ARTP-DES連續誘變選育高產ε-聚賴氨酸突變株

席志文,黃林娜,翟一暢,惠豐立

(南陽師范學院生命科學與技術學院,河南 南陽 473061)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由鏈霉菌產生的由25～35賴氨酸單體組成的一種天然聚合物。由于其具有廣譜抑菌性[1],被廣泛應用于食品保鮮行業[2-3]。此外,ε-PL還具有水溶性好、熱穩定強、安全性能高等優點,在醫學、農藥等領域也有很大的應用潛力[4-5]。野生型菌株ε-PL產量很低,無法滿足工業化生產。對野生菌株進行選育以提高其ε-PL產量在工業化生產中占有舉足輕重的地位。日本學者最早通過選育S-2-氨乙基-L-半胱氨酸抗性菌株,獲得了搖瓶產量2.1 g/L的高產ε-PL菌株,提高了近20 倍[6]。國內也有一些文獻報道[7-12]。陳緯緯等[7]對Kitasatospora PL623采用硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)誘變,將其ε-PL搖瓶產量提高了2 倍,達到1.17 g/L;Zong Hong等[8]通過對Streptomyces albulus A-29進行ARTP誘變,其ε-PL產量從0.40 g/L提高至1.59 g/L。近年來核糖體工程技術[13-17]、原生質體融合[18-21]以及分子學手段[22-23]等也引入到ε-PL高產菌的選育中。吳光耀等[13]對S. albulus AS3-14連續引入鏈霉素和利福平兩種抗生素,獲得1 株雙抗高產突變株S. albulus WG-608,ε-PL搖瓶產量達到3.7 g/L,較出發菌株提高42.3%;Wang Liang等[14]通過基因組重排技術結合慶大霉素抗性篩選,得到1 株抗性突變株S. albulus AG3-28,ε-PL搖瓶產量為3.43 g/L,較出發菌株提升49.1%。可見不管采用何種選育手段,只要確定合適的條件,都能一定程度提高目的菌株的ε-PL產量。

傳統誘變不需要了解菌株自身復雜的遺傳背景,可以直接進行誘變,誘變過程簡單[24]。其關鍵在于確定合適的誘變及篩選手段。新興的誘變技術雖然篩選效率較高,但是由于代謝合成過程的高度復雜,也面臨著遺傳穩定性較低、過程繁瑣等問題。目前對于產ε-PL菌株的選育主要是以傳統誘變為基礎的非理性改造,主要集中在單因子誘變及多因子間斷誘變[7-11],誘變效果不盡相同。對于多因子連續誘變的研究較少。有學者對1 株工業釀酒酵母采用己烯雌酚和紫外線連續復合誘變,得到的高產菌株乙醇產量高于常規誘變獲得的菌株,且此方法正突變率也高于常規復合誘變[25]。因此,本研究以傳統誘變為基礎,對1 株ε-PL產生菌小白鏈霉菌S. albulus進行常溫室壓等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)與DES兩因子連續誘變,通過ARTP誘變創造豐富的突變基因組文庫,以突變文庫作為DES誘變的“出發菌株”,并改進突變菌篩選方法,探究一種更高效的選育方法,以期獲得1 株性能穩定的高產突變株,為其工業化打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

工業菌株小白鏈霉菌為本實驗室保存。

1.1.2 培養基

貝特納固體培養基:葡萄糖1%,蛋白胨0.2%,酵母粉0.1%,瓊脂2%,pH 7.5;M3G種子(發酵)培養基:葡萄糖5%,酵母粉0.5%,硫酸銨1%,磷酸二氫鉀0.14%,磷酸氫二鉀0.08%,七水合硫酸鎂0.05%,硫酸鋅0.004%,硫酸鐵0.003%,pH 6.8;優化培養基[13]:葡萄糖6%,酵母粉0.8%,硫酸銨0.5%,七水合硫酸鎂0.2%,磷酸二氫鉀0.2%,硫酸鋅0.003%,硫酸鐵0.004%,pH 6.8;RSM培養基[13]:葡萄糖6%,牛肉膏1%,硫酸銨0.5%,七水合硫酸鎂0.08%,磷酸二氫鉀0.4%,硫酸鐵0.004%,pH 6.8;亞甲基藍培養基:固體培養基加0.002%亞甲基藍。上述培養基均在115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ARTP誘變育種系統 無錫源清天木生物科技有限公司;多功能酶標儀 美國PerkinElmer公司;ZWYR-D2403型恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;SGD-IV型還原糖測定儀 山東省科學院生物研究所;MB100-4A型微孔板恒溫振蕩器 杭州奧盛儀器有限公司;CT14RD11臺式離心機 上海天美生化儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單孢子懸浮液制備

將出發菌株在貝特納固體平板上活化,30 ℃培養5～7 d至孢子長滿平板,用15%的滅菌甘油沖洗下孢子,經4 層無菌擦鏡紙過濾2 次,適當稀釋孢子懸液,使其濃度在108CFU/mL左右,-80 ℃保藏備用。

1.3.2 小白鏈霉菌的連續誘變

1.3.2.1 ARTP誘變

取出發菌株孢子懸液10 μL均勻涂到無菌金屬誘變片上,將裝有誘變片的平皿轉移至提前滅菌的ARTP誘變儀工作室中。工作電壓110 W,照射距離2 mm,工作氣流10 slpm,設置照射時間30、45、60、90、105、120、150、180 s。將處理過的誘變片于1 mL生理鹽水的EP管中充分混勻,稀釋涂布平板,每個時間設置3 個平行,30 ℃培養3～5 d,記錄每個平板的菌落數,以出發菌株的菌落數作對照,計算致死率。

1.3.2.2 ARTP-DES連續誘變

選取合適的ARTP誘變條件對出發菌株進行誘變,將所得孢子懸液于恒溫搖床30 ℃培養30 min后加入到pH 7.0磷酸緩沖液中,配成20 mL反應體系,分別加入40、80、120、160、200 μL DES,使其反應體積分數分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%,30 ℃避光反應20 min后加入25%硫代硫酸鈉(Na2S2O3)終止反應,稀釋涂布平板,30 ℃培養3～5 d,以孵育后的孢子懸液為對照,根據平板菌落數計算連續誘變致死率。圖1為連續誘變技術流程圖。

圖1 連續誘變流程Fig. 1 Flowchart of continuous mutagenesis

1.3.3 突變菌株的篩選

將誘變后的孢子懸液梯度稀釋,均勻涂布鏈霉素最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)抗性平板,30 ℃培養5～7 d。初篩時用無菌牙簽挑取抗性平板上剛長出的單菌落至亞甲基藍平板中,30 ℃培養5～7 d,選取透明圈較大的單菌落劃線貝特那固體平板培養3～5 d。挑取平板上成熟孢子接種至M3G種子培養基的48微孔板中(裝液量0.5 mL),30 ℃、500 r/min培養24 h;以10%接種量轉接種子液至M3G發酵培養基中,每孔3 個平行,30 ℃、500 r/min培養84 h。采用酶標儀對其ε-PL含量快速測定。挑選ε-PL產量得到提升的菌株劃線貝特那固體平板。

復篩時挑取初篩所得菌株的孢子至裝有20 mL M3G種子培養基的100 mL三角瓶中,培養24 h,以10%接種量轉接種子液至M3G發酵培養基中,培養84 h。搖瓶培養條件為30 ℃、200 r/min。測定ε-PL含量,選出高產菌株。

1.3.4 指標分析測定

1.3.4.1 突變率及正突變率

突變率及正突變率計算如式(1)、(2)所示:

式中:T為挑選菌落總數;M為突變菌總數(為避免誤差,選取產量高于或低于出發菌株5%以上的菌株);P為ε-PL產量大于出發菌株5%以上的突變菌總數。

1.3.4.2 ε-PL含量測定

參考甲基橙測定法[26]:取1 mL發酵液,8 000 r/min離心15 min,上清液用0.7 mmol/L pH 6.9磷酸緩沖液稀釋,使ε-PL質量濃度在0.01～0.12 g/L之間。2 mL稀釋液與等體積1 mmol/L甲基橙溶液振蕩反應,30 ℃、200 r/min反應30 min。離心上清稀釋20 倍后吸取250 μL加入96 微孔板中,用酶標儀測定465 nm波長處的OD值,根據標準曲線計算ε-PL質量濃度。

1.3.4.3 菌體干質量測定

取10 mL發酵液,8 000 r/min離心10 min,棄上清液,用無菌水洗滌2 次,用提前稱量的濾紙過濾,100 ℃過夜烘至質量恒定,得到菌體干質量。

1.3.4.4 發酵液葡萄糖含量測定

采用SGD-IV型還原糖測定儀測定。

1.3.5 高產菌株生理特性

1.3.5.1 不同培養基發酵性能測試

刮取平板上突變菌株AD-9與出發菌株孢子接種至裝有20 mL M3G種子培養基的100 mL三角瓶中,30 ℃、200 r/min培養24 h,后按10%接種量分別接種至M3G發酵培養基、RSM培養基及優化培養基中,30 ℃、200 r/min培養84 h。檢測發酵液ε-PL質量濃度。

1.3.5.2 發酵過程中菌絲球差異

刮取平板上突變菌株AD-9與出發菌株孢子接種至M3G種子培養基,30 ℃、200 r/min培養24 h,以10%接種量轉接至優化培養基。取發酵至24、48、72 h的發酵液,采用微分干涉顯微鏡觀察菌絲球形態。

1.3.5.3 高產菌株與出發菌株搖瓶自然發酵過程比較

刮取平板上突變菌株AD-9與出發菌株孢子接種至M3G種子培養基,30 ℃、200 r/min培養24 h,后按10%接種量接種至優化培養基,培養84 h。測定發酵過程中pH值、菌體干質量及ε-PL含量,每隔12 h取一次樣,每瓶3 個重復。

1.4 數據處理

數據分析和圖像繪制均采用GraphPad Prism5軟件處理。

2 結果與分析

2.1 小白鏈霉菌的連續誘變

2.1.1 ARTP誘變時間確定

圖2 小白鏈霉菌ARTP誘變致死率曲線Fig. 2 Death rate of S. albluus caused by ARTP

圖2 結果表明,致死率隨誘變時間的延長不斷變大,180 s致死率達到97.4%,接近100%。本研究為構建多樣基因組文庫,選取低(照射時間30 s、致死率36.8%)、中(照射時間60 s、致死率60.8%)、高(照射時間105 s、致死率87.6%)3 個致死率對出發菌株進行誘變。

2.1.2 DES誘變劑量的確定

按1.3.2.2節方法取出發菌株孢子懸液200 μL加入19.8 mL磷酸緩沖液中,分別加入40、80、120、160、200 μL DES原液,使其體積分數為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%,30 ℃避光反應20 min,反應結束后立即加入1 mL 25% Na2S2O3溶液終止反應,以出發菌株孢子懸液作為對照,稀釋涂布平板,30 ℃培養3～5 d,根據平板菌落數計算致死率。出發菌株DES誘變致死率曲線如圖3所示,DES體積分數為1.0%時,致死率達到97.1%,DES體積分數為0.6%時,致死率為81.1%。本研究選取體積分數0.6%為小白鏈霉菌的DES誘變劑量。

圖3 小白鏈霉菌DES誘變致死率曲線Fig. 3 Death rate of S. albluus caused by DES

2.1.3 ARTP-DES連續誘變劑量的確定

圖4 小白鏈霉菌ARTP-DES連續誘變致死率曲線Fig. 4 Death rate of S. albluus caused by ARTP-DES

連續誘變由于各種誘變因子的作用機制不同,因此可以取長補短,動搖DNA分子上多種基因的遺傳穩定性,以彌補某種不親和性或熱點飽和現象,得到更多的突變類型[24]。根據小白鏈霉菌ARTP致死率曲線,以低、中、高3 個致死率對小白鏈霉菌誘變,得到的孢子懸液孵育30 min后配成20 mL DES反應體系。以孵育后的孢子懸液為對照計算連續誘變致死率。如圖4所示,DES體積分數為0.6%時,致死率達到86.45%。比相同劑量出發菌株DES誘變高5.35%,說明經過一輪ARTP誘變后,突變孢子基因發生改變,對DES的敏感程度增強。根據育種經驗,本研究選取DES體積分數0.6%作為最佳誘變劑量。

2.2 突變菌株初篩方法的確定

2.2.1 鏈霉素MIC分析

核糖體工程通過對菌株引入抗生素抗性突變,進而影響其核糖體結構和次級代謝過程,造成次級代謝產物的大幅提升[27]。鏈霉素是作用于核糖體上的一種常用抗生素,它可以抑制mRNA翻譯起始,進而影響微生物次級代謝,己有不少學者利用鏈霉素抗性突變并取得顯著效果[10,13,16]。將小白鏈霉菌孢子懸液涂布鏈霉素抗性平板,在鏈霉素質量濃度1 μg/mL(圖5a)和3 μg/mL(圖5b)的平板上,菌落生長受到抑制,生長5 d之后未長孢子,而鏈霉素質量濃度在4 μg/mL(圖5c)時,平板有生長很小的單菌落,生長極為緩慢,說明小白鏈霉菌生長受到強烈抑制。MIC是指菌落在抗性平板上正好不生長或只有極少數菌落生長的最小濃度。本研究中鏈霉素對小白鏈霉菌具有明顯抑制作用,說明它可以作為抗性“篩子”對突變菌進行篩選。為了擴大篩選范圍,選取4 μg/mL為小白鏈霉菌對鏈霉素的MIC。

圖5 小白鏈霉菌在不同質量濃度鏈霉素平板上的生長情況Fig. 5 Growth of S. albulus on medium plates containing streptomycin at different concentrations

2.2.2 亞甲基藍透明圈法

圖6 突變菌株在亞甲基藍平板上的透明圈Fig. 6 Transparent circles on methylene blue plates produced by mutant strains

小白鏈霉菌ARTP誘變所得突變菌在亞甲基藍平板上的生長情況如圖6所示,平板上呈現大小不同的透明圈。挑選透明圈較大的菌株進行48微孔板發酵。突變菌ε-PL產量見圖7,在亞甲基藍平板上挑取的大部分菌株ε-PL產量提升。對初篩ε-PL產量提高的菌株進行搖瓶復篩,得到1 株突變菌A-6,搖瓶產量為0.701 g/L,較出發菌株提高了16.8%。可見鏈霉素抗性結合亞甲基藍透明圈篩選可以作為快速篩選高產菌株的一種方法。有學者通過測量菌落透明圈的H/C值篩選高產菌株[28]。而本研究中挑取的單菌落為剛長出的單菌落,大小基本一致,因此可以在同一條件肉眼比較透明圈的大小,省去了測量的繁瑣過程。

圖7 ARTP誘變初篩結果Fig. 7 Results of primary screening of ARTP-induced mutants

2.3 ARTP-DES連續誘變篩選結果

表1 ARTP-DES連續誘變突變株ε-PL產量比較Table 1 Comparison of ε-PL yields in ARTP-DES-induced mutants

表2 3 種誘變方法的突變率及正突變率Table 2 Mutation rates and positive mutation rates

挑取抗性平板上菌株898 株至亞甲基藍平板中,從中選擇透明圈較大的菌株547 株,對其進行48 微孔板及搖瓶含量測定,搖瓶部分復篩結果見表1,突變菌株表現出ε-PL產量的大幅提升,其中菌株AD-1、AD-7、AD-9、AD-68搖瓶產量均超過1 g/L,AD-9的ε-PL產量為1.252 g/L,較出發菌株提升108.7%。為比較誘變效果,本研究也對出發菌株進行單一的ARTP與DES誘變篩選,得到ARTP高產菌株A-6,ε-PL產量為0.701 g/L;DES高產菌株D-1,ε-PL產量為0.885 g/L。AD-9的ε-PL產量較A-6高78.6%,較D-1高41.5%。同時,在進行ARTP誘變、DES誘變、ARTP-DES連續誘變的過程中,隨機挑選鏈霉素抗性平板菌落各100 株進行發酵測試,以ε-PL產量為指標計算每種誘變100 個菌株的突變率及正突變率。由表2可知,3 種誘變突變率都較高,這得益于鏈霉素抗性篩選。DES誘變突變率及正突變率高于ARTP誘變,說明DES對細胞的誘變效應更強;連續誘變的突變率及正突變率都高于ARTP誘變和DES誘變,說明ARTP與DES連續誘變效果顯著,結合篩選得到的高產菌株,進一步說明連續誘變可用于篩選高產ε-PL突變菌。AD-9經多次傳代表明遺傳性能穩定,因此選擇AD-9進行下一步的生理特性研究。

2.4 高產菌株生理特性

2.4.1 不同培養基發酵性能

圖8 不同培養基ε-PL產量對比Fig. 8 Comparison of ε-PL production of S. albulus and AD-9 with different media

菌株經過誘變,自身基因發生改變,造成代謝過程發生改變,引起目標產物的大幅度提升。伴隨著產量的提升,其營養需求可能也會發生改變。為發揮高產菌株的最大發酵潛能,本研究設置了3 種培養基(M3G發酵培養基、RSM培養基、優化培養基)以測試菌株發酵性能。從圖8可以看出,出發菌株與AD-9在3 種培養基中ε-PL 產量呈現相同的趨勢,產量由高到低分別為優化培養基、RSM培養基、M3G發酵培養基,說明優化培養基可以更高效地合成ε-PL。AD-9在3 種培養基中的ε-PL產量都高于出發菌株的ε-PL產量。說明經過連續誘變,AD-9的ε-PL合成能力得到加強。

2.4.2 發酵過程中菌絲球差異

在發酵過程中,不同菌絲球形態會影響菌株養料和氧氣的獲取,為進一步了解高產菌株AD-9發酵過程中的變化,觀察出發菌株與AD-9在發酵不同時期菌絲球形態。如圖9、10所示,在第24小時,出發菌株菌球較少,直徑較大,且菌絲球相互纏繞呈現不規則的形態;AD-9菌球致密,菌絲球直徑較小,大部分菌絲球呈現規則的橢圓形。發酵48 h,出發菌株菌絲球繼續纏繞,形成不規則的橢圓和條狀,有裂解的趨勢,AD-9菌絲球直徑稍增大,仍保持致密的狀態。到第72小時,出發菌株大部分菌絲球己出現了裂解現象,而AD-9仍保持致密狀態,菌絲球邊緣只出現少部分裂解。Hobbs等[29]通過向培養基中添加2 g/L的聚丙烯酸,發現Streptomyces coelicolorJ802菌絲球明顯分散,直徑變小,并且生物量和放線菌紫素含量得到大幅提升。王國良等[30]向培養基中添加0.5 g/L Mg2+,發酵過程中菌絲球直徑明顯減小,ε-PL比對照組提高了30.91%。可見菌體發酵中保持一定的菌絲球形態更有利于目的產物的分泌與積累。菌株AD-9優勢在于發酵過程中能保持致密且均勻的菌絲球形態,促進ε-PL持續分泌。

圖9 出發菌株（a）與AD-9（b）發酵過程菌體形態比較（×10）Fig. 9 Comparison of pellet morphology of the original strain (a) and AD-9 (b) on during fermentation (× 10)

圖10 出發菌株（a）與AD-9（b）菌絲球直徑比較（×20）Fig. 10 Comparison of the diameter of mycelial pellets of the original strain (a) and AD-9 (b) (× 20)

2.4.3 搖瓶自然發酵過程比較

如圖11所示,兩個菌株在發酵過程中pH值變化基本一致,在12～48 h內pH值下降較快,從最初的pH 6.8降到pH 3.2左右,此后開始緩慢下降,其中在12～24 h,出發菌株pH值下降幅度較AD-9大,這一階段出發菌株菌體干質量斜率高于AD-9,說明此階段出發菌株生長代謝強于AD-9。發酵過程中葡萄糖消耗趨勢基本一致,AD-9的葡萄糖消耗速率高于出發菌株,說明經過誘變,AD-9的生長代謝得到加強。AD-9發酵過程中的菌體干質量一直高于出發菌株,第84小時達到最大值5.52 g/L,比出發菌株的菌體干質量(4.18 g/L)高了1.3 g/L。對比ε-PL產量的變化,發現菌株AD-9 ε-PL的合成速率一直高于出發菌株,到第84小時,達到最大值2.1 g/L,而出發菌株第84小時的ε-PL產量為1 g/L,是其產量的2.1 倍。通過對菌體單位細胞ε-PL產量計算得到,出發菌株單位細胞產量為0.241 6 g/g,AD-9為0.380 4 g/g,突變后菌株單位細胞產量也得到加強。說明AD-9自身代謝過程發生改變,合成ε-PL能力增強。

圖11 出發菌株與AD-9自然搖瓶發酵過程比較Fig. 11 Comparison of shake flask fermentation characteristics of the original strain and AD-9

3 結 論

優良的菌株對于ε-PL工業化生產非常重要,而高效的誘變及篩選方法是獲得高產菌株的前提。傳統誘變仍是目前工業菌種選育的有效手段,但是傳統誘變耗時、耗力,缺乏高效篩選方法。本研究基于傳統誘變,將ARTP與DES連續誘變引入ε-PL高產菌株的選育中,并建立了鏈霉素抗性、亞甲基藍透明圈法定性檢測的快速篩選方法,大大提高了篩選效率。最終獲得1 株性狀優良的突變菌AD-9,其ε-PL搖瓶產量達到2.1 g/L,是出發菌株的2.1 倍。對比ARTP或DES誘變篩選得到的突變菌株,其產量提升幅度及正突變率遠遠領先,說明連續誘變對于產ε-PL菌株的產量提升效果明顯。對高產菌株和出發菌株進行生理特性比較,發現誘變后突變菌株發酵過程菌絲球形態及營養需求均發生了變化,對比不同培養基對菌株產ε-PL的影響,發現AD-9在所選培養基中的ε-PL產量都高于出發菌株,說明AD-9合成ε-PL的代謝過程得到加強,其代謝機制還需進一步研究。