等離子體活性水腌制對豬肉肌原纖維蛋白氧化及結構的影響

孫克奎,金聲瑯,潘雅燕,王 燕

(黃山學院旅游學院,安徽 黃山 245041)

腌制是腌臘肉制品加工的關鍵工序,傳統的腌制方法包括干腌和濕腌法。干腌法是在肉的表面揉搓腌制混合物(主要是氯化鈉、硝酸鹽或亞硝酸鹽、糖和香料),濕腌法是將肉浸泡在鹽水里進行腌制。近年來,己有腌制方法縮短了鹽漬時間,提高了腌臘肉制品鹽分布的均勻性,改善產品的外觀同時取代了亞硝酸鹽的添加,例如超聲波輔助腌制技術[1]、脈沖加壓輔助腌制技術[2]、介質阻擋放電腌制技術[3]、等離子體活性水(plasmaactivated water,PAW)腌制技術[4]等。

大氣壓低溫等離子體作為一種新技術,可以產生紫外光、電子、正負離子、原子、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)等活性物質[5]。射流等離子體具有靈活多變的電極結構,通過在大氣壓下將電場和氣流共同作用迫使其放電產生的等離子體從其產生區域噴出,讓其產生的等離子體在外界開放的環境中朝著工作區域方向作定向移動,從而獲得大氣壓射流等離子體[6]。

通過腌制可以改善肉制品的風味、多汁性和嫩度,并延長其保質期。PAW作為一種新型、有前途的肉類加工技術己經應用于乳化腸的加工[4],從而取代亞硝酸鹽的添加,降低成本;也被應用在豬肉脯的加工過程中[7],不僅可以改善產品顏色同時也可以降低亞硝酸鹽殘留量。本實驗PAW由等離子體射流裝置處理純水制成,在制備過程中會產生大量的活性物質,這些成分可能會導致肉類肌原纖維蛋白質的氧化以及結構的變化[8]。所以,應該考慮到這種加工工藝對促進蛋白質氧化反應可能會產生的影響。

本實驗考察不同處理時間制備的PAW腌制對豬肉肌原纖維蛋白氧化及結構的影響,為PAW腌制技術在肉類腌制中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屠宰后48 h的黃山黑母豬背長肌,黃山黑豬日齡為6 個月左右,由黃山全江生態農業科技有限公司提供;食鹽、白砂糖等配料 市售。

1.2 儀器與設備

CTP-2000K等離子體射流發生器 南京蘇曼等離子科技有限公司;IKA T25高速勻漿機 德國艾卡儀器設備有限公司;UV-2501分光光度計 日本島津公司;Allegra高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;FD-1A-50真空冷凍干燥機 中國思昊科技有限公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher科技有限公司;L-8900氨基酸分析儀、F-7000熒光分光光度計 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 等離子體射流處理

圖1 等離子體射流放電裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the plasma jet discharge experimental setup

如圖1所示,在500 mL燒杯中,加入300 mL去離子水,用空氣作為載氣,流量為22.5 L/min,輸出電壓為20 kV,電流為0.025 mA,用等離子體射流裝置分別處理0、40、60 s和80 s。為保證液體樣品的一致性,防止鹽分及其他成分溶解對等離子體處理過程中樣品的干擾,實驗中,先對去離子水進行等離子體處理制備PAW,隨后將各處理組配制成相同濃度的腌制液。

1.3.2 樣品的腌制

腌制液的制備:等離子體處理后,在PAW和純水中分別加入8% NaCl、3%白糖、0.5%焦磷酸鈉,配制成腌制液。其中一組用未處理組腌制液腌制,為對照組(n=10),另3 組分別為40、60 s和80 s等離子體射流裝置處理制備的PAW腌制液處理組(n=90)。每組豬里脊樣品在10 ℃環境中腌制12 h,腌制液和肉塊的質量比為2∶1,全部樣品腌制后立即取出并用濾紙吸干表面,真空包裝后在-20 ℃冷凍貯藏備用。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

根據汪媛等[9]的方法并進行適當的修改。稱取5 g腌制后的樣品進行攪碎,將3 g肉糜加入到30 mL磷酸緩沖液(100 mmol/L磷酸鹽緩沖液、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA,pH 7.0)中勻漿(10 000 r/min,1 min),隨后將制得的懸浮液進行高速冷凍離心(10 000×g,15 min,4 ℃),棄去上清液,收集沉淀。將沉淀用相同的緩沖液沖洗3 次。再將沉淀溶解到4 倍體積的20 mmol/L磷酸緩沖液中(0.7 mol/L KI、0.02% NaN3,pH 7.0),用相同條件離心,收集沉淀即為肌原纖維蛋白。隨后將沉淀溶解在20 mmol/L磷酸緩沖液中(0.1 mol/L NaCl,pH 7.0),采用雙縮脲法測定肌原纖維蛋白溶液濃度。

標準曲線:吸取10 mg/mL的牛血清蛋白0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,分別用超純水補充至1 mL,加入4 mL雙縮脲試劑劇烈振蕩后在室溫下靜置30 min,于波長540 nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標,牛血清蛋白濃度為縱坐標,繪制標準曲線。

樣品蛋白濃度測定:肌原纖維蛋白溶液用0.5 mol/L NaOH溶液稀釋5 倍后,取1 mL稀釋液于試管中與4 mL雙縮脲試劑混合,隨后在波長540 nm處測定吸光度,測定肌原纖維蛋白濃度。吸取每組分中部分肌原纖維蛋白溶液于-20 ℃冰箱中預凍12 h,過后于冷阱溫度-40 ℃,真空度低于40 Pa條件下進行抽真空冷凍干燥24 h,得到肌原纖維蛋白粉末,用于傅里葉變換紅外光譜分析。

1.3.4 PAW腌制后蛋白氧化水平測定

1.3.4.1 蛋白質羰基含量測定

采用賈娜等[10]的方法。取各處理組的豬肉樣品1 g切碎后,在10 mL焦磷酸緩沖液(含2 mmol/L Na2P4O7、10 mmol/L Tris-maleate、100 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2和2 mmol/L EGTA,pH 7.4)中均質15 s。隨后加入1 mL 20%三氯乙酸溶液到200 μL均質液中,離心5 min(4 ℃,12 000×g)。沉淀用10%三氯乙酸溶液清洗后離心5 min(4 ℃,12 000×g),隨后去除懸浮液,在蛋白沉淀中加入1 mL 2,4-二硝基苯肼溶液(2,4-二硝基苯肼溶解于2 mol/L HCl溶液中,濃度為10 mmol/L),空白對照組加入1 mL 2 mol/L HCl溶液,在室溫下避光反應30 min。反應結束后,相同條件離心,棄去上清液,加入1 mL 20%三氯乙酸沉淀蛋白。用1 mL乙酸乙酯-乙醇(1∶1,V/V)溶液沖洗沉淀3 次,去除2,4-二硝基苯肼。提取后,將沉淀溶解于1 mL含有6 mol/L鹽酸胍的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中,37 ℃振蕩30 min。再用相同條件離心后取上清液于波長370 nm處測定吸光度。蛋白質羰基摩爾吸光系數為22 000 L/(mol·cm),以鹽酸胍溶液為空白調零,HCl為對照組,結果以每毫克蛋白所含的羰基物質的量表示(nmol/mg)。

1.3.4.2 總巰基含量測定

采用Ellman試劑進行測定[11]。將4.5 mL含有8 mol/L尿素,10 mmol/L EDTA和0.6 mol/L KCl(pH 8.0)的溶液加入到0.5 mL肌原纖維蛋白溶液(5 mg/mL)中,再加入100 μL 5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)反應液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)。在室溫(25 ℃)條件下孵育25 min,使硫醇基與5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)反應,隨后在4 ℃,12 000×g離心5 min,在波長412 nm處測定上清液吸光度。總巰基含量用摩爾消光系數13 600 L/(mol·cm)進行計算。結果以每毫克蛋白所含的巰基物質的量表示(nmol/mg)。

1.3.5 游離氨基酸含量測定

采用Lorenzo等[12]的方法從腌制后的肉中提取游離氨基酸。分別將2 g不同處理組的肉干在25 mL的三氯乙酸中靜置1 h,隨后吸取5 mL溶液用0.45 μm過濾膜過濾。用L-8900全自動氨基酸分析儀對濾液進行定性和定量分析。每個樣品的游離氨基酸含量重復測定3 次。游離氨基酸含量以干物質表示(mg/100 g)。

1.3.6 表面疏水性測定

采用1-苯氨基-8-萘磺酸鹽(1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid,ANS)熒光探針法測定蛋白質表面疏水性[13]。將提取的肌原纖維蛋白在磷酸鹽緩沖液中(含0.01 mmol/L K2HPO4,pH 7.0)按2 倍梯度稀釋至質量濃度0.5～5 mg/mL。每個質量濃度取2 mL與25 μL 8 mmol/L ANS溶液(含0.1 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液,pH 6.0)混合,在25 ℃條件下暗置孵育25 min。采用熒光分光光度計在激發波長374 nm、發射波長485 nm處測定每個蛋白質量濃度的熒光強度,不加ANS的為空白對照組。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

將2 mg肌原纖維蛋白粉末和100 mg KBr混合后,用研缽研磨成均勻粉末,壓制成薄片。用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1之間進行掃描,光譜分辨率為4 cm-1,掃描次數為128 次[14]。采用OMNICTM軟件(Thermo Nicolet Inc., IL, USA)對酰胺I波段(1 700～1 600 cm-1)區域進行分析。參考Kong Jilie等[15]的方法評價二級結構的變化,每種二級結構的含量表示為各峰面積占總酰胺I帶峰面積的百分比。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)對不同處理組進行單因素方差分析。采用Duncan多重比較法對不同處理組均值進行顯著性分析(P＜0.05)。所有實驗重復3 次,每一次取3 個樣品進行平行實驗,以保證準確性。數據以表示。

2 結果與分析

2.1 PAW腌制對蛋白質氧化程度的影響

羰基是評定肉類中蛋白質氧化程度最常用的指標,通常由氨基酸殘基側鏈氧化而成[16]。通過測定肌原纖維蛋白羰基和總巰基含量,研究PAW處理對蛋白質的氧化的影響。由圖2可以看出,蛋白質的羰基含量隨著等離子體處理時間的延長而顯著增加(P＜0.05),40、60 s和80 s處理組羰基含量分別比對照組增加0.67、1.42 nmol/g和1.57 nmol/g。可能的原因是PAW中含有大量的高能粒子以及活性氧和活性氮自由基(ROS和RNS)[17],ROS和RNS可以氧化氨基酸殘基側鏈,尤其是側鏈上有NH-或NH2基團的氨基酸,從而導致蛋白質氧化[18]。隨著處理時間的延長,ROS和RNS含量上升導致蛋白質氧化程度上升。有研究表明,芳香型和含硫氨基酸側鏈極容易被氧化[19],由圖2可知,PAW處理后的總巰基含量逐漸下降,40、60 s和80 s處理組總巰基含量分別比對照組下降14.51%、19.35%和30.65%,說明PAW處理能夠促進半胱氨酸巰基基團的損失,巰基基團的減少意味著二硫鍵的形成,從而導致磺酸的產生,同時半胱氨酸支鏈的硫醇基容易脫氫,導致(2Cys-2H)H+的形成,可以進一步被氧化成磺基(—SO3)[20]。

圖2 PAW處理對蛋白質羰基和總巰基含量的影響Fig. 2 Effect of PAW treatment on carbonyl and total sulfhydryl contents of myofibrillar protein

2.2 PAW腌制對游離氨基酸含量的影響

表1 PAW處理對游離氨基酸含量的影響Table 1 Effect of PAW treatment on free amino acid contents

由表1可知,相對于對照組,40 s處理組的游離氨基酸總量顯著下降,這可能由于游離巰基被氧化成二硫鍵導致蛋白質出現大量的聚集相關[21]。而60 s和80 s處理組的游離氨基酸總量顯著上升(P＜0.05),表明長時間處理可能破壞二硫鍵,從而加速了部分蛋白質降解為游離氨基酸組分。疏水性氨基酸的含量呈現相似的趨勢,這可能與蛋白質的不斷氧化增加了蛋白質表面的疏水性有關[22]。與甜味相關的氨基酸如丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和甘氨酸;以及與成熟風味相關的賴氨酸、酪氨酸、天冬氨酸均隨著處理時間的延長呈上升趨勢。60 s和80 s處理組中與鮮味相關的谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和精氨酸含量顯著大于對照組,說明60 s和80 s處理組有助于改善產品的滋味。

2.3 PAW腌制對蛋白質表面疏水性的影響

圖3 PAW處理對蛋白質表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of PAW treatment on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

如圖3所示,蛋白質表面疏水性可以用來評價蛋白質的變性情況[23]。相對于對照組,40 s處理組的疏水性指數顯著下降,可能是低氧化程度會引起蛋白質重新折疊,團聚阻礙了非極性氨基酸暴露于蛋白質表面[24];然而隨著處理時間的延長,蛋白質疏水性指數顯著增加,60 s和80 s處理組疏水性指數分別增加12.72%和36.36%,這可能是由于PAW腌制后,蛋白質分子結構的拉伸和展開使構象結構變得松散和不穩定[25],導致埋在蛋白質的內部原先被非極性環境包圍的疏水基團,暴露在水環境中,使得更多的ANS可以結合蛋白分子的非極性部分,從而增加表面疏水性[26]。PAW處理結果表明,隨著等離子體處理時間的延長,蛋白質的展開量也可能增加,從而使疏水性基團的暴露量增加,這與疏水性氨基酸結果一致。隨著等離子體處理時間的延長,PAW中越來越多的ROS自由基和羥自由基對疏水性氨基酸的攻擊也會導致蛋白質表面疏水性的增加[27]。

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析結果

如圖4所示,酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)的吸光光譜可以反映蛋白質二級結構的信息,α-螺旋位于1 646～1 664 cm-1,β-折疊位于1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1,β-轉角位于1 664～1 681 cm-1,而1 637～1 645 cm-1對應無規卷曲[28]。實驗結果表明,經PAW腌制處理后,雖然蛋白質各組分的峰位沒有明顯的變化,但其部分區域受到PAW處理的影響,酰胺I帶變化明顯,尤其是80 s處理組圖譜比其他處理組圖譜更加平坦。通過二階求導去卷積技術對酰胺I帶進行處理,并用PeakFit 4.12軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)對各處理組肌原纖維蛋白二級結構進行曲線擬合分析得到不同處理組中蛋白質二級結構組分的相對含量,如圖5所示。與對照組相比,40、60、80 s處理組的α-螺旋相對含量分別減少了10.73%、20.71%和33.32%,而β-折疊相對含量增加了7.78%、11.87%和16.41%,無規卷曲相對含量增加了6.50%、17.38%和26.23%,β-轉角組無顯著變化。α-螺旋相對含量與蛋白質的水合能力相關,α-螺旋含量的降低可能導致蛋白質疏水性的增加,α-螺旋結構的解旋會導致分子間相互作用的變化[29]。隨著處理強度的增加,肌原纖維蛋白的展開會使非極性氨基酸暴露在蛋白表面從而增加蛋白質表面疏水性,這與2.2節結果一致。β-折疊含量的增加與PAW腌制過程產生的氧化體系相關[22],這可能導致肉蛋白質的聚合。α-螺旋的穩定性主要由多肽鏈中羰基氧(—CO)和氨基氫(NH—)之間的氫鍵維持,PAW中的ROS和RNS會破壞維持α-螺旋穩定的氫鍵[30],從而引起α-螺旋含量下降,β-折疊和無規卷曲含量的上升。這些結果表明PAW處理能改變肌原纖維蛋白二級結構。

圖4 肌原纖維蛋白酰胺I帶去卷積傅里葉變換紅外圖譜Fig. 4 Deconvoluted amide I FTIR spectra of myofibrillar protein

圖5 蛋白質二級結構相對含量的變化Fig. 5 Changes in relative contents of secondary structures of myofibrillar protein

3 結 論

本實驗利用等離子體射流裝置制備的PAW作為一種新型腌制工藝腌制豬背最長肌。相比對照組,PAW腌制組的蛋白質羰基含量顯著增加,巰基含量顯著減少(P＜0.05),說明蛋白質的氧化程度加劇。隨著處理時間的延長,60 s和80 s處理組的游離氨基酸總量顯著增加(P＜0.05),尤其是呈味氨基酸含量的增加,有利于滋味的形成;PAW處理組疏水性氨基酸的變化趨勢與蛋白質表面疏水性的變化趨勢一致,說明60 s和80 s處理組會破壞蛋白質的二硫鍵。隨著處理時間的延長,樣品中α-螺旋發生解旋,β-折疊組分增加,說明蛋白質結構逐漸展開,由緊密變松散,有助于暴露肌原纖維蛋白中的疏水基團。綜上所述,PAW腌制能促使豬肉肌原纖維蛋白發生氧化同時改變蛋白質的結構;PAW腌制能夠作為一種新型的腌制方法應用于肉制品的加工過程中,但目前低溫等離子體技術在食品方面的應用研究仍處于探索階段,PAW對肉制品風味品質的影響還有待進一步研究。