庫車小白杏內生細菌多樣性及其產酶特性

劉曉靜,楚 敏,朱 靜,顧美英,唐琦勇,孫 建,朱 璇,*,張志東,,*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆農業科學院微生物應用研究所,新疆特殊環境微生物實驗室,新疆 烏魯木齊 830091)

植物內生菌泛指生活在植物組織內,暫時不引起宿主出現明顯病害癥狀的微生物,包括表面生活的腐生微生物和潛伏性病原微生物[1]。現有研究表明,所有植物中均存在豐富的內生菌,但人類僅研究了其中很小的一部分,絕大多數還處于未知狀態[2]。對眾多瓜果實內生菌的研究表明,其內生菌數量、種群等易受宿主種類、生長階段及環境的影響[3-5]。同時,隨著宿主生長階段的變化,及其中纖維素酶、蛋白酶和幾丁質酶等相關物質的變化,有些在前期無害的內生菌可能會引起宿主的病害[6]。因此,研究植物內生菌不僅對進一步研究微生物的環境適應性、群落演替和微生物資源挖掘有重要研究價值,也對果蔬貯藏保鮮、防病治病有著重要應用價值。

庫車小白杏因盛產于新疆阿克蘇地區庫車縣而得名,是新疆的特色水果之一。其鮮果成熟期集中,貯存期短,易腐敗變質。目前普遍認為,小白杏的腐敗變質除了與其采后理化過程相關外,主要與真菌侵染有關,但國內外對細菌在其中發揮的潛在作用鮮有研究。前期研究發現,隨著庫車小白杏采后成熟度的增加,其菌群組成結構存在明顯的更替。高通量測序結果進一步證明了,小白杏內生細菌中存在一些與植物軟腐相關的病原菌,可能與庫車小白杏采后的軟化腐敗有關,如泛菌屬類菌群隨著成熟的推進,其所占比例增加了近416 倍,葡糖桿菌屬類菌群則增加了約17.5 倍[7]。因此,解析庫車小白杏內生細菌群落組成并篩選相關內生細菌,為揭示和驗證庫車小白杏采后腐敗變質的內在機理提供了科學依據。

本研究采用高通量測序法結合傳統分離培養法,對庫車小白杏內生細菌群落結構組成進行分析,并對其產蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶特性進行研究,旨在揭示庫車小白杏果實可培養微生物群落多樣性,同時,從活性酶產生菌的角度解析其與果實軟腐的潛在關系,為進一步開發庫車小白杏的貯藏保鮮方法、挖掘相關活性物質等研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

庫車小白杏于2018年6月采自庫車縣烏恰鎮小白杏果園中,根據成熟等級,選擇果實自然成熟,無機械傷痕,無病變,且表皮有光澤,顏色、大小、硬度等表觀一致的小白杏(約(2.0～2.5)cm×(2.5～3.0)cm),經發泡網包裹裝筐后,12 h內運回實驗研究室,于4 ℃貯藏,并在48 h內盡快開展相關表面消毒和分離篩選等工作。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA):200 g馬鈴薯去皮切塊后煮30 min,過濾后加入葡萄糖20 g,瓊脂18 g,pH 7.0左右;察式培養基:硝酸鈉3 g、氯化鉀0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、七水硫酸鎂0.5 g、蔗糖30 g、瓊脂17 g,pH 6.0左右;種子瓊脂培養基:葡萄糖20 g、酵母粉5 g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂15 g、乙醇15 mL、瓊脂18 g,pH 6.5左右;蛋白酶篩選培養基:營養瓊脂(nutrient agar,NA)培養基中加入脫脂牛奶20 g;脂肪酶篩選培養基:NA培養基中加入75 mL三丁酸甘油酯乳化液(15 mL三丁酸甘油酯加入60 mL 2%聚乙烯醇溶液,加熱,160 Hz超聲10 min,間隔2 s);纖維素酶篩選培養基:NA培養基中加入羧甲基纖維素鈉2 g;果膠酶篩選培養基:酵母粉5 g、CaCl2·2H2O 0.5 g、聚果膠酸鈉10 g、2% NaOH 9 mL、溴百里酚藍0.2%溶液12.5 mL,瓊脂8 g,121 ℃高壓滅菌不超過15 min;胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(tryptic soy agar,TSA)、高氏一號培養基、R2A培養基、完全培養基、NA培養基、LB培養基 青島高科園海博生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的表面消毒

庫車小白杏經自來水流水沖洗10 min,無菌濾紙吸干水分,75%乙醇溶液處理5 min,經無菌水洗滌,3%H2O2溶液浸泡3 min,再用無菌水沖洗3～4 次,最后一次無菌水洗滌液經涂板檢測無菌后,備用。

1.3.2 總DNA的提取

經表面消毒的庫車小白杏,采用十六烷基三甲基溴化銨(etyltrimethylammonium-ammonium bromide,CTAB)法[8]對樣本的基因組DNA進行大量提取,設置3 個重復,經凝膠電泳檢測DNA濃度及純度合格后,作為聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增模板使用。

1.3.3 16S r DNA序列V57可變區的PCR擴增

以前述內生菌D N A為模板,采用引物為799 F(AACMGGATTAGATACCCKG)和1 193 R(ACGTCATCCCCACCTTCC)[9],擴增16S rRNA基因序列的V5-V7可變區。PCR條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 個循環;72 ℃延伸10 min。擴增PCR產物經電泳檢測切膠回收,并調節檢測濃度一致,樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行高通量測序。

1.3.4 數據預處理

所得的測序數據經去除冗余和無效序列后,對有效序列Tags聚類,以同源性大于97%聚為一個操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),作為一個假定的分類單元。選取代表性序列,通過RDP classifier軟件進行物種分類,確定OTU之間的分類地位。

1.3.5 菌株的分離及純化

梯度稀釋法:樣品經表面消毒后,無菌條件下去核并分別稱取200 g果肉,進行勻漿。將組織懸液按10-1、10-2、10-3梯度稀釋至10-5,取0.1 mL組織懸液將其分別涂布在實驗所需的各類培養基上,每個梯度設置3 個重復,于28 ℃條件下進行培養。每間隔24 h觀察一次培養皿的變化情況。

組織切塊法:選擇10 顆經表面消毒的果實,無菌條件下使用刀片將果實由外向內進行1 cm×1 cm的切塊,并將切塊平均切成3 段,將靠近杏核的一段放至于實驗所需的各類培養基上進行培養,每顆杏果設置3 個重復,于28 ℃條件下進行培養。每間隔24 h觀察一次培養皿的變化情況。

待培養基長出菌落,于無菌條件下挑取不同形態的單菌落植于新培養基上再次進行培養。不斷重復此操作,直至得到形態單一的菌落為止。

1.3.6 菌株的分子鑒定

采用菌落克隆方法,利用細菌16S rRNA基因通用引物27 F和1 492 R進行PCR擴增[10]。條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30 個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經切膠純化回收后,送往北京鼎國生物技術有限公司進行測序。

所測得的序列與EzTaxon數據庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/ identify)進行比對,并調取相似性最高模式菌株序列,使用MEGA 5.0進行ClustalX多重比對,使用Neighbor-Joining法構建系統發育樹,自舉值為1 000,初步確定菌株的生物學分類地位。

1.3.7 菌株產酶特性的測定

將純化好的菌株接至待測培養基上進行測定,于28 ℃條件下進行培養。果膠酶篩選可通過觀察菌落周圍的培養基是否有下凹,若存在該現象則為陽性。蛋白酶、脂肪酶篩選可直接通過觀察菌落周圍是否存在透明圈;纖維素酶篩選需用剛果紅染色后觀察菌落周圍是否有透明圈;淀粉酶篩選需用0.1%的碘液染色,在5 min之內觀察菌落周圍是否有透明圈。以上培養基若存在透明圈則為陽性,根據透明圈直徑與菌落的直徑比值的比較各菌株產酶能力的強弱[11]。

1.4 數據處理

群落組成分析、多樣性分析、功能酶活性分析及相關的方差分析等工作采用DPS v9.50、Origin 8.0 Excel 2003等軟件進行。

2 結果與分析

2.1 高通量測序法分析內生細菌群落組成

通過對各樣品內生細菌的16S rDNA V57區測序,總計測得原始序列113 448 條,過濾掉低質量序列后,總數為106 202 條。所得序列經聚類比對,以相似度低于97%聚類為1 個OTU,并去除植物體內的線粒體、葉綠體相關序列后,共獲得406 個OTU,涉及9 個門,16 個綱,44 個目,99 個科,94 個屬。其中,在門水平上,以變形桿菌門和厚壁菌門為優勢菌群。在種群多樣性方面,以假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)種群最為多樣(圖1)。其中,未分類菌群(unclassified)為絕對優勢菌群,約占總菌群OTU數量的17.73%。其次為擬桿菌屬(Bacteroides)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、馬賽菌屬(Massilia)、勞特氏菌屬(Blautia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和蟑螂桿狀體科未分類屬(unclassified Blattabacteriaceae)。

圖1 主要菌屬OTU所占比例Fig. 1 Proportion of OTU in major genera

2.2 小白杏果實內生細菌的分離

經不同分離培養基培養3～15 d后,根據菌落形態觀察,共挑取各類菌株235 株。通過共同接種至NA培養基中,觀察菌落形態和顯微形態去重后,獲得實驗菌株99 株。其中,采用R2A培養基共分離獲得菌株8 株,而常規分離培養基分離到菌株91 株,其占絕大多數。不同培養基來源菌株統計數情況如表1所示。

表1 主要菌屬OTU所占比例Table 1 Proportion of OTU in major genera cultured with different media

2.3 內生細菌多樣性分析

上述99 株菌的16S rRNA基因序列經PCR擴增和測序后,運用EzTaxon數據庫(http://www.ezbiocloud.net/identify)進行相似度比較。結果表明,在門水平中(圖2),厚壁菌門(Firmicutes)為所得庫車小白杏內生細菌的主要菌門,約占總菌數的40%;其次為放線菌門(Actinobacteria),約占總菌數的32%;變形桿菌門(Proteobacteria)約占總菌數的26%,擬桿菌門(Bacteroidetes)僅占總菌數2%。與高通量測序結果相比較,庫車小白杏共涉及8 個門,變形桿菌門為庫車小白杏可培養細菌的主要菌門,約占總菌群的74%,其次為擬桿菌門和厚壁菌門分別約占總菌群的17%、8%;而放線菌門(Actinobacteria)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、梭桿菌門(Fusobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)和未分類菌群的所占比例均低于2%。

圖2 門水平上主要的小白杏內生細菌群落組成Fig. 2 Composition of endophytic bacterial communities in Kuqa apricots at phylum level

同時,分別調取各菌株相似性最高模式菌株序列構建系統進化發育樹(圖3～5),確定庫車小白杏可培養細菌種類較為豐富,所得99 株菌分別屬于4 個門28 個屬。其中,變形菌門所含種屬最為豐富,共涉及11 個屬,如圖3所示,分別為產卟啉桿菌屬(Porphyrobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、斯塔普氏菌屬(Stappia)和黃桿菌屬(Flavobacterium)。而擬桿菌門涉及種屬最少,僅包含類香味菌屬(Myroides)。

圖3 基于變形桿菌門和擬桿菌門代表菌株的16S rRNA基因序列構建的系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of isolates in the phyla Proteobacteria and Bacteroides as well as related species based on 16S rRNA gene sequences

厚壁菌門(圖4)和放線菌門(圖5)各包含8 個屬。在厚壁菌門中,分別包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、動性球菌屬(Planococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、果糖桿菌屬(Fructobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)。放線菌門中,分別為:鏈霉菌屬(Streptomyces)、類諾卡氏屬(Nocardioides)、迪茨氏屬(Dietzia)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)、考克氏菌屬(Kocuria)、節桿菌屬(Arthrobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)。

此外,研究發現,與高通量V 5 7區間的測序結果相比,通過分離培養法所得的果糖桿菌屬(Fructobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、節桿菌屬(A r t h r o b a c t e r)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)、歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)和類香味菌屬(Myroides)在本次高通量測序結果中卻未檢出。

圖4 基于厚壁菌門代表菌株的16S rRNA基因序列構建的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of isolates in the phylum Firmicutes as well as related species based on their 16S rRNA gene sequences

圖5 基于放線菌門代表菌株的16S rRNA基因序列構建的系統進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of isolates in the phylum Actinobacteria as well as related species based on their 16S rRNA gene sequences

2.4 小白杏果實潛在新種的發現

在完成測序的99 個菌株中,5 株菌與己知模式菌株序列相似性均小于98.5%(表2),初步確定為潛在新種,共涉及節桿菌屬(Arthrobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的5 個種。其中,類芽孢桿菌屬的潛在新種最多,菌株x506與最近模式菌Flavobacterium acidificum相似性最低,僅為96.98%。該結果初步表明了庫車小白杏果實中存在微生物潛在新類群(物種)資源,具體物種有待進一步挖掘。上述菌株的最終分類地位,有待進一步的細菌多相系統分類鑒定結果證明。

表2 基于16S rRNA基因序列比對結果的潛在新種Table 2 Potential novel species based on 16S rRNA gene sequence analysis

2.5 小白杏果實內生細菌產酶特性分析

表3 部分菌株產功能酶特性Table 3 Some strains with functional enzyme activities

通過平板透明圈法或顯色圈法對所得菌株的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶產生能力進行了分析(表3)。結果表明,具有淀粉酶活性的代表菌株數量最多,其次為產果膠酶、蛋白酶、纖維素酶類菌株,而具有脂肪酶活性的菌株的數量最少。其中,69 株菌均具有較強的淀粉酶活性;35 株菌具有果膠酶活性,70%的菌株活性較強;31 株菌具有蛋白酶活性,78%的菌株活性較強;23 株菌具有較強的纖維素酶活性,83%的菌株活性較強;具有脂肪酶活性的菌株較少,僅為12 株,67%的菌株活性較強。同時,研究發現,59 株菌具有2 種或以上的功能酶產生能力。

以上結果說明,庫車小白杏果實中的內生菌種類多樣,且存在大量具有豐富功能酶產生菌。

3 討 論

內生細菌種類繁多,分布廣泛,且能通過多種途徑參與植物的代謝、發育和成熟,是寶貴的微生物資源,也是天然活性物質的重要來源,但在現有條件下絕大多數還不能被培養出來[12]。隨著高通量測序技術的發展,由于其方便、快捷、高效和低運行成本等突出優勢,充分彌補了傳統分離培養法的不足,更為全面地展現了環境生態微生物的組成和分布,己成為環境微生物研究的重要手段[13]。然而,2012年法國的Didier Raoult團隊首次提出了“微生物培養組學”的概念,并通過“微生物培養組學”獲得了大量此前高通量測序結果中未發現的微生物,有效的糾正了相關實驗偏差[14-16]。2015年,Forster等[17]利用高通量測序法結合微生物潛在培養表型等多手段,分離獲得了大量“不可培養”腸道微生物;此外,相關研究也通過該法獲得了40多個潛在新種,20 多個潛在新屬,2 個潛在新科,展現了出了微生物培養組學的強大優勢[18-19]。因此,開展高通量測序和有效的微生物培養分離,可更為全面地獲得樣本的群落組成。

本研究以庫車小白杏為研究對象,利用高通量測序法結合傳統分離培養法,對庫車小白杏內生細菌群落結構組成進行分析。高通量測序結果顯示,庫車小白杏采后內生細菌共包括406 個OTU,涉及9 個門,94 個屬。在種群多樣性方面,未分類菌群OTU所占比例最高,占總菌群OTU的17.27%,其次為擬桿菌屬(Bacteroides)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等類群。通過可培養篩選共獲得99 株菌,歸類為4 個門28 個屬,研究還獲得了一批潛在的微生物新種,共涉及節桿菌屬(Arthrobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的5 個種,其中類芽孢桿菌屬的潛在新種最多。雖然,在實驗室條件下培養的微生物僅是其中一小部分,絕大多數內生細菌都難以在現有培養技術和條件下進行繁殖和生長,但本實驗通過可培養法獲得一批未在高通量測序結果中檢出的類群,分別為果糖桿菌屬(Fructobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、節桿菌屬(Arthrobacter)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)、歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)和類香味菌屬(Myroides)。表明了庫車小白杏果實中存在著寶貴的微生物資源,有待進一步分析和挖掘。

研究進一步對所得菌株的產蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等能力進行研究,為進一步揭示活性酶產生菌與果實軟腐的潛在關系提供了科學材料。結果顯示,實驗獲得的菌株中存在著豐富多樣的功能酶產生菌。具有淀粉酶活性的代表菌株的數量占絕大多數,其次為果膠酶、蛋白酶、纖維素酶類菌株,而具有脂肪酶活性的菌株的數量最少。其中,69 株菌具有較強的淀粉酶活性,35 株菌具有果膠酶活性,23 株菌具有較強的纖維素酶活性,12 株菌具有脂肪酶活性,且59 株菌具有2 種或以上的功能酶產生能力。一般認為,相關酶系的作用,在果實成熟和軟化中起著重要的作用。其中,淀粉在未成熟果實中的含量較多,隨著果實的成熟,其在酶的作用下其可轉化為糖,以葡萄糖和蔗糖為主。而葡萄糖可被大部分微生物所利用,且與真菌相比,細菌生長繁殖的速度較快[20-22];同時,果膠酶、纖維素酶等活性增強能夠引起小白杏果硬度的下降,是小白杏果實軟化的重要標志[23-25]。盡管目前仍無法證明,內生細菌在庫車小白杏成熟過程中代謝產酶的情況,但大量能產生相關酶的菌株存在,可推斷內生細菌可通過利用杏果中的營養物質大量生長和繁殖,同時部分內生細菌可通過產生淀粉酶、果膠酶、蛋白酶、纖維素酶等,推進果實的成熟,加快果實軟化的速度,這可能是造成小白杏先出現水漬狀病斑,后發生腐爛的重要因素。

同時,前期高通量測序結果顯示,青熟期和完熟期的庫車小白杏中均存在與植物軟腐相關的病原菌,如葡糖桿菌屬、泛菌屬、歐氏菌屬和布倫納氏屬等菌群,且隨著小白杏的成熟,其所占比例呈倍數增長,最高可增加416 倍。而本實驗通過可培養篩選法,進一步驗證了庫車小白杏中存在葡糖桿菌屬、泛菌屬、果糖桿菌屬、明串珠菌屬、歐文氏菌屬等與果實軟腐相關的菌株,與前期研究結果一致。相關研究己證實,葡糖桿菌屬是引起柑橘、草莓腐爛和霉變的主要細菌[26-28];泛菌屬和布倫納氏屬的部分菌株可導致番茄[29-30]、玉米[31]、草莓[32]等的軟腐病;歐氏菌屬是引發丹尼斯鳳梨、大白菜等軟腐病的重要因素[33-34]。因此,以上與軟腐相關菌群的大量繁殖能否引起其他品種杏的軟腐變質,相關驗證工作己開展。

本實驗結果不僅揭示了庫車小白杏內生細菌群落豐富的結構組成及多樣性,證實了杏果中存在大量具有豐富功能的微生物資源;也從內生細菌角度,為小白杏采后腐敗變質內在機理提供了科學依據,為其貯藏保鮮提供了新思路。