鹽應激對大腸桿菌O157:H7存活和毒力基因表達的影響

余蘭林,姬賽賽,禹金龍,付文靜,張 林,李蛟龍,高 峰,江 蕓,*

(1.南京農業大學動物科技學院,江蘇 南京 210095;2.南京師范大學食品與制藥工程學院,江蘇 南京 210023)

大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是主要食源性致病菌之一,可通過污染的食物和水源傳播,其感染劑量低、致病力較強,人體感染后引起腹瀉、出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合癥等[1-2]。該菌最主要毒力因子是志賀毒素(Shiga toxin,Stx),由stx1和stx2基因編碼,可造成內皮細胞和腎小管細胞的損傷,導致急性腎功能衰竭。此外,eae基因編碼的緊密茹附素,可使病原菌茹附在腸細胞上從而引起茹附-脫落損傷;hly編碼腸溶血素,是引起腸外損傷的重要毒力因子,對淋巴細胞、粒細胞、紅細胞及靜脈管狀細胞等都有影響[3-4]。

食品加工和貯藏過程中涉及多種處理方法,如加熱、干燥、冷藏冷凍、酸化、腌制、使用防腐劑等,這些處理對微生物造成脅迫,抑制甚至殺滅有害微生物,從而延長食品貨架期。添加食鹽是其中常見的一種手段,可降低水分活度,低水分活度可導致細菌質壁分離,影響大腸桿菌糖類主動轉運和DNA復制[5],不利于微生物的生長繁殖,但也有研究發現大腸桿菌O157:H7等致病菌在低水分活度食品中可長期存活[6]。研究表明,環境應激不僅影響致病菌的存活,還使其毒力特性發生改變,有研究發現應激可導致致病菌毒力基因的表達增加,但也有研究報道應激后致病菌毒力基因的表達下降或無顯著變化[3,7-8]。含鹽食品中腸出血性大腸桿菌引發人群感染事件時有發生,如發酵香腸、奶酪、腌菜、沙拉等[9-12],這些事件表明鹽應激下大腸桿菌O157:H7仍存在較大安全風險,探討鹽應激下大腸桿菌O157:H7存活與毒力的相關性,具有重要的科學意義。鹽應激對大腸桿菌O157:H7毒力特性的影響也有不同報道,Harris等[13]發現LB(Luria-Bertani)肉湯培養基中添加2% NaCl增加了stx2基因表達,但添加3% NaCl對stx2表達量無影響。Olesen等[14]研究發現4.5%鹽應激24 h顯著增加了大腸桿菌O157:H7 EDL933菌株毒力基因(eae、stx1A、stx2A和tir)的表達,但卻抑制了另外2 株STEC(O157:H7和O157:H-)毒力基因表達,存在菌株差異。目前,關于較高NaCl添加量對食源性致病菌毒力的影響少見報道,如一些腌制肉制品、醬料中含鹽量高達15%以上。因此本研究以本實驗室收集的3 株大腸桿菌O157:H7產毒菌株為對象,探討較高NaCl添加量應激對菌株存活和毒力基因表達的影響,進一步分析其存活與毒力變化之間的相關性,以期為實際含鹽食品風險評估提供科學依據。關于NaCl添加量應激水平的設立有不同報道,在胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)或LB培養基基礎上,設有1%～3%[13]、2%～5.5%[15]、3.5%～8.5%[16]、0.5%～8.5%[17]、3%～18%[18]等不同NaCl水平,因此本實驗設立6、12、18 g/100 mL NaCl水平作為較高NaCl添加量應激條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 株大腸桿菌O157:H7來源及攜帶毒力基因情況如下:大腸桿菌O157:H7菌株CICC21530(stx1+、stx2+、eae+、hly+)購于中國工業微生物菌種保藏管理中心;大腸桿菌O157:H7菌株95(stx1+、hly+)和菌株109(eae+、hly+)由南京農業大學江蘇省動物源食品生產與安全保障重點實驗室惠贈。

TSB、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar,TSA)、酵母浸粉(yeast extract,YE) 北京陸橋技術股份有限公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、pH值校正緩沖溶液、乳酸(分析純) 南京化學試劑有限公司;Trizol試劑、mRNA反轉錄試劑盒RR036A、實時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)試劑盒RR430A 大連寶生物工程有限公司;實驗用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

2-16KL型高速冷凍離心機 美國Sigma公司;HD-3A型水分活度測量儀 無錫市華科儀器儀表有限公司;GL-ZZM型高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司;DHP-9052型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;ZQTY-70型臺式振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司;SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;SG403A型生物安全柜 美國Baker公司;NANODROP-2000核酸蛋白分析儀 美國Thermo Scientific公司;ABI7500熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司;Mastercycler普通PCR儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽溶液制備及水分活度測定

正常TSB培養基中分別添加0、6、12、18 g/100 mL NaCl,高壓蒸汽滅菌后備用。按水分活度儀操作說明,將上述樣品置于25 ℃環境中平衡6 h,然后在該環境下用水分測量儀測量每組樣品的水分活度值,每組設3 個重復,取平均值。

1.3.2 菌株活化和菌懸液制備

將-80 ℃冰箱保藏的3 株大腸桿菌O157:H7于TSA培養基劃線,37 ℃培養24 h;挑取TSA平板中的單菌落于TSB液體培養基中,37 ℃搖床振蕩培養18～20 h(200 r/min),然后吸取1 mL菌液于100 mL TSB液體培養基中,繼續37 ℃搖床振蕩培養18 h。

1.3.3 鹽應激處理

取10 mL菌懸液,9 000×g、4 ℃離心5 min,去除上清液,沉淀用等體積PBS洗滌2 次,10 mLPBS重懸。吸取100 μL菌液于10 mL上述4 種TSB培養基中,渦旋均勻,初始菌量約為7(lg(CFU/mL))。靜置于25 ℃生化培養箱中,分別于0、3、6、9、12、24、36、48 h和72 h取出,立即離心,沉淀用PBS洗滌重懸2 次,終止應激。梯度稀釋后涂布于TSA-YE,37 ℃培養24 h平板計數。實驗重復3 次,取平均值。

1.3.4 毒力基因表達測定

大腸桿菌O157:H7按1.3.3節方法進行鹽應激處理,渦旋,靜置于25 ℃生化培養箱中,培養時間根據上述存活情況確定,離心洗滌,收集菌株沉淀,液氮速凍后,-80 ℃保存備用。

總RNA提取:按照試劑盒說明書提取菌體RNA,并用NANODROP 1000分光光度計檢測所提取的總RNA濃度和純度,使RNA樣本OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間。

反轉錄用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒進行。為保證反轉錄效應,RNase-free DNase I去除基因組DNA。反轉錄體系為30 μL,其中6 μL PrimeScrept RT Master Mix,total RNA終質量濃度50 ng/μL,RNase Free dH2O補足體積。反轉錄條件:37 ℃反轉錄反應15 min;85 ℃反轉錄酶失活反應5 s;4 ℃,∞。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱長期保存。

real-time PCR用SYBR Premix ExTaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒(大連寶生物工程有限公司),在real-time PCR儀上進行。采用Primer Primer 6.0和Beacon designer軟件進行熒光引物的設計,由生工生物工程(上海)有限公司負責引物的合成,引物序列如表1所示[19],用于擴增大腸桿菌O157:H7的stx1、stx2、eae、hly4 種毒力基因,內參基因為16S rRNA基因。PCR擴增體系(20 μL)為:10 μL SYBR Premix ExTaq(2×),0.4 μL ROX Reference Dye II(50×),1.0 μL cDNA模板,上下游引物:各0.4 μL,7.8 μL RNase Free水。PCR程序:95 ℃預變性30 s(1 次循環);95 ℃變性5 s,60 ℃退火和延伸34 s(40 個循環);熔解:95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,95 ℃、15 s(1 次循環)。

表1 引物序列及產物大小Table 1 Primer sequences and size of PCR amplification products

1.4 數據分析

菌株存活數用lg(CFU/mL)表示,熒光定量毒力基因相對表達水平以2-ΔΔCt進行統計分析。所有實驗均做3 次重復。采用SPSS V17.0 ANOVA進行單因素方差分析,結果顯著性使用Duncan多重比較檢驗,P＜0.05,差異顯著。

2 結果與分析

2.1 水分活度

表2 不同NaCl添加量TSB培養基的水分活度Table 2 Water activity in TSB medium with different concentrations of salt

由表2可知,NaCl的添加降低了TSB培養基水分活度,且NaCl添加量越高,水分活度越低,添加12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl的TSB培養基水分活度顯著低于正常TSB培養基(P＜0.05)。

2.2 鹽應激對大腸桿菌O157:H7存活的影響

由圖1A可知,當TSB培養基添加一定量NaCl時,菌株CICC21530隨應激時間延長存活菌數均逐漸下降,與正常TSB培養基(0 g/100 mL NaCl組)相比,NaCl添加量越高菌數下降越明顯,應激36 h后18 g/100 mL NaCl組己檢測不出菌數,顯著低于其他2 個TSB培養基加鹽組(P＜0.05)。由圖1B可知,各TSB培養基加鹽組菌株95的存活菌數隨時間延長低于正常TSB培養基組,其中18 g/100 mL NaCl組菌數逐漸呈下降趨勢,而其他2 個加鹽組呈現波動變化,應激36 h后NaCl添加量越高存活菌數越低。由圖1C可知,各TSB培養基加鹽組菌株109的存活菌數隨時間延長低于正常TSB培養基組,3 個加鹽組均呈現波動變化,應激36 h后6 g/100 mL NaCl組菌數顯著低于12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組。

綜合3 株大腸桿菌O157:H7存活情況,結果表明鹽應激顯著抑制了細菌生長,但抑制效應呈現明顯菌株差異。另外,不同NaCl添加量對3 株菌的影響亦不同,菌株CICC21530 NaCl添加量越高抑制越明顯,18 g/100 mL NaCl組抑制效應最顯著,而其他兩株菌則呈現波動性變化。

圖1 大腸桿菌O157:H7不同NaCl添加量TSB培養基中的存活菌數Fig. 1 Survival curves of E. coli O157:H7 in TSB medium with different amounts of salt added

2.3 大腸桿菌O157:H7毒力基因表達情況

圖2 大腸桿菌O157:H7菌株CICC21530在不同NaCl添加量TSB培養基中應激24 h的毒力基因表達水平Fig. 2 Expression levels of virulence genes of E. coli O157:H7 strain CICC21530 cultured in TSB medium with different concentrations of salt for 24 h

根據上述存活情況,應激36 h的菌株CICC21530 18 g/100 mL NaCl組己檢測不出,其他兩株菌應激過程中呈波動變化,故進一步分析鹽應激24 h的毒力基因表達情況。菌株CICC21530鹽應激24 h后毒力基因表達情況如圖2所示。與正常TSB培養基(0 g/100 mL組)相比,應激24 h的6 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組stx1表達量均顯著增加(P＜0.05),而12 g/100 mL NaCl組無顯著差異;應激24 h的12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組stx2表達量均顯著高于對照組(P＜0.05),6 g/100 mL NaCl組無顯著差異;鹽應激組eae和hly表達量均顯著增加(P＜0.05),且表達量隨NaCl添加量增加而增加。結果表明,鹽應激導致菌株CICC21530四種毒力基因表達量普遍增加,但NaCl添加量不同對毒力基因的影響不完全一致,18 g/100 mL NaCl組4 種毒力基因表達量均顯著高于其他處理組。

由圖3可知,與對照組相比,應激24 h的18 g/100 mL NaCl組stx1表達量顯著增加(P＜0.05),而6 g/100 mL和12 g/100 mL NaCl組顯著低于對照組(P＜0.05);18 g/100 mL NaCl組eae表達量顯著高于對照組(P＜0.05),而6 g/100 mL和12 g/100 mL NaCl組無顯著變化。結果表明,菌株95鹽應激24 h后,不同NaCl添加量對其毒力基因產生了不同的影響,18 g/100 mL NaCl組2 種毒力基因表達量均顯著高于其他處理組。

圖3 大腸桿菌O157:H7菌株95在不同NaCl添加量TSB培養基中應激24 h的毒力基因表達水平Fig. 3 Expression levels of virulence genes of E. coli O157:H7 strain 95 cultured in TSB medium with different concentrations of salt for 24 h

圖4 大腸桿菌O157:H7菌株109在不同NaCl添加量TSB培養基中應激24 h的毒力基因表達水平Fig. 4 Expression levels of virulence genes of E. coli O157:H7 strain 109 cultured in TSB medium with different concentrations of salt for 24 h

由圖4可知,與對照組相比,6 g/100 mL NaCl組無顯著性差異(P＞0.05),而12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組eae和hly表達量均顯著增加(P＜0.05),且12 g/100 mL NaCl組表達量最高。

綜合3 株大腸桿菌O157:H7毒力基因表達情況,結果表明鹽應激對毒力基因的表達產生了影響,不同NaCl添加量導致的影響不同;另外,不同菌株表達量的變化亦不完全一致,其中菌株CICC21530和菌株95于18 g/100 mL NaCl組各毒力基因表達量最高,而菌株109則于12 g/100 mL NaCl組毒力基因表達量最高。

進一步綜合存活菌數和毒力基因表達兩方面,發現添加鹽顯著抑制了細菌存活,但毒力基因表達有加鹽組顯著增加,即相對毒性增強。另外不同NaCl添加量應激時細菌存活和毒力基因表達存在菌株差異,18 g/100 mL NaCl組菌株CICC21530存活數顯著下降,但毒力基因的相對表達量反而顯著增加;其他兩株菌存活菌數呈波動性變化,菌株95的18 g/100 mL NaCl組表達量亦最高,菌株109卻是12 g/100 mL NaCl組表達量最高,表明鹽應激時大腸桿菌O157:H7存活與毒力基因表達的變化不完全一致。

3 討 論

食鹽不僅是最重要的調味料,食品加工中添加鹽,通過降低水分活度還可抑制微生物,一直被廣泛用于食品保鮮,且普遍認為高濃度鹽抑制效應更好,能夠完全殺死或抑制污染的細菌生長[20-21]。鹽的添加造成微生物應激反應,一方面,微生物都有其生長的最適水分活度,NaCl添加量增加導致水分活度降低,微生物生長速率也隨之下降;另一方面,NaCl添加量增加引起的滲透壓升高會導致水分子單方向從細胞質向細胞內膜移動,造成細胞失水,影響微生物生長代謝[20,22]。關于鹽應激對大腸桿菌O157:H7存活影響己有較多報道,Hosein等[23]指出LB肉湯中添加2%和4%的NaCl降低了大腸桿菌O157:H7的數量,但未對菌株產生完全致死效應。Glass等[24]研究發現該致病菌在NaCl添加量為2.5%的TSB培養基中正常生長,但NaCl添加量為4.5%和6.5%時生長受到抑制,大于6.5%時(即8.5%和10.5%)無法生長。Stasic等[25]則發現大腸桿菌O157:H7在NaCl添加量12%的LB培養基中可以存活。本實驗TSB培養基添加NaCl后3 株大腸桿菌O157:H7存活數均下降,但3 株菌下降程度不相同,18 g/100 mL加鹽組菌株CICC21530處理第36小時檢測不出,而其他2 株菌仍存活。上述不同研究報道表明NaCl對大腸桿菌O157:H7的抑制作用,與不同菌株、NaCl添加量及培養條件有關。本實驗還發現鹽應激過程中存活菌數有波動,且高質量濃度NaCl添加組存活菌數并不一定低于低質量濃度NaCl添加組,這與Osaili等[26]研究大腸桿菌O157:H7在含10%、15% NaCl奶酪鹽水中的存活情況相似。大腸桿菌O157:H7在鹽應激環境中,可能通過自身滲透壓調控系統將應激信息傳遞,激活相關酶和膜上轉運蛋白的活性,同時對特定基因表達進行調整,從而維持細胞滲透壓穩定,緩解應激反應[25,27-28]。

當致病菌處于一種應激環境時,會誘導一系列應激反應,應激反應將會引起細菌生長動力學、營養代謝、細胞結構、應激反應和毒力特性的變化[8,14,29],毒力特性的變化必將進一步影響食品安全。關于食品中不同應激環境對致病菌毒力的影響有不同報道,如:Elhanafi等[3]報道大腸桿菌在酸性培養基生長時增加了eaeA和hlyA基因表達,但冷或冷-酸應激對Stx2毒素量沒有影響。Huang等[30]指出酸應激增加了大腸桿菌O157:H7菌株毒力特性。氧化應激增加了大腸桿菌O157:H7毒力基因stx1和stx2表達水平,但對eae表達量無影響[31]。而熱休克大腸桿菌O157:H7與室溫對照組相比,多數毒力基因(stx1、stx2、hly等)表現為下調[19]。關于鹽應激對產Stx大腸桿菌毒力特性影響報道中,Vero細胞實驗表明,產Stx大腸桿菌O157:H7接種香腸,發酵和干燥(pH 4.9,水分活度0.92)8 d增加了腸毒素(Stx1和Stx2)產生[32]。與環境應激相關的滲透壓應激(水分活度0.95～0.98)增加了non-O157菌株stx1、stx2和eae的mRNA表達水平,但對O157:H7菌株毒力影響不顯著[16]。Park等[33]轉錄組學結果顯示鹽應激(0.6 mol/L NaCl)對大腸桿菌O157:H7 Stx相關基因表達均有下調作用。且Olesen等[14]結果表明,鹽應激顯著增加了大腸桿菌O157:H7 EDL933菌株毒力基因表達,但卻抑制了另外2 株STEC毒力基因表達,存在菌株差異。因此鹽應激可能影響菌株毒力基因的表達,但研究報道不完全一致,分析原因可能是毒力變化情況與不同NaCl添加量等應激條件、菌種、菌株有關。本研究結果顯示,與對照組相比,鹽應激24 h時,3 株菌株6 g/100 mL NaCl組毒力基因變化沒有明顯的規律,而菌株CICC21530、菌株95的18 g/100 mL NaCl組和菌株109的12、18 g/100 mL NaCl組均顯著高于其他各應激組,即高鹽應激時對菌株毒力有增強作用。致病菌相關毒力基因的轉錄表達可能與鹽應激相關基因的調控有關[14,19],其具體機制有待進一步研究。本實驗結果表明大腸桿菌O157:H7有毒菌株在含鹽食品中的存活及其毒力特性的增強,將對食品安全造成潛在威脅。

4 結 論

鹽應激顯著抑制大腸桿菌O157:H7的存活,抑制效應與菌株、NaCl添加量有關。鹽應激時大腸桿菌O157:H7毒力基因表達的變化也與菌株、NaCl添加量有關,較高鹽量時,3 株菌存活數顯著降低的同時,毒力基因表達量卻顯著增加,即相對毒性增強。上述結果表明在實際含鹽食品風險評估中,不僅要關注存活菌量,還需重視殘存菌的毒力水平,從而更科學全面地評估大腸桿菌O157:H7的安全風險。