),可能與熱變性會引起其結構的伸展及表面修飾有關。其中,pH 5.9條件下加熱蛋白可使巰基轉變成二硫鍵[24],而二硫鍵的周圍常聚集著疏水性氨基酸,這使得HSPI(pH 5.9)的表面疏水性最高。

表1 SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）的粒徑、PDI以及表面疏水性Table 1 Particle size, PDI and surface hydrophobicity of SPI,HSPI and HSPI (pH 5.9)

2.1.2 形貌學

為了更好地了解SPI納米顆粒以及比較SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)三者的差異,通過TEM觀察其表觀形貌,如圖1所示。SPI表面光滑,大部分為近乎球形顆粒,其顆粒大小不一;HSPI表面粗糙,顆粒感減弱,有明顯的聚集體出現;而HSPI(pH 5.9)均為球形,表面較SPI略粗糙,顆粒大小均一,雖有部分聚集在一起,但仍以單獨的顆粒呈現,表觀粒徑較SPI大;這些結果與DLS測得的結果一致。HSPI和HSPI(pH 5.9)聚集體的形成是由于熱處理導致SPI構象部分去折疊,暴露了球蛋白分子內部的疏水基團,表面疏水性升高,同時誘導形成的二硫鍵促進了蛋白顆?；螂亩沃g的相互作用[29]。而加熱使得肽段伸展并吸附在顆粒的表面,因此HSPI和HSPI(pH 5.9)的表面呈現粗糙狀。HSPI(pH 5.9)粒徑較大可能是由于在從弱酸性條件回調至pH 7.0過程中顆粒吸水溶脹所致。此前對HSPI(pH 5.9)結構特征的研究發現帶正電的堿性多肽與β-亞基一起被包裹在顆粒的內部,形成了疏水核心,同時由于帶負電的α’-、α-亞基和酸性多肽相對更親水而位于顆粒的表面[24]。由此得出結論,通過在95 ℃加熱SPI溶液(pH 5.9)30 min誘導了SPI發生自組裝,形成了具有核-殼結構的球形SPI納米顆粒。此外,與DLS測定的平均粒徑相比,TEM的結果普遍偏小,可能與空氣干燥過程及顆粒在干燥過程中的結構收縮有關[24]。

圖1 SPI（A）、HSPI（B）和HSPI（pH 5.9）（C）顆粒的TEM圖Fig. 1 TEM images of SPI (A), HSPI (B) and HSPI (pH 5.9) (C) particles

2.2 SPI與Cur相互作用研究

圖2 不同濃度Cur對SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）內源熒光的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of curcumin on intrinsic fluorescence of SPI, HSPI and HSPI (pH 5.9)

SPI分子中因含有疏水性氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)而具有熒光特性,蛋白質內源熒光的變化可直接反映疏水性氨基酸所處微環境的變化。生物活性小分子的結合會導致蛋白質熒光猝滅,因此為了研究SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)和Cur之間的相互作用,通過分析蛋白質和Cur的熒光光譜闡述。如圖2A～C所示,在280 nm的激發波長處,SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)都呈現出強熒光強度,其中SPI在334 nm波長處具有最大熒光強度,HSPI和HSPI(pH 5.9)在340 nm波長處具有最大熒光強度。這一現象表明經過熱處理后SPI內源疏水氨基酸所處微環境更加親水,這是由于熱作用誘導聚集的同時使得蛋白質結構伸展和疏水基團暴露所致。而隨著加入的Cur濃度(0～10 μmol/L)增加,蛋白質的熒光強度逐漸降低,并且最大熒光發射波長發生藍移,表明Cur與蛋白質的疏水性氨基酸發生了結合,使得它們所處的微環境極性降低,說明了Cur與SPI結合的作用力主要是疏水相互作用。為了更直接的表征兩者結合的親和力,通過Stern-Volmer方程計算Cur對SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)內源熒光的猝滅常數(Ksv):

式中:F0和F分別為未加入Cur和加入Cur時蛋白的熒光強度;C為混合液中Cur的濃度/(μmol/L);Ksv為Stern-Volmer猝滅常數。

以F0/F為縱坐標、Cur濃度為橫坐標作圖(圖2D),經線性擬合后發現Cur濃度與SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)三者的F0/F值都呈現出良好的線性關系(R2≥0.99),表明Cur可均勻的結合在蛋白的疏水基團上。計算得到SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)與Cur結合的Ksv值分別為0.274、0.454、0.550 μmol/L,可以發現熱處理SPI的Ksv值相比SPI顯著提高(P＜0.05),并且HSPI(pH 5.9)猝滅效果更加顯著,說明HSPI(pH 5.9)與Cur之間具有更高的親和力,這是HSPI(pH 5.9)表面疏水性高賦予蛋白的獨特性質。

Cur的固有熒光對其周圍環境的極性高度敏感,因此,研究了不同SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)濃度下Cur的熒光特性。如圖3所示,沒有SPI的情況下在420 nm波長處激發游離Cur時呈現的熒光峰強度非常低,這主要是由于水溶液中Cur的溶解性差。隨著蛋白質量濃度(0～5 mg/mL)的增加,Cur的最大熒光強度也隨之增加,這表明SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)有效提高了Cur的溶解性。另外,Cur的最大熒光發射波長從長波長向短波長變化,這種熒光峰的藍移表明Cur向極性更小的環境移動,可能是由于Cur分子通過疏水相互作用與蛋白質中的色氨酸、酪氨酸等結合,其他類似研究也得出了相同的結論[30-32]。由圖3還可看出,HSPI(pH 5.9)對于Cur熒光強度的提高相比SPI和HSPI更加顯著,該結果與圖2結果一致。

綜上,具有核-殼結構的HSPI(pH 5.9)納米顆粒與Cur具有強結合親和力,這主要是歸因于Cur與蛋白質之間的疏水相互作用,這種核-殼結構對于提高Cur溶解性有顯著效果,可用于荷載及遞送Cur的潛在壁材。

圖3 不同質量濃度的SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）對Cur熒光的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of SPI, HSPI and HSPI(pH 5.9) on curcumin fluorescence

2.3 SPI-Cur納米顆粒的形成與表征

2.3.1 SPI-Cur中Cur的水溶性及其粒徑和分布

SPI-Cur納米顆粒中Cur的含量是評價其對Cur是否成功包載及增溶的有效依據。將SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)與Cur粉末混合攪拌后經均質或超聲,離心后得到的上清液為黃色、透明狀液體(圖4A),超聲處理對SPI提高Cur水溶性更加有效(表2),說明超聲處理有利于蛋白與Cur之間的結合。相關研究表明,超聲波處理后將大分子顆粒破碎重組成較小的顆粒,從而可以增加蛋白的溶解性和表面疏水性[33-35]。此外,熱處理后SPI提高Cur水溶性效果更加顯著(表2),這是由于熱處理增加了蛋白質的表面疏水性,相似的報道也見于β-乳球蛋白[36]。值得關注的是,超聲后HSPI(pH 5.9)可將Cur粉末在水中的溶解量提高至12.43 μg/mL,相比Cur粉末在水中的溶解度11 ng/mL,其溶解度提高了1 130 倍左右。除了HSPI(pH 5.9)蛋白自身表面疏水性高以及超聲的驅動作用影響外,HSPI(pH 5.9)的核-殼結構中大量疏水基團形成的強疏水內核更有利于與Cur的結合也是主要原因(圖5)。

表2 SPI-Cur中Cur溶解度及其粒徑、PDITable 2Curcumin solubility, particle size and PDI of SPI-curcumin

圖4 不同處理對SPI、HSPI、HSPI（pH 5.9）-Cur的影響Fig. 4 Effect of different treatments on SPI, HSPI, and HSPI (pH 5.9)-Cur

圖5 SPI-Cur、HSPI-Cur和HSPI（pH 5.9）-Cur形成機理圖（部分參考Chen Nannan等[24]）Fig. 5 Schematic illustration of the formation of SPI-Cur, HSPI-Cur and HSPI (pH 5.9)-Cur

顆粒在溶液中的穩定性與顆粒本身的尺寸大小及其分散性具有密切關系,普遍認為,顆粒的粒徑小且均一易分散,穩定性也越好,反之則容易發生聚集或沉淀。SPI -Cur顆粒的平均粒徑及其分布如圖4B所示,與SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)相比,均質后SPI-Cur、HSPI-Cur和HSPI(pH 5.9)-Cur顆粒粒徑以及PDI大小的變化均不顯著,這可能是均質功率比較小且時間短,并沒有導致蛋白質顆粒聚集或解聚。與均質后樣品顆粒相比,經超聲處理得到的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur顆粒平均粒徑均減小,但PDI值沒有顯著變化,這主要是因為超聲處理誘導蛋白顆粒與Cur共組裝的同時也使得一些大顆粒或聚集體分解成較小的顆粒。與之不同的是超聲后U-HSPI(pH 5.9)-Cur顆粒粒徑雖略有增加,但分散性卻依舊保持良好,其粒徑的增加可能是由于超聲后蛋白溶解度提高導致HSPI(pH 5.9)出現了輕微溶脹。

2.3.2 蛋白-Cur納米顆粒熒光光譜研究

進一步利用熒光光譜研究蛋白-Cur納米顆粒中蛋白質及Cur結構的變化。從圖6A、B可以發現,經過均質或超聲處理后,SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)的內源熒光最大發射波長均發生了紅移,這可歸因于均質和超聲增加了蛋白的溶解度,使得疏水基團所處環境極性增強。由于Cur與蛋白結合,導致了蛋白內源熒光不同程度的猝滅,說明它們之間主要通過疏水相互作用而結合。此外,由蛋白-Cur納米顆粒中Cur的熒光光譜結果表明超聲處理后熒光強度比均質后更低,超聲顆粒中Cur的最大發射波長紅移,說明超聲可以誘導SPI與Cur共組裝。圖6C、D對Cur熒光的研究結果表明SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)與Cur作用后,增強了Cur的熒光強度,改善了Cur的溶解性,超聲處理后效果更加顯著。無論是均質還是超聲形成的納米顆粒,都表明了HSPI(pH 5.9)與Cur結合的能力更強,蛋白質熒光猝滅和Cur熒光增強與蛋白-Cur納米顆粒中Cur水溶性提高的結果一致。

綜上結果表明,超聲處理可以增強SPI與Cur的相互作用,進而提高Cur的水溶性,HSPI(pH 5.9)的核-殼結構更有利于與Cur在均質和超聲過程中的共組裝形成均一分散性好的納米顆粒。

圖6 SPI、HSPI、HSPI（pH 5.9）-Cur的熒光光譜Fig. 6 Fluorescence spectra of SPI, HSPI, and HSPI (pH 5.9)-Cur

2.4 超聲后蛋白-Cur納米顆粒的貯藏穩定性

除了不溶性之外,Cur易降解是限制其開發利用的另一因素。研究表明,Cur在中性環境下非常不穩定,30 min則有90%被降解[37]。為了考察蛋白-Cur顆粒(U-SPI-Cur、U-HSPI-Cur和U-HSPI(pH 5.9)-Cur)中Cur以及顆粒本身的貯存穩定性,在25 ℃貯存30 d進行監測。

圖7A顯示,新鮮制備的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur中Cur含量迅速減少,第3天時上清液中Cur的保留率分別僅有50%和60%,隨著貯藏時間的延長,Cur的保留率緩慢降低,而U-HSPI(pH 5.9)-Cur中Cur含量在7 d后才開始逐漸降低。在貯存30 d后,U-HSPI(pH 5.9)-Cur中Cur保留率為77%,遠高于U-SPI-Cur(35%)和U-HSPI-Cur(44%)。U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur中Cur保留率在1～3 d降低迅速可能是因為SPI和HSPI與Cur結合較弱,當開始貯藏后Cur與蛋白解結合成為游離態而被迅速降解,HSPI(pH 5.9)因其核-殼結構將Cur包裹在疏水內核所以保持穩定。從圖7B、C可以看出,貯藏過程中,超聲后形成的蛋白-Cur顆粒粒徑和PDI均保持穩定。上述實驗結果表明,相比SPI和HSPI,HSPI(pH 5.9)的核-殼結構對Cur的保護作用更佳,形成的納米顆粒具有良好的貯藏穩定性。

圖7 SPI、HSPI、HSPI（pH 5.9）-Cur隨貯藏時間的變化Fig. 7 Changes in SPI, HSPI, and HSPI (pH 5.9)-Cur with storage time

3 結 論

本實驗以SPI為原料,在pH 7.0和pH 5.9條件下對其進行靜態熱處理,得到了SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)3 種蛋白顆粒,其中HSPI(pH 5.9)是具有疏水核心和親水殼的核-殼結構,它們均可通過疏水相互作用與Cur結合以提高Cur的水溶性。通過均質或超聲等物理處理可成功制備SPI-Cur納米顆粒,其中超聲處理對于增強蛋白與Cur之間的相互作用更加顯著。HSPI(pH 5.9)的核-殼結構更加有利于蛋白在超聲過程中與Cur發生共組裝,形成粒徑小(＜120 nm)、分散均一(PDI＜0.2)的U-HSPI(pH 5.9)-Cur納米顆粒,極大提高Cur的水分散性及貯藏穩定性。綜上研究結果表明,HSPI(pH 5.9)可作為潛在的優質納米級壁材用于Cur等疏水活性物質的包埋與輸送。