菠蘿蜜果醋發酵菌種的選育及發酵特性

何宇寧,黃 和,2,*,鐘賽意,劉 海,秦小明

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東 湛江 524088;2.廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心,廣東 湛江 524000)

菠蘿蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.),俗稱大樹菠蘿,屬于桑科、菠蘿蜜屬的常青喬木。菠蘿蜜的果實柔軟可口,香氣撲鼻,是一種珍貴的熱帶水果[1]。研究表明,菠蘿果肉營養豐富,富含碳水化合物、蛋白質、氨基酸、多酚、脂肪酸、維生素和礦物質,可作為一些重要營養物質的良好來源[2-3]。同時,菠蘿蜜具有抗氧化、抗炎、抗菌、防齲、抗腫瘤和降血糖等多種生物活性[4-7]。目前菠蘿蜜種植業面臨的最大問題是其易腐性導致的巨大損失。因此,開發菠蘿蜜新產品,為栽培者創造更高的收益,具有十分重要的現實意義[8]。菠蘿蜜果實含有多種營養物質,其發酵產品也能很好的保存原有的風味和營養成分[9]。

醋酸菌是可將乙醇氧化生成乙酸的一類細菌[10],也是世界釀醋工業的重要微生物[11]。醋酸菌不僅廣泛用于生產乙酸、葡萄糖酸、山梨酸以及合成必要的維生素如VC[12-14],還在生化反應糖類和乙醇氧化的研究中扮演重要角色[15-16]。關于菠蘿蜜果醋發酵醋酸菌的選育研究相對較少,缺乏可參考數據。李文等[17]從獼猴桃中篩選出一株產酸量大和耐乙醇、耐高溫能力強的醋酸菌,可使醋酸產量提升30.54%。陳洋等[18]從醋醅中篩選出菌株FY4,在高乙醇體積分數和高溫狀態下仍保持高產酸率,并成功用于熱帶水果的醋酸發酵。目前菠蘿蜜果醋的研究鮮見報道,同時缺乏菠蘿蜜果醋發酵的專用醋酸菌。

本研究通過菠蘿蜜自然發酵與菌種三級篩選、生理生化鑒定、16S rRNA基因序列分析,篩選出適合菠蘿蜜果醋發酵的醋酸菌;再通過發酵特性實驗,比較選育的菌株與商業菌株As1.41在高乙醇體積分數和高溫條件下的產酸能力。最終選育出菠蘿蜜發酵果醋專用醋酸菌,提高菠蘿蜜果醋產酸量和品質,為菠蘿蜜果醋發酵提供優良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

菠蘿蜜 廣東湛江市麻章區湖光鎮農貿市場;醋酸菌As1.41 中國工業微生物菌種保藏管理中心;安琪葡萄酒高活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司。

葡萄糖、酵母膏、瓊脂 廣東環凱微生物科技有限公司;結晶紫染液、番紅染液、碘液、95%乙醇、無水乙醇、酚酞指示劑、NaOH、CaCO3廣東光華科技股份有限公司;Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒、San Prep柱式DNA膠回收試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;pUm-T載體試劑盒、dNTP 寶生物工程公司;GeneRuler DNA Ladder Mix Marker 賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 培養基

基礎培養基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分數4.0%無水乙醇;碳酸鈣平板分離培養基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,CaCO32.0%、瓊脂1.5%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分數4.0%無水乙醇;斜面保藏培養基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,瓊脂1.5%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分數4.0%無水乙醇;發酵培養基:葡萄糖2.0%,酵母膏1.0%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分數4.0%無水乙醇。

1.2 儀器與設備

SW-CJ凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;722s紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;DYY-5電泳儀 北京六一儀器廠;3-18K高速冷凍離心機德國Sigma公司;2720 Themalcyder聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國應用生物系統公司;AUY120電子天平 日本島津制作所;SPX-250B-2生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;HZQ-F160振蕩培養箱 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菠蘿蜜果醋自然發酵醋醪制備

將新鮮菠蘿蜜果肉洗凈,勻漿后裝入己滅菌500 mL錐形瓶中,用4 層紗布封口,置于實驗室陰暗處,室溫環境(25～30 ℃)自然發酵30 d,每隔5 d在無菌環境下取醋醪樣品待測。

1.3.2 菠蘿蜜果酒發酵液制備

參考張玲等[19]制備菠蘿蜜果酒的方法。選取新鮮菠蘿蜜,取果肉洗凈后切碎,在護色劑中浸泡20 min,取出果肉按料液比1∶1.5(g/mL)加入蒸餾水后勻漿,加入0.1 g/L焦亞硫酸鈉,混勻靜置2 h,加入0.5 g/L果膠酶,在30 ℃酶解3 h。酶解后的菠蘿蜜果漿用蔗糖調節糖度至200 mg/mL,用檸檬酸調節pH值至4.5,100 ℃滅菌7 min。待菠蘿蜜果漿冷卻后,以5%體積分數接入活化酵母菌,28 ℃發酵6 d后,65 ℃巴氏滅菌30 min。

1.3.3 醋酸菌的篩選

1.3.3.1 菌種一級篩選

采用平板涂布分離法,取1 mL醋醪樣品稀釋至10-4～10-6,將稀釋液涂布在碳酸鈣平板分離培養基上,每個稀釋度進行2 個重復實驗,在30 ℃培養箱中培養2～3 d后觀察現象,挑選長勢良好,溶鈣圈大而清晰的單菌落,進行革蘭氏染色鏡檢,篩選出革蘭氏陰性菌。

1.3.3.2 菌種二級篩選

將一級篩選的菌株各取1 環,接種于100 mL基礎培養基中,30 ℃、120 r/min振蕩培養3 d,5 000 r/min離心10 min后取5 mL上清液用0.1 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0,煮沸后加入4～5 滴FeCl3溶液,有紅褐色沉淀生成,表明為產醋酸細菌[20]。

1.3.3.3 菌種三級篩選

將二級篩選的菌株各取1 環,接種于100 mL菠蘿蜜果酒中,30 ℃、120 r/min振蕩培養5 d,對發酵液的香氣進行感官評價。

1.3.4 醋酸菌生理生化實驗

取篩選出的菌株和商業菌株As1.41進行生理生化實驗[21]。

1.3.5 醋酸桿菌的分子生物學鑒定

1.3.5.1 基因組提取

按照Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書要求,提取篩選得到的5 株醋酸桿菌基因組DNA作為模板DNA。

1.3.5.2 PCR擴增

PCR引物:正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’,反向引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’;PCR反應體系:模板DNA 1 μL,正向引物2 μL,反向引物2 μL,dNTP 2 μL,10×緩沖液5 μL,Taq(5 U/μL)0.5 μL,加入雙蒸水調節至50 μL;PCR反應程序: 95 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火25 s,72 ℃延伸50 s,35 個循環。

1.3.5.3 PCR產物檢測

取5 μL PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳,電泳參數:150 V,100 mA,10～20 min,若膠體上形成清晰條帶,則PCR擴增成功。

1.3.5.4 16S rRNA基因片段的測序及分析

委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序工作。利用BLAST程序在NCBI數據庫中進行同源性比對分析,選擇與目標菌株有較高同源性的模式菌株[22],通過MEGA7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.6 醋酸菌發酵性能實驗

1.3.6.1 生長曲線測定

將篩選的醋酸桿菌各挑取1 環接種于100 mL基礎培養基中,30 ℃、120 r/min振蕩培養,每隔6 h用分光光度計在600 nm波長處測吸光度,以商業菌株As1.41為參照。

1.3.6.2 溫度對發酵性能的影響

將篩選的醋酸桿菌活化后分別取1 mL接入100 mL菠蘿蜜果酒發酵液中,乙醇體積分數4.0%,分別在25、28、31、34、37 ℃,120 r/min振蕩培養96 h,測定醋酸桿菌產酸量、生長量、醇酸轉化率,以商業菌株As1.41為參照。

1.3.6.3 乙醇對發酵性能的影響

將篩選的醋酸桿菌活化后分別取1 mL接入100 mL菠蘿蜜果酒發酵液中,乙醇體積分數分別為2%、4%、6%、8%、10%,30 ℃、120 r/min振蕩培養96 h,測定醋酸桿菌產酸量、生長量、醇酸轉化率,以商業菌株As1.41為參照。

1.3.6.4 產酸量測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[23]方法進行測定。

1.3.6.5 醇酸轉化率測定

參考孫一帆等[24]方法,計算公式如下:

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010軟件進行數據處理和表格制作,采用Origin 2017軟件進行數據圖繪制,利用BLAST程序在NCBI數據庫對16S rRNA測序結果進行同源性比對分析。每組實驗重復3 次,取其平均值進行各數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 醋酸菌篩選

2.1.1 一級篩選

由表1可知,經過72 h培養后有14 株菌有較小透明圈,31 株菌周圍都有明顯透明圈(圖1)。對這31 株菌進行革蘭氏染色鏡檢,均為革蘭氏陰性菌(圖2)。

表1 一級篩選結果Table 1 Results of primary screening

圖1 平板培養基上菌落形態圖Fig. 1 Colony morphology on medium plates

圖2 菌株革蘭氏染色鏡檢圖（16×100）Fig. 2 Microscopic observation of bacterial strains after Gram staining (16 × 100)

2.1.2 二級篩選

表2 產酸定性實驗結果Table 2 Evaluation of acid production ability

由表2可知,一級篩選的31 株菌進行產酸定性實驗中,只有15 株菌生成紅褐色沉淀。

2.1.3 三級篩選

表3 發酵液感官評價結果Table 3 Sensory evaluation of fermentation broths

由表3可知,二級篩選的活化醋酸菌經過5 d連續發酵,15 瓶發酵液由于醋酸菌的不同,呈現出不同的氣味,有醋香味、菠蘿蜜果香味、餿臭味等,從中篩選出5 株產醋香和菠蘿蜜果香的醋酸菌用于后續實驗。

2.2 生理生化實驗

表4 菌株的生理生化實驗結果Table 4 Results of physiological and biochemical tests of acetic acid bacteria

根據表4和《伯杰細菌鑒定手冊》[21]的描述,初步判斷篩選出的5 株疑似醋酸菌Aa723、Aa747、Aa844、Aa847和Aa941均屬于醋酸桿菌屬。

2.3 16S rRNA鑒定

圖3 醋酸桿菌16S rRNA的PCR產物電泳圖Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of 16S rRNA genes from selected strains

由圖3可知,5 株醋酸桿菌的PCR擴增產物的片段大小約為1 500 bp,且條帶清澈無彌散,說明PCR擴增成功,可進行下一步的16S rRNA基因片段測序。

圖4 醋酸桿菌的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of acetic acid bacteria

由圖4可知,5 株醋酸桿菌在系統發育樹中屬于4 個不同的種。通過bookstrap檢驗1 000 次支持該進化樹分支可信度,綜合各菌株的生理生化特征和形態學結果,可以確定5 株醋酸桿菌:Aa723和Aa941為巴氏醋酸桿菌(A. pasteurianus),Aa847為法布拉姆醋酸桿菌(A. fabarum),Aa747為熱帶醋酸桿菌(A. tropicalis),Aa844為醋化醋酸桿菌(A. aceti)。其中篩選出的A. fabarum、A. tropicalis、A. aceti均為首次在菠蘿蜜果醋醋醪中分離得到。

2.4 醋酸菌發酵性能實驗

2.4.1 生長曲線測定

由圖5可知,Aa723、Aa847的對數生長期在6～60 h之間,其他菌株的對數生長期為6～48 h。Aa941的生長量最大,OD600nm值達到1.31,其次分別是As1.41、Aa747、Aa844、Aa847和Aa723,說明Aa941在篩選出的5 株菌株中具有較強的適應能力,且與商業菌株As1.41具有相似的生長曲線。菌種在對數期內具有較強的活力和繁殖能力,同時對外界刺激的應激反應較為靈敏[25],因此,選擇48 h為醋酸桿菌種子液培養時間。

圖5 醋酸菌生長曲線Fig. 5 Growth curves of acetic acid bacteria

2.4.2 溫度對發酵性能的影響

圖6 溫度對菌株生長量（A）、產酸量（B）和醇酸轉化率（C）的影響Fig. 6 Effect of temperature on OD600 nm (A), acetic acid production (B)and alcohol-acid transform ratio (C) of strains

種屬不同的醋酸桿菌有不同的最適生長溫度[26]。有研究表明,在一定范圍內,隨著溫度的升高,醋酸桿菌的生長速率和產酸代謝速率呈現先升高后下降的趨勢[27-28]。由圖6可知,在25～37 ℃范圍內,除Aa723外,其他5 株醋酸桿菌的生長量、產酸量和醇酸轉換率隨著溫度先升高后下降。Aa723與Aa941、As1.41分別在25、31 ℃時具有最高的生長量和產酸量,Aa723、Aa747在28 ℃時有最高醇酸轉換率。在25～31 ℃范圍內,Aa847、Aa941和As1.41的醇酸轉換率變化較小,Aa844的生長量和產酸量波動較小,相比較而言,Aa723和Aa747的在該溫度范圍內敏感性較強。Aa941在31、34、37 ℃時的產酸量均為各醋酸桿菌中最高,分別達到38.70、35.78、19.79 g/L;在37 ℃時,6 個菌株均能保持一定的產酸量,但只有Aa941和As1.41的OD600nm值能達到0.650以上,且能維持較高的醇酸轉換率,分別達到65.10%和63.10%。

對比國內外相關研究,李文等[17]從獼猴桃中篩選出一株耐高溫醋酸桿菌WT08(A. pasteurianus),在36 ℃培養72 h,產酸量為10.65 g/L,相同發酵時間,本研究篩選的醋酸桿菌Aa941在37 ℃產酸量為19.79 g/L,明顯優于WT08。

2.4.3 乙醇體積分數對發酵性能的影響

圖7 乙醇體積分數對菌株生長量（A）、產酸量（B）和醇酸轉化率（C）的影響Fig. 7 Effect of ethanol concentration on OD600 nm (A), acetic acid production (B) and alcohol-acid transform ratio (C) of strains

乙醇既是醋酸菌生長的能量來源,也是醋酸發酵的底物[29],但高體積分數乙醇將嚴重抑制醋酸菌的生長和代謝速率[30]。由圖7可知,隨著乙醇體積分數的上升,各醋酸桿菌的生長量基本呈現下降的趨勢,產酸量和醇酸轉換率呈先上升后下降趨勢;各醋酸桿菌在乙醇體積分數為2%時OD600nm值最大,均高于0.950;在乙醇體積分數為4%時產酸量最高,說明低體積分數的乙醇不利于醋酸桿菌的產酸代謝。當乙醇體積分數大于8%時,6 株菌的生長值、產酸量和醇酸轉換率均受到不同程度的抑制,其中Aa844受到的抑制最為嚴重,OD600nm值和產酸量分別低于0.400 g/L和10.00 g/L,只有Aa941和As1.41的生長雖受抑制,但依然保持著較高的產酸量和醇酸轉換率。在6 株醋酸菌中,當乙醇體積分數為4%,Aa941的產酸量最大,達到36.50 g/L;乙醇體積分數為6%、8%時,Aa941的產酸量和醇酸轉換率均大于其他5 株醋酸菌,分別為30.15 g/L、74.85%和25.11 g/L、74.10%。

對比國內相關研究,張志燕等[31]在香醋醋醅中篩選出優勢醋酸菌D-3-4,在乙醇體積分數為5%～11%時,產酸量隨著乙醇體積分數上升而下降,產酸量在11%時受到較嚴重抑制,與本研究結果基本一致。李大為等[32]從自然發酵的蘋果醋中分離出一株高耐受性醋酸桿菌B103(A. pasteurianus),產酸量為35.6 g/L,耐受乙醇體積分數為7%,本研究篩選出的醋酸菌Aa941(A. pasteurianus)其乙醇體積分數耐受性和產酸量均高于B103。

3 結 論

本研究通過富集培養、生理生化實驗驗和16S rRNA分子生物學鑒定的方法,對自然發酵的菠蘿蜜果醋醋醪中醋酸菌進行發酵特性研究。結果表明,從菠蘿蜜果醋醋醪中分離鑒定出5 株醋酸桿菌,分別為Aa723和Aa941(A. pasteurianus)、Aa847(A. fabarum)、Aa747(A. tropicalis)以及Aa844(A. aceti),其中不同醋酸桿菌對溫度和乙醇體積分數的耐受性具有顯著性差異。菌株Aa941發酵性能最佳,31 ℃連續發酵96 h,在乙醇體積分數為4%時產酸量最大,達到38.70 g/L;乙醇體積分數為6%時,30 ℃發酵96 h醇酸轉化率達到最高,為74.85%。Aa941在8%高乙醇體積分數條件下,30 ℃發酵96 h產酸量和醇酸轉換率分別為25.11 g/L和74.10%;在37 ℃高溫下生長良好,乙醇體積分數4%發酵96 h產酸量和醇酸轉換率分別為19.79 g/L和65.10%,其耐乙醇和耐高溫性能優于商業菌種As1.41。醋酸桿菌Aa941能將菠蘿蜜果酒發酵成具有菠蘿蜜特征香氣的果醋,可作為菠蘿蜜果醋發酵的菌種,進一步豐富了果醋發酵所需的菌種資源。