溫度和pH值對雞胸軟骨II型膠原蛋白的結構、黏度和熱穩定性的影響

許 蓉,鄭 淋,趙謀明

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東 廣州 510641)

膠原蛋白是一種白色、無異味的纖維蛋白,是動物體內含量最多的蛋白,約占總蛋白的30%,也是細胞外基質的主要結構蛋白,主要存在于動物的皮、軟骨、肌腱、血管、角膜等結締組織中[1]。其中,II型膠原蛋白與一些蛋白多糖結合,主要分布于軟骨、玻璃體、髓核、胚胎角膜、視網神經膜等組織中,是構成軟骨基質的主要成分之一。它能夠促進軟骨細胞的分化,增進骨骼健康,口服II型膠原蛋白還可誘導自身免疫耐受,抑制關節炎的發生和發展[2-6]。雞胸軟骨作為雞肉加工中的廢棄物,不但造成極大的浪費而且污染環境。研究發現雞胸軟骨中II型膠原蛋白的含量高達50%以上,因此可作為提取II型膠原蛋白的優質原料。

雖然II型膠原蛋白對關節炎有明顯改善作用,但它的三螺旋結構極易被破壞,并且可能伴隨生物活性的喪失[7-8]。而II型膠原蛋白的三螺旋結構的維持依賴于分子間和分子內各種作用的協同效應,如氫鍵、范德華力、水合作用及二硫鍵在維持其分子結構上共同發揮作用,疏水作用和離子作用提供了分子間作用力,因此,II型膠原蛋白的三螺旋結構的熱穩定性受到眾多因素的影響,包括內因和外因。內因主要有蛋白質來源、氨基酸組成、氨基酸序列和翻譯后修飾等,而外因主要有pH值、離子濃度、溶劑、溫度等[9-11]。由于II型膠原蛋白在生產加工過程中,所處環境的pH值和溫度可能發生變化,這會對其結構性質和生物活性的發揮產生影響,從而探究溫度和pH值對II型膠原蛋白的結構和物理化學性質的影響是目前亟待解決的問題之一。茹度是II型膠原蛋白的一個重要特性,且II型膠原蛋白的茹度與維系三螺旋結構的分子間和分子內的靜電作用和氫鍵有著密切的聯系[12-13],從而在一定程度上可以通過茹度的變化推測其結構以及物理化學性質的變化。雖然II型膠原蛋白的三螺旋結構和茹度特性己有相關研究,但其茹度的變化與結構的改變及熱穩定性之間的關系鮮見報道。因此,本實驗通過研究溫度和pH值對II型膠原蛋白結構、茹度的影響,并探討茹度變化、結構改變及熱穩定性之間的關系,以期為II型膠原蛋白的生產加工及其在胃腸道發揮生物活性機理的探究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸軟骨非變性II型膠原蛋白 廣東華肽生物科技有限公司;氫氧化鈉、氯化鈉、冰乙酸、鹽酸 廣州精科化玻儀器公司;溴酚藍、考馬斯亮藍R250、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、巰基乙醇、甘油、丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺美國Geniview公司。

1.2 儀器與設備

pHS-3E pH計 北京雷磁儀器有限公司;CR22N高速冷凍離心機 日本日立公司;Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司;JB-1磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司;傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)儀 德國Bruker公司;圓二色光譜(circular dichroism,CD)儀英國Applied Photophysics公司;ME 204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;HAAKE MARS III旋轉流變儀美國Thermo Scientific公司;A300全自動氨基酸分析儀德國曼默博爾公司。

1.3 方法

1.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

電泳條件:分離膠體積分數7.5%,濃縮膠體積分數5%。稱取一定質量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品,溶于還原型上樣緩沖液中,配制質量濃度為2 mg/mL溶液,于沸水浴中煮沸5 min,10 000 r/min離心10 min,收集上清液用于電泳分析,上樣量為10 μL。染色液為0.25%考馬斯亮藍R-250溶液,脫色液為10%冰醋酸+10%甲醇+80%蒸餾水混合。電流30 mA,電泳時間約2 h。

1.3.2 氨基酸組成測定

精確稱取10 mg雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品于水解管中,加入5 mL濃度為6 mol/L鹽酸密封,110 ℃水解24 h。待水解液冷卻至室溫,過濾,用旋轉蒸發儀50 ℃脫酸處理,將殘留物用0.1 mol/L鹽酸定容至25 mL。取0.1 mL待測液放入氨基酸自動分析儀中,測定總氨基酸組成。

1.3.3 FTIR分析

取適量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品和溴化鉀,置于瑪瑙研缽中,研磨成粉,裝樣壓片,用FTIR儀對樣品在400～4 000 cm-1區間進行掃描,繪制光譜曲線。

1.3.4 CD分析

稱取一定質量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品溶于0.1 mol/L醋酸溶液中,配成0.15 mg/mL的II型膠原蛋白溶液。

1.3.4.1 不同pH值下的結構分析

將配好的II型膠原蛋白溶液用2 mol/L鹽酸和2 mol/L氫氧化鈉溶液節pH值至2、3、4、5、6、7、8、9、10,加入1 mm比色皿中,放入CD儀中于28 ℃(低于雞胸軟骨II型膠原蛋白的最低變性溫度)進行光譜掃描,繪制各光譜曲線。

1.3.4.2 pH值對熱穩定性的影響

取上述pH 2、3、5、7的II型膠原蛋白溶液,分別加入1 mm比色皿中,放入CD儀中于28、30、32、34、36、38、40、42 ℃進行光譜掃描,繪制各光譜曲線,并在其正吸收峰波長處,繪制不同溫度下橢圓率的變化曲線。

1.3.5 茹度測定

稱取一定質量雞胸軟骨II型膠原蛋白樣品溶于0.1 mol/L醋酸溶液中,配成10 mg/mL的II型膠原蛋白溶液。

1.3.5.1 pH值對茹度的影響

將配好的II型膠原蛋白溶液用2 mol/L鹽酸和2 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至2、3、4、5、6、7、8、9、10,用哈克旋轉流變儀于28 ℃測定其茹度。

1.3.5.2 溫度對茹度的影響

取上述pH 2、3、5、7的II型膠原蛋白溶液,用哈克旋轉流變儀分別于28、32、34、36、38、42 ℃條件下測定其茹度。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 雞胸軟骨非變性II型膠原蛋白的表征

2.1.1 SDS-PAGE分析

由圖1可看出,條帶中分子質量為130 kDa的α1鏈顏色較深,含量較高,在200 kDa左右含有少量的β二聚體[14],幾乎不含α2鏈,故II型膠原蛋白純度較高[1,15-16]。

圖1 II型膠原蛋白電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of type II collagen

2.1.2 氨基酸組成分析

表1 雞胸軟骨II型膠原蛋白的總氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of type II collagen

由表1可以看出,該雞胸軟骨II型膠原蛋白的甘氨酸、谷氨酸、羥脯氨酸和脯氨酸含量最高,質量分數分別約為23%、14%、12%和11%。亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)質量分數約為24%,其在維持膠原蛋白三螺旋結構的穩定性方面發揮重要作用,一般亞氨基酸含量越高,膠原蛋白三螺旋結構越穩定,因為亞氨基酸中的吡咯環有助于形成三螺旋結構穩定的非共價鍵[2,9],且羥脯氨酸中羥基形成的氫鍵有助于維持膠原蛋白三螺旋結構的穩定性[17],而組氨酸和酪氨酸含量較低,與前人研究結果一致[1-2,18]。

2.1.3 FTIR分析

FTIR圖中,酰胺A帶是由N—H的伸縮振動產生的,酰胺B帶是由—CH2非對稱和對稱伸縮振動產生的,酰胺I、II和III帶與II型膠原蛋白的分子序列及三螺旋結構有關,酰胺I帶是C＝O的伸縮振動和N—H的彎曲振動產生的,酰胺II帶是N—H的彎曲振動和C—N的伸縮振動產生的,為β-折疊和無規卷曲疊加產生的吸收帶,酰胺III帶是由蛋白酰胺鍵的C—N伸縮振動和N—H變形及甘氨酸中—CH2基團和脯氨酸側鏈的搖擺振動共同產生[3]。1 200～1 400 cm-1為N—H的伸縮振動峰和COO—的對稱收縮振動峰,可能是由于II型膠原蛋白的甘氨酸和羥脯氨酸及脯氨酸的含量較高,使得膠原蛋白在1 200～1 400 cm-1光譜范圍內具有其他蛋白質所沒有的紅外光譜特征[17,19]。

由圖2可知,該雞胸軟骨II型膠原蛋白有5 個吸收峰,即酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺I帶、酰胺II和酰胺Ⅲ帶,分別位于3 448、2 937、1 642、1 560、1 243 cm-1處,與研究中報道的II型膠原吸收峰的位置基本一致[17,20-23],且酰胺III帶與1 450 cm-1處吸收峰比值大于1,說明所提取的II型膠原蛋白的三螺旋結構保持完整[24-26]。

圖2 II型膠原蛋白的FTIR圖譜Fig. 2 FTIR spectrum of type II collagen

2.1.4 CD分析

圖3為該雞胸軟骨II型膠原蛋白在pH 3.0和28 ℃條件下的CD圖,可以看出214 nm波長處橢圓率為0,222 nm波長處有一正吸收峰,這是左旋聚脯氨酸構型肽鏈CD的典型特征;200 nm波長處有一強的負吸收峰,這是II型膠原蛋白三螺旋結構中無規卷曲的典型特征,與文獻[16,27]中報道的結果相似。且正吸收峰的強度可反映II型膠原蛋白三螺旋結構的完整性,當II型膠原蛋白的三螺旋結構被完全破壞時,正吸收峰會完全消失,負吸收峰會明顯紅移,而部分變性的蛋白質正吸收峰會紅移,強度明顯下降[2,28-29]。

CD法是常用的檢測蛋白二級結構的方法,且由上述結果可知,該方法能較快速準確地檢測出II型膠原蛋白在不同條件下的三螺旋結構,因此本實驗采用此法來測定不同pH值和溫度下II型膠原蛋白的結構變化是可行的。

圖3 II型膠原蛋白的CD圖譜Fig. 3 CD spectrum of type II collagen

2.2 pH值對II型膠原蛋白結構的影響

圖4 pH對II型膠原蛋白的CD圖譜和橢圓率的影響Fig. 4 Effect of pH on the CD spectrum and ellipticity of type II collagen

由圖4可知,pH值對II型膠原蛋白的結構影響較大。在pH 2.0～9.0范圍內,隨著pH值的升高,CD的正吸收峰和負吸收峰均發生明顯紅移,且吸收強度也有所降低,依據橢圓率的變化可知,II型膠原蛋白三螺旋結構部分解旋(28%～57%),即II型膠原蛋白發生輕微變性;當pH值升高到10.0時,正負吸收峰又出現藍移現象且強度增強,解旋程度降為7%,表明II型膠原蛋白三螺旋結構有所恢復。因此,在pH 2.0～4.0的酸性條件下,II型膠原蛋白三螺旋結構最完整;pH 5.0～9.0的弱酸至弱堿性條件下,II型膠原蛋白有28%～57%發生變性;pH 10.0時,僅7% II型膠原蛋白發生變性。

2.3 pH值對II型膠原蛋白熱穩定性的影響

圖5 溫度對II型膠原蛋白CD圖譜及橢圓率變化的影響Fig. 5 Effect of temperature on the CD spectrum and ellipticity of type II collagen

由圖5a～d可知,隨溫度升高,不同pH值II型膠原蛋白正吸收峰處橢圓率均逐漸減小,表明其三螺旋結構逐漸解旋而發生變性,因此可根據橢圓率的變化情況來推測不同pH值條件下II型膠原蛋白的變性溫度,從而判斷其熱穩定性。由圖5e可知,pH 2.0時,II型膠原蛋白的變性溫度約為37 ℃(即1/2橢圓率時的溫度),完全變性溫度約為39 ℃(正吸收峰消失點,即曲線與x軸的交點);pH 3.0時,II型膠原蛋白的變性溫度約為39 ℃,完全變性溫度約為42 ℃;pH 5.0時,II型膠原蛋白的變性溫度約為40 ℃,完全變性溫度約為46 ℃;pH 7.0時,II型膠原蛋白的變性溫度約為43 ℃,完全變性溫度約為48 ℃。因此,pH 2.0～4.0時,變性溫度在37～39 ℃之間,熱穩定性較低;pH 5.0～7.0時,變性溫度在40～43 ℃之間,且完全變性溫度為46～48 ℃,熱穩定性高。即pH值越低,II型膠原蛋白熱穩定性也越低,弱酸性至中性范圍內較酸性條件下熱穩定性高。

2.4 pH值對II型膠原蛋白茹度的影響

圖6 pH值對II型膠原蛋白的黏度的影響Fig. 6 Effect of pH on the viscosity of type II collagen

由圖6可知,pH值對II型膠原蛋白茹度有很大影響。pH 2.0～5.0之間,II型膠原蛋白的茹度先增大后減小,且在pH 3.0時茹度達到最大值;pH 5.0～9.0之間茹度最小,且基本保持不變;pH 10.0時茹度又增大。由于pH 2.0時酸性較強,II型膠原蛋白溶解度大,分子溶脹伸展,氫鍵等引起的分子間作用力小,因此茹度較小;pH 3.0時,II型膠原蛋白三螺旋結構完整,且分子上帶較多正電荷,電荷相互排斥導致分子運動阻力增大,表觀茹度增大;pH 5.0～9.0的弱酸性至弱堿性范圍,接近II型膠原蛋白的等電點,膨脹度及溶解度小,整個分子趨向于蜷曲狀態,三螺旋結構發生輕微改變,且分子上帶電荷較少,電荷相互排斥作用弱,從而分子間運動阻力減小,故茹度較小[30-31];pH 10.0與pH 3.0的原理相似,由于分子上的凈負電荷增多,電荷間較強烈的排斥作用,使得分子運動阻力增大,導致茹度增加。結合2.2節CD分析結果知,茹度大小與三螺旋結構的完整性、溶液中正負電荷間靜電作用力及分子間氫鍵有關,因此,pH值變化引起II型膠原蛋白茹度大小的變化,一定程度上能夠反映其三螺旋結構的改變,即在pH 3.0～9.0范圍內,pH值升高,茹度降低,三螺旋結構解旋程度增大。

2.5 溫度和pH值對II型膠原蛋白茹度的影響

由于pH值對雞胸軟骨II型膠原蛋白茹度變化影響較大,因此為了進一步考察其茹度隨溫度的變化,選取pH 2.0、3.0、5.0、7.0條件下具有不同茹度特性的II型膠原蛋白,測定其在28～42 ℃的茹度。由圖7可知,在不同pH值下,雞胸軟骨II型膠原蛋白的茹度均隨溫度的升高而降低,與胡建平[31]不同骨膠原的茹度研究結果一致。因溫度越高,II型膠原蛋白變性程度越大,分子內各種次級鍵被破壞,高度有序的三螺旋結構向無規卷曲轉變,因此物理化學性質發生改變,導致茹度下降[9]。pH 2.0時,茹度隨溫度變化在34～38 ℃之間存在一個突變,這是因為II型膠原蛋白發生了嚴重變性,導致茹度突然下降,pH 3.0時茹度隨溫度變化突變區在38～40 ℃之間,而pH 5.0和pH 7.0均不存在茹度下降突變區,說明此時II型膠原蛋白未發生明顯變性,熱穩定性高,因此,弱酸性至中性條件較酸性條件下熱穩定性高。上述結果與2.3節CD分析所得的結果一致,從而得知,相同pH值下,溫度升高可導致II型膠原蛋白茹度減小,表明II型膠原蛋白的三螺旋結構發生了改變。

圖7 pH值和溫度對II型膠原蛋白的黏度的影響Fig. 7 Effect of pH and temperature on the viscosity of type II collagen

2.6 結構和茹度的相關性分析

由2.5節結果可知,隨著溫度和pH值升高,雞胸軟骨II型膠原蛋白茹度的變化與CD正吸收峰處橢圓率的變化有相似的趨勢。為了更清晰地看出雞胸軟骨II型膠原蛋白茹度變化與結構改變之間的關系,對II型膠原蛋白在不同溫度以及不同pH值下的茹度和CD吸收峰橢圓率之間進行相關性分析。

表2 II型膠原蛋白黏度和橢圓率的相關性分析Table 2 Correlation analysis between viscosity and structure of type II collagen

由表2可知,pH 2.0時,II型膠原蛋白的茹度和橢圓率隨溫度的變化在0.000水平上具有強相關性;pH 3.0和pH 7.0時,二者在0.010水平上具有強相關性;pH 5.0時二者相關性較弱,且相關性不顯著。在相同溫度下,II型膠原蛋白茹度和橢圓率隨pH值變化在0.003水平上具有相關性,相關系數為0.854。因此,II型膠原蛋白在不同溫度下的茹度變化與結構改變之間具有相關性,溫度越高,其茹度則越低,三螺旋結構解旋程度也越大;II型膠原蛋白在不同pH值條件下的茹度變化與其結構改變也具有相關性,一定范圍內,pH值升高,分子上的靜電作用力減小,三螺旋結構發生輕微改變,茹度降低,而當pH升高到一定值時,靜電作用力增大,三螺旋結構又有所恢復,茹度也因此增大。

3 結 論

雞胸軟骨II型膠原蛋白的三螺旋在pH 2.0～4.0之間較為完整,在pH 5.0～9.0的弱酸至弱堿性范圍內輕微解旋(28%～57%),pH 10.0時僅7%發生解旋。茹度在pH 2.0～5.0之間先增大后減小,且pH 3.0～4.0時達到最大值;在pH 5.0～9.0之間最小且基本保持不變;pH 10.0時又增大。pH 2.0～4.0時,變性溫度在37～39 ℃之間,熱穩定性較低;pH 5.0～7.0時,變性溫度在40～43 ℃之間,且完全變性溫度為46～48 ℃,熱穩定性很高。茹度和結構隨溫度變化具有顯著的強相關性(P＜0.05),溫度越高,茹度越低,三螺旋結構解旋程度越大;在pH 3.0～9.0范圍內,pH值升高,分子上的靜電作用力減弱,溶液茹度降低,三螺旋結構解旋程度也增大(P＜0.01)。