不同釀酒葡萄果實類黃酮及香氣物質差異分析

胡 麗,彭文婷,盧浩成,王 軍

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,葡萄與葡萄酒研究中心,農業農村部葡萄酒加工重點實驗室,北京 100083)

決定釀酒葡萄果實品質的因素很多,主要包括糖、酸、單寧、酚類以及香氣物質的含量和組成等[1-2]。酚類物質主要存在于葡萄種子和葡萄果皮中,是一類非常重要的次生代謝產物,可賦予葡萄果實和葡萄酒以不同的風味。酚類物質不僅可以幫助植物抵御強烈紫外線照射、抵抗一些病原菌和害蟲的傷害,還因其含有的羥基和不飽和雙鍵易被氧化而具有良好的抗氧化性[3]。根據代謝路徑的不同,葡萄果實的酚類物質可分為主要在果肉中積累的非類黃酮化合物和主要在外果皮、種子和莖中積累的類黃酮化合物。類黃酮化合物是自然界中分布較廣的酚類物質,主要包括花色苷、黃酮醇和黃烷-3-醇等。

花色苷是由具有C6—C3—C6骨架的類黃酮花色素和糖配體組成[4],是糖基化的花色素,葡萄糖與花色素通過糖苷鍵結合可以形成穩定的花色苷,而葡萄糖又可以進一步通過酯化、乙酰化、香豆酰化或者咖啡酰化被取代,如此形成的各類花色苷在不同的pH值條件下會呈現不同的色調,這對葡萄酒的顏色起著至關重要的作用[5]。黃酮醇是一種多以糖苷形式存在于葡萄果實中的類黃酮物質,且主要存在于果皮中,具有防護紫外線損傷、輔色素化、清除自由基和促進花粉管伸長等生理功能[6];在紅葡萄酒中,黃酮醇中的輔色素分子如楊梅苷和槲皮素等可以與單體花色苷相互作用生成穩定的復合物使紅葡萄酒顏色更加穩定[7]。黃烷-3-醇是葡萄果實中含量最多的類黃酮化合物,主要存在于葡萄的皮和種子中。黃烷-3-醇類物質不僅賦予葡萄酒以苦味和澀味,還對葡萄酒的陳釀潛力有一定影響。

葡萄和葡萄酒中的香氣物質種類豐富,主要包括醇類、酯類、醛類、酸類、萜烯類、降異戊二烯類和甲氧基吡嗪類,這些化合物的含量差異很大,有的質量濃度能達到mg/L級,有的僅痕量ng/L級,有的甚至檢測不到[8]。根據存在形式可將這些化合物分為游離態和糖苷結合態2 種形式,游離態香氣物質具有揮發性,而糖苷結合態香氣物質本身不具有揮發性,但可在酶解或酸解的作用下轉變為具有揮發性的、游離態的香氣物質,因而糖苷結合態香氣物質是一種重要的、潛在的香氣成分[9]。揮發性香氣物質是葡萄中重要的風味物質,這些物質的種類、含量、感官閾值及其之間的相互作用不僅決定葡萄果實的風味,還決定葡萄酒的風味和典型性[2]。

葡萄果實的酚類物質含量以及揮發性香氣成分因種群、品種、產地、栽培等不同而具有較大差異,邢婷婷等[10]對14 個歐亞種紅色釀酒葡萄品種(品系)的花色苷組成和含量進行了分析,得出不同品種單體花色苷所占比例有明顯差異,花色苷可作為化學指紋區分這14 個葡萄品種(品系);張娟等[11]對采自黃土高原產區的20 種釀酒紅葡萄品種中的酚類物質進行了差異分析,表明根據不同葡萄酚類物質的特性,可有選擇性的進行葡萄選育工作;涂正順等[12]對吉林地區的山葡萄果實香氣成分進行氣相色譜-質譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)聯用技術分析,結果表明‘雙優’、‘雙紅’、‘左優紅’果實中分別含有45、47、48 種香氣物質。類似上述的研究在國內有較多報道[13-15],但其中有關歐亞種葡萄和山葡萄果實類黃酮及香氣物質含量和組成的差異比較研究較少。因此,本研究以7 個遺傳背景不同的成熟葡萄果實為材料,供試材料分別為歐亞種葡萄‘赤霞珠’(無性系338和685)和‘寶石解百納’,山葡萄品種‘雙紅’、‘雙優’和‘雙豐’,以及山歐雜種葡萄品種‘北冰紅’,利用高效液相色譜-質譜(high performance liquid chromatographymass spectrometry,HPLC-MS)聯用和GC-MS聯用技術檢測葡萄果實中的類黃酮和香氣物質,比較釀酒葡萄不同品種(品系)果實類黃酮及香氣物質含量和組成的差異,為后續的品種鑒定和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實驗于2018年在北京市海淀區中國農業大學上莊實驗站(40°08′12.15″N,116°10′44.83″E)進行,供試葡萄品種(品系)信息如表1所示。南北行向,栽植密度為2.5 m×1.2 m,葉幕形為改良的垂直葉幕形[16],葉幕高度120 cm左右,寬度70 cm左右,留梢量為12～15 支每延長米(行),葡萄園灌溉方式為滴灌,葡萄園管理采用常規管理。

葡萄果實于成熟期(2018/8/21—9/26)采集。采樣時選擇葉幕兩側,果穗的曝光和背光兩面,隨機采集果穗底部、中部和頂部無物理性損傷、發育健康的果實,每次重復采集約300 粒漿果,重復3 次。采集樣品裝入冰盒運回實驗室,取50～100 粒漿果進行理化指標分析,其余漿果用液氮速凍后保存于-40 ℃冰箱中,用于類黃酮物質及香氣化合物的測定與分析。

表1 供試葡萄品種（品系）信息Table 1 Information about different grape varieties (clones)investigated in this study

1.1.2 試劑

乙酸鈉、甲醇、二氯甲烷、丙酮(均為分析純)北京化工廠;類黃酮標準品:二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、兒茶素(catechin,C)、表兒茶素(epicatechin,EC)、表棓兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷 美國Sigma公司;乙腈、甲酸、甲醇(均為色譜純) 美國Fisher公司;AR2000糖苷酶 法國DSM公司。

1.2 儀器與設備

FD-1C-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;Micro 17R離心機 美國賽默飛世爾公司;1100系列LC/MSD Trap-VL HPLC-離子阱質譜聯用儀(配有二極管陣列檢測器)、1200系列LC/MSD Trap-VL HPLC-三重四極桿質譜聯用儀、1200系列HPLC串聯Bruker系列離子阱質譜聯用儀(配有可變波長檢測器)、6890-5975GCMS儀 美國Agilent公司;Cleanert PEP-SPE固相萃取柱(150 mg/6 mL) 美國Bonna-Agela科技公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果皮花色苷的提取和測定

參照Downey等[17]的方法。準確稱取0.100 g葡萄果皮凍干粉于2 mL離心管中,加入50%甲醇溶液1 mL,低溫避光超聲萃取20 min后,4 ℃、8 000 r/min離心15 min,隨后轉移上清液于新的離心管中,殘渣重復上述步驟,合并2 次提取的上清液,充分混勻后,用0.22 μm有機膜過濾,用于HPLC-MS檢測,每個樣品重復進樣2 次。花色苷的定性根據中國農業大學葡萄酒研究中心建立的葡萄與葡萄酒花色苷指紋譜庫[18],花色苷定量用外標法,以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為外標物做標準曲線,檢測出各類花色苷類物質均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計。標準曲線:y＝59.221x+16.112 8,相關系數為0.998 9。果皮中的花色苷含量以果實鮮質量表示,單位為mg/kg。

HPLC-MS條件:花色苷定性和定量分析使用1100系列HPLC-離子阱質譜聯用儀,色譜柱為Kromasil100-5-C18(250 mm×4.6 mm),柱溫50 ℃,進樣量30 μL,檢測波長525 nm,流速1 mL/min。流動相A:水-甲酸-乙腈(92∶2∶6,V/V);流動相B:水-甲酸-乙腈(44∶2∶54,V/V)。洗脫程序:0～1 min,100%～90% A,0%～10% B;1～18 min,90%～75% A,10%～25% B;18～20 min,75% A,25% B;20～30 min,75%～60% A,25%～40% B;30～35 min,60%～30% A,4 0%～7 0% B;3 5～4 0 m i n,3 0%～0% A,7 0%～1 0 0% B。離子阱質譜檢測器的采集參數為電噴霧離子源,正離子模式,離子掃描范圍為100～1 500 m/z,霧化器壓力為30 psi,干燥器流速為10 L/min,干燥氣溫度為325 ℃。

1.3.2 葡萄果皮黃酮醇的提取和測定

參照1.3.1節花色苷的提取方法,提取后的上清液用0.22 μm有機膜過濾,用于HPLC-MS檢測,每個樣品重復進樣2 次。黃酮醇物質定性方法參照參考文獻[19],黃酮醇定量用外標法,以槲皮素-3-O-葡萄糖苷為外標物做標準曲線,檢測出的黃酮醇類物質均以槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量計。標準曲線:y＝59.029x-42.801,相關系數為0.997。果皮中的黃酮醇含量以果實鮮質量表示,單位為mg/kg。

HPLC-MS條件:黃酮醇定性和定量分析使用1200系列HPLC串聯Bruker系列的離子阱質譜聯用儀,色譜柱為ZorbaxEclipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm)。柱溫40℃,進樣量50 μL,檢測波長360 nm,流速0.63 mL/min。流動相A:水-甲酸-乙腈(86.5∶8.5∶5,V/V);流動相B:甲酸-水-乙腈-甲醇(8.5∶21.5∶25∶45,V/V)。洗脫程序:0～24.2 min,100%～85.8% A,0%～14.2% B;24.2～27 min,85.8%～84.3% A,14.2%～15.7% B;27～33.4 min,84.3%～81.2% A,15.7%～18.8% B;33.4～39 min,81.2%～76.5% A,18.8%～23.5% B;39～45 min,76.5%～74% A,23.5%～26% B;45～47 min,74%～72.6% A,26%～27.4% B;47～51.6 min,72.6%～68% A,27.4%～32% B;51.6～61.8 min,68%～60% A,32%～40% B;61.8～67.8 min,60%～0% A,40%～100% B;67.8～78.4 min,0%～100% A,100%～0% B。離子阱質譜采用電噴霧離子源,負離子模式,離子掃描范圍為m/z 0～1 000,霧化氣壓力為30 psi,干燥氣流速為10 L/min,干燥氣溫度為325 ℃。

1.3.3 葡萄果皮和種子黃烷-3-醇的提取和測定[20]

游離黃烷-3-醇提取:準確稱取0.050 g葡萄果皮/種子凍干粉于2 mL的離心管中,加入含0.5%抗壞血酸的70%丙酮溶液500 μL,充分振蕩5 min后,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,取上清液轉移至新的5 mL離心管中,重復上述操作3 次,將3 次所得上清液合并后搖勻。再取400 μL上述提取液于2 mL離心管中,在常溫避光條件下進行氮吹。吹干后加入200 μL含1% HCl的甲醇溶液溶解,再加入200 μL的200 mmol/L乙酸鈉溶液中和,將溶解后的溶液經0.22 μm有機膜過濾,用于HPLC-MS檢測,每個樣品重復進樣2 次。

裂解黃烷-3-醇提取:準確稱取0.100 g果皮/種子凍干粉于2 mL的離心管中,加入間苯三酚緩沖液(0.5%抗壞血酸,0.3 mol/L鹽酸,50 g/L間苯三酚甲醇溶液)1 mL,在50 ℃避光水浴20 min后,加入0.2 mol/L的乙酸鈉溶液1 mL終止反應。4 ℃、8 000 r/min離心15 min,取上清液轉移至新的離心管中,重復上述操作3 次,將3 次所得上清液合并后搖勻,經0.22 μm有機膜過濾,用于HPLC-MS檢測,每個樣品重復進樣2 次。

黃烷-3-醇的定性根據中國農業大學葡萄酒研究中心建立的葡萄與葡萄酒黃烷-3-醇指紋譜庫[20]。黃烷-3-醇的聚合體在酸性條件下發生裂解反應釋放游離態的末端單元及與間苯三酚結合形成新的復合物延伸單元[21],用質譜信息對延伸單元進行定性,用標準曲線對各種末端單元、延伸單元和游離單元進行定量。果皮和種子中黃烷-3-醇物質含量的單位為mg/g,計算末端單元和延伸單元的總物質的量與末端單元的總物質的量的比值可得到平均聚合度(mean degree of polymerization,mDP)[22]。黃烷-3-醇定量分別以C、EC、EGC、ECG為外標物,計算4種黃烷-3-醇的含量。果皮和種子中的黃烷-3-醇含量以果實鮮質量表示,單位為mg/kg。標準曲線如下:

C:y＝965.16x+558.87(y＜20 000),相關系數為0.999 7;y＝526.93x+17 110(y≥20 000),相關系數為0.997 2;EC:y＝1 407.6x+929.52(y＜30 000),相關系數為0.999 2;y＝444.48x+28 086(y≥30 000),相關系數為1;ECG:y＝2 850.6x+3 530.3(y＜50 000),相關系數為0.998 1;y＝710.51x+137 514(y≥50 000),相關系數為0.997 9;EGC:y＝19.42x-28.647,相關系數為0.998 1。

HPLC-MS條件:黃烷-3-醇定性和定量分析使用1200系列HPLC串聯三重四極桿質譜儀,色譜柱為Poroshell120 EC-C18column(150 mm×2.1 mm,2.7 μm)。柱溫55 ℃,進樣量1 μL,檢測波長280 nm,流速0.4 mL/min。流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為加入0.1%甲酸的甲醇-乙腈(1∶1,V/V)的溶液。洗脫程序:0～28 min,90%～54% A,10%～46% B;28～29 min,54%～90% A,46%～10% B。質譜采用電噴霧離子源,負離子模式,霧化氣壓力為35 psi,干燥氣流速為12 L/h,干燥氣溫度為350 ℃,噴霧電壓為4 kV。采用多反應檢測模式對目標化合物進行分析。

1.3.4 葡萄果實香氣化合物的提取和測定

取保存于低溫(-40 ℃)冰箱的葡萄果實50 g,去除果柄和種子,依次加入抑制內源糖苷酶活性的0.5 gD-葡萄糖酸內酯和1 g防止氧化的交聯聚乙烯吡咯烷酮,并且破碎至粉末狀;4 ℃靜置浸漬4 h后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min,收集上層澄清葡萄汁。參照Lan Yibin等[23]的頂空固相微萃取(head space-solid phase microextraction,HS-SPME)條件萃取游離態香氣物質。

結合態香氣物質提取方法參照Lan Yibin等[23]的方法,在活化后的固相萃取柱中加入2 mL葡萄汁,然后依次加入2 mL水和5 mL二氯甲烷,最后糖苷態香氣物質用20 mL甲醇溶液洗脫。收集洗脫后的甲醇溶液,在30 ℃真空條件下用旋轉蒸發儀蒸干,使用含0.1 g糖苷酶的檸檬酸/磷酸氫二鉀緩沖液(0.2 mol/L,pH 5)10 mL重新溶解,隨后轉移至密閉離心管,37 ℃恒溫酶解16 h。釋放的結合態香氣物質經HS-SPME后進樣至GC-MS檢測,每個樣品重復進樣2 次。

HS-SPME條件:準確稱取1.0 g NaCl放入15 mL進樣小瓶,加入5 mL葡萄汁或糖苷水解液和10 μL作為內標的4-甲基-2-戊醇(1.038 8 g/L),迅速將進樣小瓶用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子密封。樣品瓶在40 ℃、500 r/min加熱攪拌30 min,然后將SPME萃取頭插入樣品瓶頂空部分,繼續40 ℃加熱攪拌30 min。SPME萃取頭在GC進樣口(250 ℃)解吸8 min完成進樣。

GC-MS條件:參考Wu Yuwen等[24]實驗方法。香氣化合物定性采用自動解卷積技術對GC-MS全掃描數據文件進行解卷積分析,根據各物質的保留時間以及C7～C24正構烷烴在相同色譜條件下的保留時間對比計算其相應的保留指數,與標樣保留指數、質譜圖以及NIST Chemical WebBook文獻中收錄的極性柱條件下測得的保留指數比較,差值絕對值小于50的組分可定性為該化合物。定量方法參考Zhang Mingxia等[25]實驗方法,利用標準樣品香氣物質在模擬葡萄汁溶液中的標準曲線對己有標準樣品的物質定量;利用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標樣香氣物質對沒有標樣的物質的標準曲線進行半定量,樣品及標準曲線均通過相同濃度的4-甲基-2-戊醇作為內標對儀器的響應狀態進行矯正。香氣物質的含量以果實鮮質量計算,單位表示為μg/kg。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 供試葡萄品種(品系)果實理化指標分析

表2 供試葡萄品種（品系）果實理化指標Table 2 Physiochemical parameters of different grape varieties (clones)

釀酒葡萄理化指標是決定葡萄酒品質高低的關鍵因素,對供試葡萄品種(品系)成熟期果實的可溶性固形物、pH值、可滴定酸(以酒石酸計)和百粒漿果質量等理化指標進行測定,結果如表2所示。供試品種的可溶性固形物含量在17.13～20.35 °Brix之間,其中山葡萄的可溶性固形物含量最低。比較果汁的pH值看出,山葡萄和山歐雜種葡萄的pH值普遍低于歐亞種葡萄,尤其是‘雙豐’的pH值最低(2.79)。可滴定酸的質量濃度在8.76～20.46 g/L之間,其中‘雙豐’含量最高。百粒漿果質量在93.51～176.65 g之間,‘寶石解百納’(176.65 g)百粒漿果質量最大,其次是‘赤霞珠’(685),‘雙豐’和‘雙紅’百粒漿果質量最小。

2.2 供試葡萄品種(品系)果皮花色苷分析

2.2.1 含量分析

表3 供試葡萄品種（品系）花色苷含量Table 3 Anthocyanin contents of different grape varieties (clones)mg/kg

如表3所示,共檢測出26 種花色苷,包括未酰化、乙酰化、香豆酰化和咖啡酰化的花色苷。在歐亞種葡萄果皮中共檢測出19 種花色苷,總花色苷含量范圍在400～1 200 mg/kg,其中花色苷總量最多的是‘寶石解百納’(1 100.57 mg/kg);在山葡萄和山歐雜種葡萄中共檢測到21 種花色苷,其中包括7 種雙糖苷和14 種單糖苷,總花色苷含量最多的是‘雙紅’(2 636.05 mg/kg),其次是‘雙豐’(2 036.64 mg/kg),最少的是‘北冰紅’(772.03 mg/kg)。葡萄果皮中的花色苷總量很大程度上取決于葡萄本身的遺傳信息,對比3 個品種類別,可以明顯看出山葡萄果皮花色苷總量顯著高于歐亞種葡萄,而山歐雜種品種‘北冰紅’果皮花色苷總量介于歐亞種葡萄和山葡萄之間。

2.2.2 組成分析

研究表明,歐亞種葡萄常含的花色苷種類主要包括有單糖苷化的花青素、花翠素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素的3-葡萄糖苷衍生物[26-31],而非歐亞種葡萄含有花色素雙糖苷[32],典型的非歐亞種葡萄如山葡萄均含有花色素雙糖苷[33]。在本研究檢測到的花色苷種類中,歐亞種葡萄檢測到的花色苷都是單糖苷,其中非酰化5 種、乙酰化5 種、香豆酰化7 種、咖啡酰化2 種,含量最高的是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷,在‘赤霞珠’338中沒有檢測到甲基花青素-3-O-咖啡酰化葡萄糖苷。在有山葡萄遺傳背景的4 個品種中共檢測到了7 種花色素雙糖苷,分別為二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-香豆酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、甲基花青素-3,5-O-雙葡萄糖苷、花青素-3,5-O-雙葡萄糖苷,且二甲花翠素-3-O-香豆酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-乙酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷只在山歐雜種品種‘北冰紅’中檢測到,這7 個雙糖苷中含量最高的是二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷;而在山葡萄遺傳背景的4 個品種中都沒有檢測到花青素的單糖苷,在山葡萄品種‘雙豐’、‘雙優’和‘雙紅’中都沒有檢測到酰化的花色苷。

比較花色苷含量的組成(圖1),3 個歐亞種葡萄均是由非酰化、乙酰化、咖啡酰化和香豆酰化的花色苷組成,而3 個山葡萄品種均只檢測到非酰化的花色苷;山歐雜種品種‘北冰紅’同時檢測到非酰化、乙酰化和香豆酰化的花色苷。總體來看4 種花色苷含量占總花色苷含量的比例為非酰化＞乙酰化＞咖啡酰化＞香豆酰化,‘雙優’、‘雙紅’、‘雙豐’和‘北冰紅’中沒有檢測到咖啡酰化的花色苷,香豆酰化的花色苷所占比例在4 種花色苷中最低。香豆酰化的花色苷含量在品種間差異較大,其中含量最高的是山歐雜種品種‘北冰紅’(24%),其次是歐亞種葡萄,山葡萄中不含有香豆酰化的花色苷。非酰化的花色苷在山葡萄和山歐雜種葡萄中的比例高于歐亞種葡萄,均大于70%。

在本研究中,由于只在山葡萄和山歐雜種葡萄中檢測到花色素雙糖苷,分析其5 類花色苷中單雙糖苷的比例如圖2所示,這4 個品種主要是以花色素雙糖苷為主。在山歐雜種品種‘北冰紅’中檢測到少量的花青素類單糖苷,而在山葡萄品種‘雙優’、‘雙紅’和‘雙豐’中并未檢測到花青素類單糖苷,且在‘北冰紅’中檢測到的甲基花翠素類和二甲花翠素類單糖苷的含量顯著高于3 個山葡萄品種。在3 個山葡萄品種中,5 類花色素雙糖苷的比例遠高于花色素單糖苷,在山葡萄和山歐雜種葡萄中最主要的花色素雙糖苷是二甲花翠素類的雙糖苷。

圖1 不同葡萄品種（品系）花色苷組成比例Fig. 1 Anthocyanin composition of different grape varieties (clones)

圖2 山葡萄和山歐雜種葡萄單雙糖苷組成比例Fig. 2 Proportions of mono-and bis-glucosidic anthocyanins in V. amurensis and interspecific hybrid of V. vinifera and V. amurensis

2.3 供試葡萄品種(品系)果皮黃酮醇分析

2.3.1 含量分析

表4 供試葡萄品種（品系）黃酮醇含量Table 4 Flavonol contents of different grape varieties (clones)mg/kg

如表4所示,共檢測到12 種黃酮醇化合物,其中包括楊梅酮類(3 種)、槲皮素類(4 種)、西伯利亞落葉松黃酮(1 種)、山柰酚類(2 種)、異鼠李素(1 種)和丁香亭(1 種)。在歐亞種葡萄和山歐雜種葡萄中12 種黃酮醇化合物均被檢測到,而在山葡萄品種‘雙優’、‘雙紅’和‘雙豐’中沒有檢測到山柰酚類化合物,在‘雙豐’葡萄中只檢測到4 種黃酮醇,分別為楊梅酮-3-O-半乳糖苷、楊梅酮-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷和楊梅酮-3-O-葡萄糖醛酸苷。不同品種總黃酮醇含量差異較大,山葡萄總黃酮醇含量顯著高于歐亞種葡萄;山歐雜種品種‘北冰紅’總黃酮醇含量顯著高于歐亞種葡萄‘赤霞珠’,而與‘寶石解百納’差異不顯著;其中總量最多的是‘雙紅’(399.77 mg/kg),總量最少的是‘赤霞珠’(338)(83.37 mg/kg);在山葡萄中含量最多的化合物是楊梅酮-3-O-半乳糖苷,約占總量的2/3。

2.3.2 組成分析

對供試葡萄品種(品系)果皮中不同種類黃酮醇占總黃酮醇的比例進行分析(圖3),7 個品種中共檢測到了在葡萄果實中存在的6 種糖苷配基,分別為楊梅酮、槲皮素、山柰酚、西伯利亞落葉松黃酮、異鼠李素和丁香亭,其中楊梅酮類和槲皮素類黃酮醇含量最多。在歐亞種葡萄中槲皮素類黃酮醇占總黃酮醇比例最高,其中‘赤霞珠’最高且都大于70%;而與歐亞種葡萄相比,山葡萄和山歐雜種葡萄中含量最多的是楊梅酮類黃酮醇,尤其是‘雙紅’和‘雙豐’,其比例高達88%;其中‘雙豐’只含有楊梅酮、槲皮素兩類黃酮醇。山歐雜種品種‘北冰紅’與歐亞種葡萄相比,其楊梅酮類黃酮醇含量明顯高于歐亞種葡萄,約占總量的55%;與3 個山葡萄品種相比,其西伯利亞落葉松黃酮、異鼠李素、丁香亭和山柰酚類黃酮醇含量明顯高于山葡萄。可見,具有歐亞種葡萄血緣和山葡萄血緣的‘北冰紅’,其各類黃酮醇含量介于兩者之間。

圖3 不同葡萄品種（品系）黃酮醇組成比例Fig. 3 Flavonol composition of different grape varieties (clones)

2.4 供試葡萄品種(品系)果皮和種子黃烷-3-醇含量和組成分析

如表5、6所示,葡萄果皮中游離黃烷-3-醇主要包括3 個基本單元,分別為C、EC和EGC。比較游離單元、末端單元和延伸單元可知,延伸單元所占比例最高,接近90%,延伸單元主要由EC組成,其次是EGC,ECG和C的含量較低。檢測成熟期葡萄果皮中黃烷-3-醇發現,EGC、C和EC均可作為末端單元,并且C是主要的末端單元,其次是EGC。相比于歐亞種葡萄果皮中的黃烷-3-醇總量,山葡萄和山歐雜種葡萄中的黃烷-3-醇遠低于歐亞種葡萄,其中含量最少的是‘雙紅’(224.75 mg/kg)。比較mDP可知,歐亞種葡萄的平均聚合度高于山葡萄,其中最高的是‘赤霞珠’(685)(104.47),該結果與韓梅梅等[22]研究結果不同,可能是由于產地、年份等生態環境不同的原因,而山葡萄果皮中黃烷-3-醇的mDP都小于20,最低的是‘雙優’(7.81)。

葡萄種子中檢測到的游離黃烷-3-醇主要包括C、EC、ECG和EGC 4 種基本單元。在種子的黃烷-3-醇中延伸單元所占比例最高,延伸單元主要是由EC組成,其次是ECG,而EGC和C含量很少。檢測成熟期葡萄種子中黃烷-3-醇發現,EGC、C和EC均可作為末端單元,并且C是主要的末端單元,其次EGC。其中,山葡萄種子中的黃烷-3-醇總量差異較大,最多的是‘雙紅’(6 705.55 mg/kg),最低的是‘雙豐’(2 0 9 7.5 1 m g/k g)。一般來說,在歐亞種葡萄中,種子中的mDP低于果皮,但是計算成熟期種子的黃烷-3-醇的mDP可知,‘寶石解百納’種子的mDP(45.98)高于葡萄果皮中的(19.1)。而山葡萄品種‘雙豐’、‘雙紅’和‘雙優’與山歐雜種品種‘北冰紅’的種子mDP遠高于果皮,差別最大的是‘雙優’,在種子中的mDP能達到128.39,但在果皮中的mDP卻為7.81,表現出與歐亞種葡萄明顯的不同。相比之下,‘北冰紅’因為含有歐亞種葡萄血緣,種子與果皮中的mDP的差異不是特別大,但是種子的mDP(45.07)還是高于果皮(28.64)。

表5 供試葡萄品種（品系）果皮黃烷-3-醇含量Table 5Flavanol-3-ol contents in the skin of different grape varieties (clones)mg/kg

表6 供試葡萄品種（品系）種子黃烷-3-醇含量Table 6Flavanol-3-ol contents in the seeds of different grape varieties (clones)mg/kg

2.5 供試葡萄品種(品系)果實香氣物質含量和組成分析

采收期供試葡萄品種(品系)果實中香氣化合物組成復雜,這些香氣化合物以游離態和糖苷結合態的形式存在,共66 種;根據其化學機構的不同可分為酸類(2 種)、醇類(9 種)、苯類(2 種)、C6/C9類(13 種)、羰基化合物(7 種)、酯類(16 種)、降異戊二烯類(1 種)、萜烯類(5 種)以及其他(11 種)。表7和表8分別表示供試葡萄品種(品系)果實中游離態和糖苷結合態香氣物質的含量。

供試葡萄品種(品系)果實中共檢測到58 種游離態香氣物質,在7 個不同品種(品系)中C6/C9類是游離態香氣物質中含量最豐富的化合物,如圖4A所示,占總游離香氣物質含量的比值均在85%以上;C6/C9類化合物能夠提供青草香,對葡萄酒的香氣非常重要,在檢測出的C6/C9類香氣物質中以(E)-2-己烯醛的含量最高,它也決定了葡萄果實游離態C6/C9類香氣物質的含量。其中山葡萄的C6/C9類香氣物質含量顯著高于歐亞種葡萄和山歐雜種葡萄,含量最高的是‘雙豐’(23 991.12 μg/kg),含量最低的是‘北冰紅’(10 499.01 μg/kg)。其次游離態香氣物質中含量最豐富的化合物是酯類,含量比值范圍在3%～8%之間。

供試葡萄品種(品系)果實中結合態香氣物質共檢測到45種,其中醇類是‘赤霞珠’(338)、‘寶石解百納’、‘雙豐’和‘北冰紅’葡萄果實中最主要的結合態香氣物質,如圖4B所示,占總結合香氣物質含量的30%以上;‘赤霞珠’(685)中含量最豐富的是C6/C9類和萜烯類香氣物質,以及其他類型香氣化合物;酯類物質在‘雙優’和‘雙紅’中含量最高,分別為1 236.64、1 160.9 μg/kg,分別占總結合態香氣物質的41%、26%;而C6/C9類香氣物質在‘雙豐’中含量最多,為1 241.41 μg/kg,占總結合態香氣物質的34%。綜上,山葡萄的C6/C9類香氣物質含量顯著高于歐亞種葡萄。因此,C6/C9類香氣物質含量的多少可以作為區分山葡萄和歐亞種葡萄的依據。

表7 供試葡萄品種（品系）果實游離態香氣物質含量Table 7 Contents of free aroma compounds in different grape varieties (clones)μg/kg

表8 供試葡萄品種（品系）果實結合態香氣物質含量Table 8 Contents of conjugated aroma compounds in different grape varieties (clones)μg/kg

圖4 不同葡萄品種（品系）果實游離態香氣物質（A）和結合態香氣物質（B）組成比例Fig. 4 Composition of free (A) and conjugated (B) aroma compounds in different grape varieties (clones)

3 結 論

本研究通過對7 個釀酒葡萄(來源于歐亞種葡萄、山葡萄和山歐雜種葡萄)果實類黃酮及香氣物質含量和組成的測定,明確了不同種葡萄之間的差異。其中,山葡萄花色苷總量顯著高于歐亞種與山歐雜種葡萄;在山葡萄中未檢測出酰化的花色苷;在歐亞種葡萄中只檢測出花色素單糖苷;在山歐雜種品種‘北冰紅’中檢測到2 種酰化的花色素雙糖苷。在黃酮醇方面,山葡萄黃酮醇總量顯著高于歐亞種與山歐雜種葡萄;山葡萄和歐亞種葡萄分別以楊梅酮類和槲皮素類黃酮醇含量最多;在山葡萄品種中均未檢測出山柰酚類黃酮醇。對比分析葡萄果皮和種子中的黃烷-3-醇及其mDP,歐亞種葡萄果皮中的黃烷-3-醇總量顯著高于山葡萄與山歐雜種葡萄;歐亞種葡萄果皮的mDP高于種子的mDP,而山葡萄和山歐雜種葡萄則相反。果實香氣方面,C6/C9類香氣物質的含量占香氣總量的比值最大;山葡萄中C6/C9類香氣物質的含量顯著高于歐亞種葡萄。綜上所述,不同種葡萄果實類黃酮及香氣物質含量和組成的差異明顯,未來可以將這些差異指標作為區分歐亞種葡萄、山葡萄和山歐雜種葡萄的理論依據。