食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌改善四川泡菜風味

張楠笛,祝 林,許 琴,向文良

(西華大學食品與生物工程學院,四川 成都 610039)

四川泡菜是中國極具代表性的傳統發酵蔬菜,具有獨特風味及脆嫩清香口感,因此常被用作川菜的主要調味料或餐前開胃菜[1]。傳統四川泡菜以小規模或家庭式生產為主。近年來,隨著川菜產業的快速發展,小規模泡菜生產己不能滿足市場需求,大規模工業化生產四川泡菜己成為目前四川泡菜生產的主流[2]。然而,依賴于自然發酵為主的工業化泡菜生產常出現產品風味不穩定等問題[3]。四川泡菜發酵的本質是乳酸菌介導的各類生化反應,乳酸菌的種類及其活動是形成四川泡菜風味品質的關鍵,利用乳酸菌作為發酵劑生產四川泡菜是未來工業化生產四川泡菜的發展趨勢,其具有發酵周期短、產品風味穩定和抑制雜菌生長等優點,因此被認為是解決目前四川泡菜工業化自然發酵導致產品不穩定的最有效方案[4]。腸膜明串珠球菌、植物乳桿菌和雙歧桿菌等作為四川泡菜的發酵菌株,常用于工業化四川泡菜生產[5]。

發酵食品的風味是影響產品感官品質和消費者接受度的重要因素之一。傳統四川泡菜發酵包括異型乳酸發酵和同型乳酸發酵[4],二者協同形成了四川泡菜的風味特點[6]。異型乳酸菌在泡菜發酵初期占優勢,其代謝除產生乳酸外,還會生成大量的乙醇、乙酸、甘露醇等風味物質,賦予泡菜愉悅風味[7]。同型乳酸菌在泡菜發酵過程中迅速取代異型乳酸菌,其發酵特點是產酸能力強、發酵速度快,能夠快速給予泡菜酸爽感覺,但由于其代謝產物種類少,風味較為貧乏[8]。因此,異型和同型發酵菌株的選擇是決定發酵菌劑生產四川泡菜風味的關鍵[9]。

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)發酵泡菜以生成乳酸為主,同時可產生少量乙酸,具有耐酸和產酸能力強的特點,在泡菜成熟中后期占主導地位,是目前工業化泡菜生產使用最普遍的菌株[10]。食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)是自然發酵泡菜前期的異型乳酸發酵優勢菌,具有發酵復雜性和產物多樣性的特點,能產生更多的風味物質,賦予泡菜更好風味[11]。大多數研究泡菜接種發酵,僅接種了單一乳酸菌,然而接種單一乳酸菌發酵的泡菜,口感平淡[12-16]。目前,關于食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌發酵蔬菜的研究鮮有報道。因此,本研究選取四川泡菜常用蔬菜-豇豆為原料,探索食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌發酵對四川泡菜風味和感官品質影響,以期為豐富四川泡菜發酵菌種和食竇魏斯氏菌在四川泡菜生產中的應用提供理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

豇豆為四川某泡菜企業提供,選擇色澤正、無破損、無蟲害、無霉變的新鮮豇豆;食竇魏斯氏菌、植物乳桿菌為西華大學食品與生物工程學院實驗室保藏菌種。

MRS肉湯培養基 杭州微生物試劑有限公司;檸檬酸、乙酸、蘋果酸、乳酸(均為分析純) 成都科龍化工試劑廠;C7～C40飽和烷烴標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

TB-214電子天平 德國Sartorius公司;DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;PHS-2C酸度計成都世紀方舟科技公司;Alliance 2695高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀美國Waters公司;QP2010 Plus氣相色譜-質譜聯用儀日本島津公司;HPX-87H樹脂柱 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制作

食竇魏斯氏菌和植物乳桿菌接種于MRS液體培養基中,37 ℃培養至菌體濃度達到約1×108CFU/mL,4 500 r/min離心10 min,收集菌體后用0.85 g/100 mL無菌生理鹽水清洗2 次,并加入無菌生理鹽水制成菌懸液備用。

豇豆原料(500 g)經整理、清洗、瀝干、切分后,用75%食用酒精噴撒殺菌。無菌水清洗殘留食用酒精后,在超凈工作臺紫外線下瀝干,裝入2.0 L陶瓷泡菜壇。按照下列不同接種方式進行發酵:蔬菜與6.0%食鹽水質量體積比(g/mL)為1∶2裝9 壇,3 壇為1 組。一組接入5.0 mL植物乳桿菌懸液;一組接入5.0 mL食竇魏斯氏菌懸液;一組接入2.5 mL植物乳桿菌和2.5 mL食竇魏斯氏菌混合菌液。壇沿封水,25 ℃發酵7 d。每壇每隔1 d取樣6 份,3 份用于測定酸度、有機酸和菌落數。發酵豇豆最優時,測定泡菜發酵液中的揮發性物質。

1.3.2 菌落計數和pH值測定

參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[17]進行菌落總數測定。1.0 mL發酵液用0.85%無菌生理鹽水經10 倍梯度稀釋后涂布于MRS平板上,37 ℃倒置培養48 h。酸度計測定泡菜液pH值。

1.3.3 有機酸分析

采用HPLC儀測定泡菜發酵液中乳酸、檸檬酸、乙酸和蘋果酸。收集發酵鹽鹵,6 000 r/min離心5 min后取上清液,經0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。色譜條件基于Xiong Tao等[5]的方法進行優化改進。柱溫40 ℃,流動相為6.00 mmol/L H2SO4溶液,流速0.5 mL/min,紫外吸收檢測波長210 nm,進樣量10.0 μL。4 種有機酸標準品作外標,比較保留時間和峰面積,表征和定量泡菜發酵液中有機酸種類和含量。

1.3.4 揮發性物質分析

揮發性物質提取和檢測條件參照蔣麗等[18]的方法進行優化改進。頂空固相微萃取法提取揮發性化合物,氣相色譜-質譜法對其進行分離和定性。

揮發性物質富集:15 mL頂空進樣瓶中加入5.00 mL樣品、2.00 g NaCl和C7～C40飽和烷烴標準品,加蓋密封,40 ℃水浴平衡5 min后,將75 μm CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶吸附40 min,萃取后將纖維頭插入氣相色譜系統解吸3 min。

色譜-質譜條件:D B-5 M S毛細管色譜柱(30 m×250 μm,0.25 μm),進樣口溫度250 ℃;程序升溫40 ℃保持3 min,然后15 ℃/min升溫至120 ℃,保持5 min,以20 ℃/min升溫至230 ℃,保持5 min。He為載氣,流速1.0 mL/min,不分流。電子電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃,接口溫度280 ℃;掃描范圍m/z 40～400。

數據分析:由氣相色譜-質譜分析得到的質譜數據經計算機在NIST、Wiley檢索比對,要求匹配度大于800(最大值為1 000)。C7～C40飽和烷烴為混標,采用半定量的方法計算各揮發性物質含量。

1.3.5 感官分析

組織有品評經驗的品評員(男10 名,女10 名)對泡菜樣品進行感官評定。感官指標包括色澤(具有四川泡菜應有的色澤)、香氣(具有四川泡菜應有的香氣(蔬菜香味和復合香味)、滋味(滋味可口、酸咸適宜、無澀味和腐敗等異味)、體態(液汁清亮、組織致密、質地脆嫩)4 個方面8 個指標(色澤、形態、澀味、酸度、脆性、腐敗氣味、復合香味和蔬菜香味)。評分強度0～9(0:無;1～2:非常弱;3～4:普通;5～6:較好;7～8:好;9:很好)。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 pH值和微生物分析

在接種發酵過程中,3 種接種方式泡菜液的pH值在發酵前3 d呈快速下降趨勢,然后緩慢下降,直至穩定在3.0～3.5間波動(圖1A)。其中,接種食竇魏斯氏菌的泡菜液pH值從8.0下降至3.44;接種植物乳桿菌的泡菜液pH值從7.70下降至3.16,而二者混合發酵的四川泡菜液pH值從7.80下降到3.02。該研究結果與張其圣等[19]報道的泡菜pH值變化規律一致。然而,在發酵前期(0～3 d),食竇魏斯氏菌單獨發酵和其協同植物乳桿菌發酵的pH值下降速度明顯比植物乳桿菌單獨發酵快。Xiong Tao等[10]認為異型發酵乳酸菌在泡菜早期酸化速度比同型發酵乳酸菌快。食竇魏斯氏菌是典型的異型乳酸發酵菌株,在蔬菜發酵過程中能夠快速發酵多種底物生成有機酸。因此,接種食竇魏斯氏菌泡菜的pH值,比單獨接種植物乳桿菌的泡菜pH值下降更快。

圖1 四川泡菜發酵過程中pH值（A）和菌落總數（B）的變化趨勢Fig. 1 Changes in pH (A) and total bacterial count (B) in Sichuan pickle during fermentation

泡菜發酵初期,食竇魏斯氏菌和植物乳桿菌都能夠很好地代謝豇豆中的有機質,表現了較強的生長能力。初期單獨接種食竇魏斯氏菌的菌落總數高于單獨接種植物乳桿菌;協同發酵的菌落總數明顯高于二者單獨接種(圖1B)。蔬菜啟動發酵階段,異型乳酸菌繁殖快[20],因此單獨接種食竇魏斯氏菌的菌落總數高于單獨接種植物乳桿菌。但由于食竇魏斯氏菌的耐酸性較植物乳桿菌弱[19-21],故隨著發酵進行,其菌落數由8.02(lg(CFU/mL))逐漸減少到5.87(lg(CFU/mL))。異型乳酸發酵是蔬菜發酵的重要環節,不僅可以快速啟動發酵,還可以快速改變發酵環境,促進同型乳酸菌的快速繁殖[22]。盡管隨著發酵進行,食竇魏斯氏菌的數量會降低,但其代謝產物促進了植物乳桿菌的快速繁殖,因此協同發酵液中的菌落總數不會隨食竇魏斯氏菌數量降低而降低,相反其菌落總數會維持在一定數量,直至發酵結束。

2.2 有機酸分析

有機酸在發酵蔬菜的整體風味中起著重要作用,其含量和種類會影響泡菜品質,包括味道、顏色和風味[23]。乳酸、檸檬酸、蘋果酸和乙酸是泡菜發酵過程中生成的主要有機酸,不僅賦予泡菜酸爽味道和特殊的清新風味,更重要的是還能控制發酵過程中腐敗微生物的生長和繁殖[24]。

圖2 四川泡菜發酵過程中有機酸含量變化Fig. 2 Changes in organic acid contents in Sichuan pickle during fermentation

乳酸是四川泡菜發酵過程中生成的最主要有機酸。同型發酵乳酸菌通過糖發酵途徑產生唯一代謝終產物乳酸[25],異型發酵乳酸菌通過6-磷酸葡萄糖代謝途徑不僅生成乳酸,還產生乙酸、乙醇等其他代謝產物[3]。接種食竇魏斯氏菌,能夠明顯促進發酵前期協同代謝組中乳酸的生成,在第3天,協同發酵泡菜液中的乳酸質量濃度達到10.9 g/L,高于其他兩組(圖2A)。食竇魏斯氏菌是異型發酵乳酸菌,在泡菜發酵初期非常活躍,盡管產生乳酸能力較弱,但它的代謝活動會促進植物乳桿菌的快速繁殖和乳酸代謝,因而乳酸含量高。隨著發酵進行,協同發酵中乳酸含量呈現下降趨勢,發酵結束后與植物乳桿菌單獨發酵四川泡菜中的乳酸含量基本相當。

檸檬酸和蘋果酸也是發酵蔬菜中的重要有機酸。在發酵過程中,檸檬酸可進一步分解成某些利于氨基酸和風味物質形成的終產物[22],如乙醛和二乙酰等。接種食竇魏斯氏菌,能夠明顯提高協同發酵組對檸檬酸的利用率(圖2B),發酵第7天時,協同發酵組中檸檬酸質量濃度為0.235 g/L,低于單獨接種植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌。接種食竇魏斯氏菌的協同發酵組,初始產生較多的蘋果酸(圖2C)。蘋果酸在發酵過程中可進一步轉化成乳酸和二氧化碳[5]。因此,伴隨發酵進行,3 組發酵液中蘋果酸均表現出下降趨勢(圖2C)。發酵結束后,協同發酵組、植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌組中的蘋果酸質量濃度分別為0.055、0.050 g/L和0.033 g/L。

泡菜中的乙酸主要來源于乳酸菌的異型發酵[22],由圖2D可知,乙酸含量變化趨勢在3 種泡菜中相似。但是,協同發酵組乙酸含量在發酵過程中整體高于植物乳桿菌組。發酵后期,一部分乙酸參與酯化反應,生成一系列酯類等風味物質[26],導致發酵結束后三者差異不大,但食竇魏斯氏菌與植物乳桿菌協同發酵的終產物更豐富,對泡菜風味影響更大。

2.3 揮發性物質分析

風味是發酵食品最重要的特性之一,也是決定其消費可接受性和偏好性的重要因素[27]。在當前研究中,發酵7 d的3 種泡菜液中共檢測到32 種揮發性物質,包括酯類、醇類、醛類、烯類、酮類和其他化合物(表1)。食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌發酵,不僅可以增加揮發性物質的種類,同時還能明顯提高揮發性物質含量。食竇魏斯氏菌組和植物乳桿菌組中分別檢出揮發性物質20 種和22 種;協同發酵組中檢出揮發性物質27 種,新增乙酸異戊酯、丙酸-2-丙烯酯、乙酸松油脂、2,4-二甲基苯甲醛、大馬酮和4-乙基-2-甲氧基苯酚6 種揮發性化合物。協同發酵液中揮發性化合物的總量為6.096 mg/L,高于植物乳桿菌組(3.188 mg/L)和食竇魏斯氏菌組(2.01 mg/L)。圖3為共有揮發性物質含量差異性分析。

表1 接種不同發酵劑對四川泡菜揮發性成分含量的影響Table 1 Effects of different starter cultures on volatile components in Sichuan pickle

醇類是構成四川泡菜特征風味的一類重要化合物,是酯化反應的重要前體物質[28],還可進一步氧化成醛類、酸類等。醇主要來源于微生物發酵和氨基酸代謝,在泡菜中通常呈現出令人愉快的香味及甜味。在發酵7 d的泡菜液中,植物乳桿菌代謝產生了8 種醇,食竇魏斯氏菌代謝產生了9 種醇,二者協同并沒有增加醇的種類,但是明顯增加了醇類含量。協同發酵組中醇類總量為5.18 mg/L,食竇魏斯氏菌組和植物乳桿菌組則分別為1.742 mg/L和2.800 mg/L。4-萜烯醇、桉葉油醇、芳樟醇和松油醇是含量較高的醇類(表1),這些醇不僅能夠賦予泡菜柔和香味,而且還能與乳酸菌代謝氨基酸生成的苯乳酸和乙酸苯酯、苯乙醇等物質協同或反應,呈現更為愉悅的風味或生成更加復雜的呈味物質[29]。在4 種含量較高的醇中,4-萜烯醇含量最高,在協同發酵組中約為1.642 mg/L,植物乳桿菌組中為1.014 mg/L,食竇魏斯氏組中為0.585 mg/L;桉葉油醇協同增效最明顯,協同發酵組中桉葉油醇(1.835 mg/L)含量比植物乳桿菌組(0.794 mg/L)和食竇魏斯氏組(0.376 mg/L),分別增加131.11%和388.03%。正辛醇呈現油脂、草香味,植物乳桿菌代謝不能生成正辛醇,食竇魏斯氏菌代謝生成0.002 mg/L的正辛醇,但二者協同提高至0.006 mg/L。

圖3 共有揮發性物質含量的差異分析Fig. 3 Analysis of volatile components that differed between mixed and pure fermentations

酯類是泡菜中的另一類重要化合物,在泡菜中呈現怡人的甜味、水果香和花香[28]。在3 種發酵液中,協同發酵組中酯類質量濃度為0.417 mg/L,顯著高于單獨發酵組(表1)。乙酸乙酯、異丁酸丁酯、丁酸丁酯在協同發酵組中的含量明顯高于單獨發酵組的含量。其中,乙酸乙酯(水果香)在協同發酵組質量濃度最高,為0.139 mg/L。此外,具有明顯的水果香味和花香的乙酸異戊酯、丙酸-2-丙烯酯和乙酸松油酯只在協同發酵組中檢出。因此,食竇魏斯氏菌與植物乳桿菌協同發酵促進了泡菜中酯類物質的生成。

研究者認為,C8～C12的飽和醛具有較好的風味[30]。在協同發酵組中,沒有檢測到具有刺激性味道的低碳乙醛,但檢測到了2,4-二甲基苯甲醛,盡管其質量濃度低(0.008 mg/L),但它的存在對風味具有重要影響[29]。

此外,豇豆原料本身還含有某些揮發性物質,如左旋香芹酮、水芹烯和莰烯等,這些物質在協同發酵過程中盡管有所消耗,但并未消耗殆盡。因此,協同發酵不僅賦予了泡菜特有的香味,也使泡菜具有一定的蔬菜原香。

2.4 感官品質評價

圖4 不同發酵劑發酵的四川泡菜感官品質評價Fig. 4 Sensory characteristics of Sichuan pickles fermented with different starter cultures

對實驗組四川泡菜進行感官分析,評價其感官品質,圖4表明,食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌發酵泡菜,盡管脆性、澀味描述分數低于接種植物乳桿菌組,但其具有明顯成熟泡菜酸鮮口感。同時,協同發酵組比單獨發酵組的泡菜更具愉悅香氣與和諧口感。此外,協同發酵組在蔬菜香味(7.5 分)和復合香味(7.8 分)方面也優于單菌發酵組。說明食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌能夠明顯改善植物乳桿菌發酵泡菜的風味。

3 結 論

異型乳酸發酵食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌用于四川泡菜生產時,能夠快速啟動泡菜發酵,促進乳酸菌快速繁殖,增加發酵初期乳酸含量,防止腐敗菌滋生。同時,食竇魏斯氏菌協同植物乳桿菌發酵四川泡菜,能夠明顯提高泡菜產品中揮發性風味物質的種類和含量,明顯改善植物乳桿菌發酵泡菜的風味,賦予更加爽口、酸香口感。本研究為四川泡菜工業化生產,應用食竇魏斯氏菌改善植物乳桿菌泡菜產品風味、提高產品質量,提供了前期基礎和理論依據。