應用高通量測序技術檢測小麥儲藏過程中真菌群落的變化

岳曉禹,張 華,陳威風,許文濤,郭明璋,*

(1.河南牧業經濟學院食品工程學院,河南 鄭州 450046;2.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

小麥是我國主要的糧食品種之一,對國家糧食安全具有重要的戰略意義。小麥容易發生真菌污染,導致小麥品質下降,并產生真菌毒素。若含有真菌毒素的小麥被人食用,則可能會導致肝炎、肝癌等嚴重危害人體健康的疾病[1-2]。市場調查結果顯示,小麥中真菌毒素的檢出率明顯高于其他谷物[3],說明小麥的真菌污染的情況比其他谷物嚴重。小麥真菌污染可能發生在生產、儲存、運輸、銷售等各個階段,其中小麥倉儲過程由于時間周期長、麥粒密度大,極易發生真菌污染的加重和擴散,是決定小麥真菌污染嚴重程度的關鍵環節之一。

研究小麥倉儲過程中真菌污染的發生規律是降低小麥真菌污染的前提條件和有效途徑。目前在此方面的研究主要集中在水分和溫度對倉儲小麥真菌發生的影響[4-6],發現了抑制真菌發生的最佳濕度和溫度,從而為小麥倉儲的溫濕度條件設置提供了參考。在倉儲過程中,小麥中的真菌群落并非一成不變,而是隨著時間和空間發生動態變化,因此研究小麥儲存過程中真菌群落的時空變化對于小麥倉儲真菌污染控制具有指導意義。本研究團隊在之前的研究中應用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術探究了玉米儲藏過程中的霉菌群落時空分布特征[7],但在小麥領域尚鮮見報道。

研究微生物群落的方法主要有3 類,即培養法、傳統分子生物學方法和高通量測序方法[8-9]。培養法通過分離培養研究樣品中的微生物群落。由于在培養過程中各種微生物的生長速率不同,導致培養后的微生物群落組成與樣品中原始的微生物群落有明顯差異。用于研究微生物群落的傳統分子生物學方法包括DGGE法[10]、隨機擴增多態性DNA技術[11]、限制性片段長度多態性技術[12]等,但這些方法通常只能研究微生物群落中高豐度菌株。高通量測序方法研究微生物多樣性具有靈敏度、準確率高等優勢,己被廣泛應用于各類樣品的真菌群落研究中[13-16]。本實驗采用高通量測序技術,對河南和黑龍江兩地、不同儲藏時間、不同儲藏位置小麥樣品的真菌群落進行研究,為小麥倉儲過程中真菌污染的控制提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥樣品采自河南省和黑龍江省,樣品編號及相關信息如表1所示。

從河南嵩縣儲藏糧庫采集小麥,糧庫中小麥品種主要為西農928、洛旱9號、運旱115、洛旱15。從黑龍江雙鴨山糧庫中采集儲藏小麥,糧庫中小麥品種主要為東農121號、墾九9號、遼春14號小麥、小麥新品種東農024。河南小麥采樣時間為2016年8月9日,黑龍江小麥取樣時間為2016年8月23日。每個樣品采樣質量約2 kg。糧庫南側、糧庫北側距離墻壁距離大約1～1.5 m。同一個年份的樣品是從一個糧倉中取。

表1 小麥樣品編號及相關信息Table 1 Information about wheat samples tested in this study

Phusion超保真DNA聚合酶 美國New England Biolabs公司;高通量測序建庫試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

KQ-250B超聲波振蕩器 中國上海早盈公司;H1850R低溫高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司;聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀 美國Biometra公司;HiSeq 2500 PE250高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥中真菌基因組DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)法提取小麥的真菌[17-19]。具體參考文獻[7]中的玉米中真菌提取方法。

1.3.2 PCR擴增及高通量測序

PCR擴增及高通量測序主要委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。具體方法為利用帶有標簽的ITS1區通用引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)對樣品真菌基因組DNA進行擴增。根據PCR產物濃度進行等量混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。使用高通量測序建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,使用HiSeq 2500 PE250進行測序。

1.3.3 生物信息學分析及統計分析

原始數據根據標簽序列信息進行拆分,得到樣品序列信息。序列經過去除標簽序列、去除引物序列、序列拼合、去除低質量序列后,得到有效序列。有效序列利用QIIME軟件[20]進行97%相似度的可操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)聚類,代表序列提取,基于GreenGene數據庫對代表序列進行注釋,得到每個樣品中每種OTU的序列數量。利用PAST軟件[21]對樣品中真菌群落OTU數據進行非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)和Simpson多樣性指數分析。利用Draw Venn Diagram在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對樣品中真菌群落OTU數據進行韋恩圖分析。利用在線分子生態網絡分析工具[22]對小麥真菌群落中各物種的關聯性進行分析。利用LDA Effect Size(LEfSe)[23]在線工具對不同組之間有顯著差異的真菌種類進行分析。利用STEM軟件[24]對不同深度小麥中真菌群落的分布做趨勢分析。

2 結果與分析

2.1 小麥儲藏過程中真菌群落的一般結構特征

圖1 小麥儲藏過程中真菌群落的一般結構特征Fig. 1 General structural characteristics of fungal communities during wheat storage

如圖1 A所示,儲糧小麥中真菌以子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)為主,二者之和占到全部真菌的99.6%以上,其他低豐度微生物屬于接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)。不同樣品中子囊菌門微生物與擔子菌門微生物的比例差異較大,子囊菌門微生物的比例通常大于擔子菌門微生物的比例。如圖1B所示,在屬的分類水平上,物種多樣性最高的屬為鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)和枝孢霉屬(Cladosporium)是測序結果中豐度最高的己知菌屬,其中曲霉屬測得12 個種,包括亮白曲霉(A. candidus)、黃曲霉(A. flavus)、煙曲霉(A. fumigatus)、嗜鹽曲霉(A. halophilicus)、蜂蜜曲霉(A. melleus)、黑曲霉(A. niger)、帚狀曲霉(A. penicillioides)、局限曲霉(A. restrictus)、曲霉屬NRRL 145(Aspergillussp.NRRL 145)、土曲霉(A. terreus)、小麥曲霉(A. tritici)和雜色曲霉(A. versicolor)。在種的水平上,共發現93 種真菌,平均豐度最高的種為Pleosporaceae sp. RS_5、極細鏈格孢(A. tenuissima)、帚狀曲霉、小麥黑穗菌(Tilletia controversa)、蒜狀枝孢菌(C. allicinum)和枝狀枝孢菌(C. cladosporioides)。分子生態網絡分析可以揭示各種真菌在數量關系上的相關性,結果如圖1C所示,Selenophoma mahoniae、極細鏈格孢(A. tenuissima)和索伊納尾孢菌(Cercospora sojina)是分子生態網絡的中心位置,與其他菌種具有最為豐富的相關性,說明這些菌種可能在倉儲小麥真菌群落中起到核心作用。

2.2 小麥儲藏時間對其中真菌群落結構的影響

本研究于2016年從河南省糧倉采集入庫年份分別為2013年(S2013、N2013)、2014年(S2014、N2014)、2015年(S2015、N2015)的小麥樣品,分別儲藏3、2、1 a。NMDS圖在二維圖譜上繪制各個樣品的菌群特征,圖上兩點距離越近,代表菌群特征越相近。由圖2A可知,儲藏3 a的小麥樣品與儲藏1 a的小麥樣品分別聚類在圖譜的不同區域,而儲藏2 a的小麥樣品中真菌群落介于儲藏1 a和儲藏3 a的真菌群落之間,可能處于過渡狀態。上述結果表明,小麥中真菌群落可能與小麥的儲藏時間有關。S2014和N2014在圖譜坐標系上的距離較遠,這可能是由于過渡狀態群落物種組成不穩定,變化較大導致的,其中N2014樣品與儲藏3 a的樣品在圖譜上距離較近,說明N2014樣品中的真菌群落處于過渡狀態的后期,而圖譜上S2014樣品距離儲藏3 a和儲藏1 a的樣品距離均較遠,說明S2014樣品中的真菌群落可能處于過渡中期。在多樣性方面,小麥真菌Simpson指數隨著儲藏時間的延長而略微上升,但各組之間均無顯著差異。

圖2 小麥真菌群落與儲藏時間之間的關系Fig. 2 Relationship between fungal communities in wheat and its storage period

儲藏時間不同可能導致小麥真菌群落整體結構有所差異,而真菌群落整體結構差異通常是由關鍵真菌菌種的差異所導致。LEfSe分析(圖3)可以得到不同儲藏時間真菌群落間的差異菌群。由圖3可以看出,儲存1 a的小麥樣品中,只有Geosmithia屬的CCF3652菌株是特征菌群,即該菌株在儲存1 a的小麥真菌群落中的比例顯著高于該菌株在儲存2、3 a的小麥真菌群落中。儲存2 a的小麥樣品特征真菌包括出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、S. mahoniae、Candida palmioleophila和Chaetomidium leptoderma,其中S. mahoniae是小麥真菌群落分子生態網絡中的核心菌群。儲存3 a的小麥樣品特征菌群包括亮白曲霉(A. candidus)、C. railenensis、粉紅單端孢霉(Trichothecium roseum)、Pleurotus citrinopileatus、少根根霉原變種(Rhizopus arrhizus var. arrhizus)。

圖3 利用LEfSe分析不同儲藏時間小麥真菌群落中的特征真菌Fig. 3 LEfSe analysis of characteristic fungi in fungal communities in wheat stored for different years

2.3 小麥在糧庫內儲藏位置對其中真菌群落結構的影響

圖4 小麥真菌群落與糧庫中儲存位置的關系。Fig. 4 Relationship between fungal communities in wheat and its location in warehouse

采集3 個不同倉庫南側和北側的糧食樣品,分析其真菌群落結構,研究糧庫內儲藏位置對小麥真菌群落結構的影響,結果如圖4所示。從糧庫南側和糧庫北側采集的樣品真菌群落并未發生分別聚類,而是呈現間隔分布的特點,由此可見儲存位置對小麥真菌群落的影響可能沒有儲藏時間明顯。這一現象可能是由于同一糧倉中整體環境比較均一,且糧庫中不同位置小麥的真菌孢子可以通過空氣進行交流。在多樣性方面,從糧庫南側采集的小麥樣品中真菌群落的多樣性在平均值方面略高于從糧庫北側采集的小麥樣品,但差異并不顯著(P＞0.05)。由于對糧庫中真菌群落的空間分布鮮見于前人的報道中,因此本結果需要更深入的研究和更多糧庫樣品的驗證。

2.4 小麥儲藏深度對其中真菌群落結構的影響

小麥儲藏深度可能影響溫度、濕度、氧氣濃度等環境條件,從而導致其中真菌群落的組成有所差異。本研究采集了糧倉中表層(WH1)、中層(WH2)、深層(WH3)3 份小麥樣品,分析其中真菌群落結構特點。由圖5A可以看出,3 份樣品中共有真菌種類為87 種,仍然占到所有真菌種類的45.1%,而在各層特有真菌方面,表層小麥樣品特有33 種真菌,中層小麥樣品特有20 種真菌,深層小麥樣品特有8 種真菌。在表層小麥特有的33 種真菌種,糞殼菌綱(Sordariomycetes)的真菌有17 種,占51.5%。進一步分析糞殼菌綱中所有真菌在不同層次小麥樣品中分布情況,發現大部分糞殼菌綱真菌由“表層-中層-深層”的分布呈現出減少的趨勢(圖5B),即糞殼菌綱真菌主要分布在表層或中層的儲藏小麥中,而在深層小麥中分布較少。通過糞殼菌綱的例子可以看出,小麥儲藏深度對其中的真菌群落有一定程度的影響。

圖5 小麥真菌群落與儲藏深度之間的關系Fig. 5 Relationship between fungal communities in wheat and its storage depth in warehouse

2.5 河南和黑龍江兩地儲藏小麥中真菌群落的比較

圖6 河南和黑龍江兩地小麥樣品中真菌群落的比較。Fig. 6 Comparison of fungal communities in wheat samples collected from different provinces

整體比較河南省和黑龍江省糧庫所采集的小麥樣品中的真菌群落,可以發現二者具有很大差異。LefSe分析(圖6A)表明,兩省樣品在種水平上的23 種真菌具有顯著性差異,其中既涉及到Pleosporaceae RS_5、帚狀曲霉(A. penicillioides)等高豐度菌種,也涉及到S. mahoniae,極細鏈格孢(A. tenuissima)和索伊納尾孢菌(C. sojina)等在小麥真菌群落分子生態網絡中處于核心位置菌種,由此可見,河南和黑龍江兩地儲藏小麥種真菌群落結構具有實質性的區別。從圖6B可以看出,主要菌群在各個樣品中的豐度分布情況。取自同一省份的樣品中真菌群落分布較為一致,而河南和黑龍江兩地的樣品中這些菌種分布差異明顯。由于河南省樣品屬于不同儲藏時間,黑龍江省樣品采自不同儲藏深度,可以推測河南和黑龍江兩地對小麥真菌群落的影響可能大于儲藏時間和儲藏深度對真菌群落的影響。

3 討 論

在本研究之前,國內外己有利用培養法或傳統分子生物學方法研究小麥中真菌群落特征的報道。與前人的報道相比,本研究利用高通量測序技術得到的結果在全面性和靈敏性方面有明顯提高。例如,李慧等[25]應用培養法從小麥粉中分離培養出5 株真菌,為鏈格孢霉、橘灰青霉、黑曲霉各1 株,米曲霉2 株。Tralamazza等[26]利用培養法研究巴西小麥,發現小麥中真菌以鏈格孢霉、鐮刀菌、附球孢菌為主。都立輝等[27]利用PCR-DGGE技術研究儲糧小麥中真菌群落,共發現了8 種真菌,主要為帚狀曲霉、格孢腔菌、枝孢菌和假絲酵母。本研究利用高通量測序技術,共發現了93 種真菌,其中高豐度真菌種類與培養法和傳統的分子生物學方法得到的結果基本一致,但高通量測序方法對低豐度真菌的研究能力是培養法和傳統分子生物學方法所不能勝任的。高通量測序方法也存在不足,如培養法分離得到菌株后,可以方便的研究菌株的產毒素能力,而高通量測序方法只能研究真菌物種組成,在真菌毒素方面只能依據物種組成進行推測。

本研究結果表明,鏈格孢屬、曲霉屬和枝孢霉屬是測序結果中豐度最高的己知菌屬。鏈格孢屬和曲霉屬都是小麥作物常見的病原菌,而枝孢霉屬廣泛分布在土壤和空氣中,因此這些微生物的孢子附著在倉儲小麥上的概率很高。若儲藏條件不當,這些真菌的孢子可能萌發,產生真菌毒素,導致倉儲小麥的食品安全風險。例如鏈格孢屬微生物可能產生交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚、交鏈孢烯、交鏈孢菌酮酸和交鏈孢毒素等[28],曲霉屬微生物可能產生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等[25,29]。利用高通量測序技術分析倉儲小麥中真菌種類,有利于改進儲藏條件,有針對性的防止相應的真菌毒素產生。

在之前的研究中,本課題組曾提出“依據預測微生物學,構建儲糧中微生物生長預測模型,可以快速對儲糧中微生物的生長情況進行判斷,對儲糧中病原微生物和腐敗微生物的控制有重要作用”[30]。任何預測模型的建立都必須以實測數據為基礎,在實測數據中找到規律,建立模型,之后進行驗證。本研究結果對小麥真菌生長預測模型的指導意義包括:首先,建立模型時,應考慮糧庫所在省份的差異,河南和黑龍江兩地由于地理位置和環境條件的差異,可能需要完全不同的預測模型;其次,儲藏時間和儲藏深度時可能是影響小麥真菌生長和演替的主要因素,其原因可能是這2 個因素都影響小麥的呼吸狀態、營養狀態及氧氣、溫度、濕度等環境條件;再次,由于糧倉中整體環境比較均一,因此儲藏位置可能對小麥真菌生長模型的影響較小。本實驗可為儲糧中微生物生長預測模型建立提供參考,但具體規律仍需更多的樣品進行驗證。