醬香型白酒1輪次釀造細菌的菌群結構

胡小霞,黃永光,涂華彬,胡 峰,程平言,尤小龍

(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025;2.貴州茅臺酒廠(集團)習酒有限責任公司,貴州 習水 564622)

醬香型白酒作為典型的傳統固態發酵食品,釀造歷史悠久,深受世界人民尤其是東亞國家消費者的喜愛[1]。其釀造工藝特點可概括為高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫流酒,生產周期長、貯存時間長,用曲量大,多輪次取酒[2]。酒體風格特征為清亮透明、無色或微黃、醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、空杯留香持久[3]。

堆積發酵是醬香白酒釀造的獨特關鍵工序,屬于邊糖化邊發酵方式,通過堆積發酵可顯著富集微生物和酶類,生成醬香或醬香前體物質[4],為入窖發酵創造條件,相當于“二次制曲”[5-7],也是完成入窖發酵前的糖化基礎。細菌及細菌代謝產物在高溫堆積發酵過程的富集為形成后期窖池發酵的發酵動力和風味動力奠定了基礎。堆積發酵結束后,酒醅入窖池發酵,窖池發酵階段微生物菌群結構繼續推進發酵,并進一步促進醬香風味化合物的增加[8]。因此,堆積和窖池發酵的細菌菌群結構及其變化對產酒和生香具有舉足輕重的作用,而研究醬香型白酒發酵過程細菌菌群結構是解析發酵機理和風味形成的關鍵,近年引起很多研究人員的關注。如戴奕杰等[8]分析了醬香白酒釀造的下沙、造沙和7輪次堆積、窖池發酵糟醅的細菌多樣性,結果表明酒醅在發酵釀酒階段的優勢微生物為埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、Clostridium_sensu_stricto_1、鏈球菌屬(Streptococcus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和鏈格孢屬(Alternaria)。韓興林等[9]分析了醬香型白酒釀造8 個輪次堆積酒醅中的原核微生物結構,結果指出其優勢原核類微生物細菌屬主要為不動桿菌屬(Acinetobacter)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、Lactobacillus、片球菌屬(Pediococcus)、嗜麥糖寡養食單胞菌(Stenotrophomonas)、棲水菌屬(Enhydrobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)共12 種及未知菌屬Desmospora、Serpens 2 種屬。黃蘊利等[10]研究了醬香型白酒第2輪次堆積及窖池發酵過程酒醅中的微生物,發現堆積酒醅中優勢細菌有Bacillus、腸球菌屬(Enterococcus)、Lactococcus、Lactobacillus、Lentibacillus、克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、嗜堿菌屬(Alkaliphilus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、Thermoactinomyces等10 種;而窖池發酵酒醅中的最優勢細菌屬類有Lactobacillus、Acetobacter、Bacillus、Lactobacillus和Bacillus。郭敏等[11]運用高通量測序技術對醬香型白酒3輪次和7輪次窖池發酵酒醅微生物開展研究,發現兩個輪次的微生態多樣性存在較大的差異性特征,3輪次酒醅中Lactobacillus和Bacillus是絕對優勢細菌,而7輪次酒醅中則是Halomonas為最優勢細菌。

無論在堆積發酵還是窖內發酵過程,醬香風味都主要來源于多種微生物的共同作用[12],其中細菌的貢獻尤其重要。基于此,本課題組多年來一直聚焦于醬香型白酒釀造微生物多樣性及其生態結構的研究,運用高通量測序技術等多組學策略對醬香型白酒釀造的全輪次(1～7輪次)微生物菌群結構特征進行系統研究。本研究將1輪次堆積和窖池發酵過程的細菌菌群結構進行歸納總結,以期為傳統白酒固態發酵機制及產業發展提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品取自貴州XJ公司2車間12班釀造窖池第1輪次的堆積和窖池發酵酒醅。堆積酒醅樣品從堆積1 d開始取樣,周期為2 d(1輪次釀酒時節自然氣溫相對較低,堆升溫較慢,以2 d間隔取樣)。取樣點如圖1a所示,分別取堆子上層A點,中層B、C兩點,下層D、E兩點,取樣后混勻樣品(B、C兩點混勻為一個樣,D、E兩點混勻為一個樣),再將上、中、下3 個樣品混合為1 個樣品。后期所取樣品如同上法。

圖1 堆積（a）和窖池（b）酒醅取樣點Fig. 1 Sampling points of fermented grains during pile (a) and pit (b) fermentation

窖池發酵過程從酒醅堆積發酵結束入窖開始取樣,記為發酵0 d(即堆積發酵最后一天,7 d),以后每隔5 d取樣一次,取至窖池發酵35 d為止(窖池發酵共35 d)。窖池取樣點如圖1b所示,同一層面分別取3 個點,將同一層面的3 個點所取酒醅混勻為1 個樣,代表窖池1 個層面的酒醅樣(即A、B、C三點的取樣混勻后為1 個樣),同樣將D、E、F三點的取樣混勻為1 個樣,G、H、I三點的取樣混勻為1 個樣,分別代表窖池上、中、下3 個層面的酒醅樣。再將上中下3 個樣品混合為1 個樣品。研究共采集83 個發酵酒醅小樣,最終混合成DJ 1 d、DJ 3 d、DJ 5 d、DJ 7 d(FJ 0 d)、FJ 5 d、FJ 10 d、FJ 15 d、FJ 20 d、FJ 25 d、FJ 30 d、FJ 35 d共11 個樣品。

1.1.2 試劑

DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、引物合成 生工生物工程(上海)股份有限公司;E.Z.N.A. Soil DNA Kit美國Omega BioTek公司;異丙醇(分析純)、TAE(Tris Acetate-EDTA)緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖 南京生興生物技術有限公司;Goldview染料上海賽百盛有限公司;rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽(廈門)儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國ABI公司;DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理[10]及DNA抽提

分別稱取混合好的每個樣品各10 g,用15 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮,加入3 顆玻璃珠,旋渦振蕩10 min。300 r/min離心5 min,取上清液,沉淀用PBS重復洗滌3 次,離心后收集上清液,混勻所收集上清液。將上清液于12 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集細胞沉淀。用5 mL PBS洗3 次沉淀,每次于12 000 r/min離心5 min后去上清液,收集并混勻沉淀。預處理結束后,根據E.Z.N.A. Soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

1.3.2 PCR擴增

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量;用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V3-V4可變區進行PCR擴增,擴增程序為:95 ℃預變性3 min,27 個循環(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL,4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。

1.3.3 Illumina MiSeq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300文庫。構建文庫步驟:1)連接“Y”字形接頭;2)使用磁珠篩選去除接頭的自連片段;3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集;4)氫氧化鈉變性,產生單鏈DNA片段。再利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序。

1.3.4 酒醅理化指標的測定[13]

水分的測定:恒溫烘干法;酸度的測定:酸堿中和滴定法;淀粉及還原糖的測定:斐林試劑法。

1.4 數據統計分析及圖像處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控,使用FLASH軟件進行拼接。使用UPARSE軟件,根據97%的相似度對序列進行可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋,比對silva123/16s_bacteria數據庫,設置比對閾值為70%。采用Microsoft Office Excel 2016進行數據計算和分析,群落組成圖、Heatmap圖利用R語言進行繪制,物種相關性網絡圖運用Cytoscape軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 α多樣性分析

通過USEARCH將標簽分組成具有97%相似性的OTU。計算Chao指數和ACE指數(以確定物種豐富度)、Shannon指數和Simpson指數(以確定物種多樣性)及檢測到的物種數目,以描述堆積、窖池發酵酒醅樣品中的細菌菌群多樣性,其分析測序指數結果見表1。

表1 樣本細菌群落α多樣性指數Table 1 α Diversity of bacterial samples

97%水平下共得到OTU數為122,堆積發酵結束即窖池發酵開始時OTU數最高,為102。酒醅樣品的Shannon指數和Simpson指數表明,堆積發酵酒醅的細菌多樣性和豐富度明顯高于窖池發酵酒醅。并且在堆積過程中,隨著堆積時間的延長,樣品的細菌多樣性呈現下降趨勢。而在窖池發酵過程中,窖池發酵0 d的豐富度指數和多樣性指數最高,窖池發酵開始后,細菌多樣性和豐富度急劇大幅下降。所有樣品的Coverage指數均大于0.999,說明各采樣酒醅樣品文庫的覆蓋率足夠大,樣品中的序列基本被全部測出,測序結果可體現酒醅樣品細菌群落多樣性的真實情況。

2.2 細菌菌群結構多樣性

2.2.1 基于門水平的細菌菌群結構多樣性分析

圖2 酒醅樣品中的細菌菌群結構（門水平）Fig. 2 Bacterial community structure of fermented grain samples at the phylum level

醬香型白酒1輪次堆積和窖池發酵過程不同樣本序列經RDP classifier軟件進行分類分析,在門水平上,其各樣本的細菌群落結構組成如圖2所示。從醬香型白酒1輪次堆積和窖池發酵酒醅中共檢測到8 個門。從堆積發酵酒醅中檢測到厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌(Cyanobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)8 個門;從窖池發酵酒醅中檢測到除Deinococcus-Thermus外的其他7 個門,而在入窖池發酵后5～35 d中共檢出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes 5 個門(圖2)。

在門水平,堆積發酵優勢細菌(平均相對豐度大于1%)為Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria,其中Firmicutes和Proteobacteria占主導地位(平均相對豐度大于10%),平均相對豐度分別為75.58%和21.53%。窖池發酵酒醅中優勢細菌為Firmicutes和Proteobacteria,Firmicutes占絕對主導地位(平均相對豐度為98.01%);在堆積發酵結束即窖池發酵開始時,Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes平均相對豐度大于1%。窖池發酵開始后,Proteobacteria的相對豐度由12.42%(窖池發酵0 d)急劇下降至0.01%(窖池發酵5 d)以下,直至窖池發酵結束時相對豐度也不超過0.06%;Bacteroidetes則從2.91%下降并一直維持在0.01%以下。從窖池發酵的5～35 d,平均相對豐度大于1%的菌門僅有Firmicutes。黃蘊莉等[10]對相同車間第2輪次堆積和窖池發酵酒醅進行了研究,發現其酒醅樣品中同樣是Firmicutes占絕對主導地位,相對豐度均占92%以上,這與王雪山等[14]報道的白酒發酵過程中由多菌種演替為單一厚壁菌門為主導的典型發酵模式相符,不同的是1輪次堆積發酵過程中Proteobacteria相對豐度(21.53%)占比顯著高于2輪次(小于1%)。

2.2.2 基于屬水平的細菌菌群結構多樣性分析

圖3 酒醅樣品中的細菌菌群結構（屬水平）Fig. 3 Bacterial community structure of fermented grain samples at the genus level

在屬水平上,從醬香型白酒1輪次堆積和窖池發酵酒醅中共檢出71 個屬,圖3為平均相對豐度至少在一個酒醅樣品中大于1%的菌群結構。從堆積和窖池發酵酒醅中分別檢出69 個和63 個屬,堆積發酵結束即窖池發酵開始檢出61 個屬。窖池發酵0～5 d,有47 個屬的相對豐度大幅下降至低于檢出限,Lactobacillus相對豐度從79.42%上升至99.96%,成為主要菌群,從而也導致發酵酒醅酸度升高(從0.65 mmol/10 g上升至1.43 mmol/10 g)。上述47 個菌屬含量大幅下降可能源于發酵環境改變或者Lactobacillus對其生物性抑制所致。窖池發酵5～35 d,新檢出19 個屬,其中梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)和g__unclassified_f__Peptostreptococcaceae 2 個屬在堆積發酵酒醅中未檢出,該兩種菌屬屬于專性厭氧菌[15-16],適宜于厭氧發酵環境。氣球菌屬(Aerococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、嗜熱桿菌(Thermus)、Xylella及3 個未分類菌屬則只出現在堆積發酵中。這8 種菌屬在堆積酒醅樣品中平均相對豐度和占0.13%。

在屬水平,堆積發酵優勢細菌屬有13 個,分別為Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Oceanobacillus、Acinetobacter、Lactococcus和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora),其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主導地位,平均相對豐度分別為35.93%、12.19%和11.63%。近年有報道分析了醬香白酒釀造全輪次及第2輪次發酵酒醅的細菌群落結構[8-10]。本研究結論再次證實了上述研究者的結果:Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Acinetobacter、Lactococcus是醬香白酒第1輪次酒醅堆積發酵的優勢菌屬,同時本研究還新發現Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Oceanobacillus、Saccharopolyspora也是醬香型白酒第1輪次酒醅堆積發酵的優勢細菌屬。醬香型白酒釀造第1輪次和第2輪次發酵酒醅的優勢細菌屬相比,Lactobacillus、Bacillus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Oceanobacillus、Lactococcus是2 個輪次堆積發酵酒醅中共有的優勢細菌屬;而Lactobacillus則在2 個輪次窖池發酵酒醅中均占絕對主導地位。

13 個優勢細菌屬中,Escherichia-Shigella、Thermoactinomyces、Lentibacillus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Pediococcus、Oceanobacillus、Lactococcus和Saccharopolyspora 8 個屬隨發酵時間的延長其豐度總體呈下降趨勢,且在堆積發酵結束時相對豐度小于1%;Bacillus同樣隨著發酵時間延長相對豐度下降,但在堆積發酵結束時其相對豐度大于1%。這些優勢微生物相對豐度下降與發酵過程中營養物質消耗(如淀粉質量分數從DJ 1 d的34.52%下降至DJ 7 d的29.84%)、微生物代謝產物累積導致發酵環境改變(如酸度從DJ 1 d的0.61 mmol/10 g上升至DJ 7 d的0.65 mmol/10 g)和微生物之間的相互作用相關。窖池發酵酒醅中平均相對豐度超過1%的菌屬只有Lactobacillus,平均相對豐度占79.42%,該菌屬在窖池發酵中也占絕對主導地位。窖池發酵開始時(即堆積發酵結束),優勢細菌屬有Lactobacillus、Acinetobacter、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus。窖池發酵開始后,除Lactobacillus相對豐度從79.42%急劇上升至99.96%并維持在99.84%～99.96%之間,其余5 個菌屬相對豐度均從大于1%急劇下降至0.04%以下,發酵窖池的菌群結構由多菌種演替為單一的Lactobacillus為主導,這與戴奕杰等[8]關于隨著醬香型白酒發酵時間的推移,細菌群落形成單一菌類為主導環境的說法相符。Acinetobacter以葡萄糖和其他碳水化合物代謝產酸,為醬香型白酒各輪次堆積酒醅中的優勢細菌菌屬[9]。Acetobacter以乙醇、甘油和乳酸為碳源,能利用正丙醇、正丁醇和D-葡萄糖產酸,但不水解乳糖和淀粉[15],是醬香型大曲[17]和酒醅中常見的微生物[10-11]。Comamonas屬好氧或兼性好氧異養微生物[18-20],革蘭氏陰性桿菌,于1985年由De Vos等[21]發現,具有降解苯酚[22]和木質素[23-24]的功能,在白酒釀造中鮮有報道,2017年由Wang Xueshan等[25]第一次在濃香型白酒中檢出,本研究是第一次在醬香型白酒中發現。Kroppenstedtia屬于高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae),Thermoactinomycetaceae多數在高溫下生長[26],是高溫大曲[27]和醬香型白酒堆積酒醅中的優勢菌[10]。Bacillus是醬香型白酒生產過程中的主要功能菌[6,28]。菌群檢出結果表明,窖池發酵開始后,Lactobacillus含量急劇上升,Acinetobacter、Comamonas、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus含量急劇下降。進入窖池發酵,微生物生態從好氧及兼氧環境轉入厭氧環境,大量厭氧微生物開始代謝產酸等,導致發酵酒醅環境酸度升高,乳酸菌耐酸性好,其含量隨之上升,占絕對優勢地位,并代謝產生大量乳酸,更致使酒醅環境pH值顯著降低,進而抑制其他微生物的生長,同時也通過產生的抑菌素(如Nisin、lactacin、pediocin)抑制革蘭氏陽性細菌的生長繁殖[29]。革蘭氏陽性菌Kroppenstedtia和Bacillus生物量的降低也說明其生態調控機制。Comamonas只在DJ 7 d(FJ 0 d)時相對豐度較大(3.26%),在其余樣品中均小于0.01%,關于此菌,還有待進一步研究。

堆積發酵和窖池發酵是醬香型白酒釀造過程中兩個不同的發酵體系,因發酵場和物態、生態上差異較大,所以兩種發酵體系中的細菌菌群結構會存在明顯的差異。又由于堆積發酵和窖池發酵是一個連續的工藝體系,所以在堆積和窖池整個發酵過程有87.5%的細菌門和85.92%的細菌屬同時出現在兩個階段,這些微生物從堆積發酵遷移到窖池發酵。隨發酵時間延長,發酵環境參數發生改變,微生物的分布也發生了變化,堆積發酵結束即窖池發酵開始是這些共有微生物遷移、發酵的過渡期。

2.3 相關性網絡分析

為進一步研究上述主要微生物之間的相互關系,選取屬水平總豐度前25的物種,并計算物種之間的斯皮爾曼等級相關系數,對其進行物種之間的相關性分析,結果如圖4所示。

圖4 堆積和發酵酒醅樣品中的細菌菌群相關性網絡圖（屬水平）Fig. 4 Correlation network diagram of bacterial communities in fermented grain samples during pile and pit fermentation at the genus level

堆積和窖池發酵酒醅細菌菌群之間的相關性結果(圖4)表明,多數微生物菌屬之間呈顯著正相關調節機制。堆積發酵中有8 個菌屬間呈顯著負相關,54 個菌屬間呈顯著正相關。而窖池發酵中有3 個菌屬間呈顯著負相關,85 個菌屬間呈顯著正相關。這些相互生物學關系構成了發酵過程的基本生物學調控機制,也是發酵過程發酵動力、風味動力形成和調控機制的基本組成。

高相關性節點是指與一定數量的其他微生物均有相關性的一類微生物,也稱為Hub節點[30]。Hubs種類及多少在一定程度上可反映特定環境中微生物菌群結構的穩定性。從堆積發酵酒醅細菌菌群的相關性網絡(圖4A)中發現Lactobacillus一個負相關Hub(這里指至少與其他8 個屬的微生物存在負相關性的節點)。Lactobacillus和Enterococcus、Pediococcus、多孢放線菌屬(Actinopolyspora)、Saccharopolyspora、Streptococcus、Lactococcus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Staphylococcus之間呈顯著負相關性。這8 種菌屬在堆積發酵過程含量全部呈現下降態勢,堆積發酵結束時,相對豐度均小于1%。堆積發酵過程,Lactobacillus含量逐漸上升,從DJ 0 d的7.30%上升到FJ 0 d的79.42%,為堆積發酵的優勢菌屬。Enterococcus、Pediococcus、Actinopolyspora、Lactococcus、Saccharopolyspora、Streptococcus、Staphylococcus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae 8 個菌屬之間兩兩顯著正相關,是網絡圖譜中的正相關Hubs(這里指至少與其他6 個屬的微生物存在正相關性節點)。Escherichia-Shigella、g__unclassified_o__Bacillales、Bacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Lentibacillus 7 個菌屬之間,除Escherichia-Shigella和Bacillus相關性不顯著外,其余全部都兩兩顯著正相關,g__unclassified_o__Bacillales、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Lentibacillus也是網絡圖譜中的正相關Hubs,這5 種菌屬相對豐度含量總體呈下降趨勢。

從窖池發酵酒醅細菌菌群相關性網絡(圖4 B)中發現存在1 4 個正相關H u b s,分別為Bacteroidetes下的穩桿菌屬(Empedobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium)、Myroides、黃桿菌屬(Flavobacterium)、Proteobacteria下的葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、Pseudochrobactrum、普羅威登斯菌屬(Providencia)、Comamonas、Stenotrophomonas、Defluviimonas,Firmicutes下的Lentibacillus、Oceanobacillus,Actinobacteria下的Corynebacterium_1。僅有Lactobacillus和Thermoactinomyces、Pediococcus、Pediococcus和g__unclassified_f__Peptostreptococcaceae之間呈顯著負相關。

在堆積發酵過程,Lactobacillus與8 個正相關Hubs呈現顯著負相關機制,而在窖池發酵過程中,Lactobacillus僅與Thermoactinomyces和Pediococcus顯著負相關,Thermoactinomyces和Pediococcus節點連通性都不是很高,說明在堆積發酵階段Lactobacillus對其他微生物的抑制作用強于窖池發酵階段,且Lactobacillus在窖池發酵過程中含量比堆積發酵過程多,由此可推斷,窖池發酵過程中微生物種類較少,以及除Lactobacillus以外的其他微生物含量很低的主要原因并不在于Lactobacillus對其他微生物的生物學抑制作用,其真正的內在調節機制本課題組正在開展進一步的研究論證。

3 結 論

醬香型白酒1輪次堆積發酵過程細菌的多樣性和豐富度明顯高于窖池酒醅,隨著堆積發酵時間的延長,細菌多樣性呈現下降趨勢;隨著窖池發酵開始,細菌的多樣性和豐富度呈現急劇大幅下降。在門和屬水平上,堆積發酵檢出的總細菌、主要細菌和優勢細菌種類均比窖池發酵同比數據多。從醬香型白酒1輪次堆積和窖池發酵過程一共檢出8 個門,71 個屬。從堆積發酵酒醅中檢出8 個門,69 個屬;從窖池發酵酒醅中檢出7 個門,63 個屬。堆積發酵優勢細菌門為Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria,其中Firmicutes和Proteobacteria占主導地位;優勢細菌屬有Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Oceanobacillus、Acinetobacter、Lactococcus和Saccharopolyspora 13 個,其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主導地位。窖池發酵酒醅中優勢細菌門為Firmicutes和Proteobacteria,Firmicutes占絕對主導地位。窖池發酵優勢細菌屬是Lactobacillus,其占絕對主導地位。

細菌菌群結構相關性調節機制上絕大多數菌屬之間呈顯著正相關性機制,這種機制對堆積和窖池發酵過程穩定的菌群形成具有重要調控作用。堆積發酵過程存在Enterococcus、Pediococcus和Actinopolyspora等13 個正相關Hubs,Lactobacillus 1 個負相關Hub;窖池發酵中存在Empedobacter、Chryseobacterium和鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium)等14 個正相關Hubs。