超聲處理對谷氨酰胺轉氨酶誘導的大豆分離蛋白凝膠凍融穩定性的影響

劉競男，張智慧，王 琳，王玉瑩，張安琪，王喜波*，徐 寧*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）具有良好的凝膠性，經常被添加到冷凍面、肉類制品中賦予產品良好的特性。冷凍食品經歷凍融循環（freeze-thaw cycle，FTC）過程，形成的低密度冰晶在相變過程中體積膨脹，導致食品結構發生不可逆變化，改變食物的質地，產生收縮、析水、硬度增加等現象。凍融穩定性是許多凝膠食品在食用前需要保持的重要特性。王培森等[1]研究可得然膠對肌球蛋白凍融穩定性影響時發現，可得然膠的添加能夠降低凍融時凝膠持水性和凝膠強度的變化程度。陳振家等[2]研究不同熱處理SPI熱誘導凝膠在凍藏時期凝膠特性變化，發現熱處理會加速其凝膠品質凍藏劣變。

超聲波處理過程中產生大量的空化氣泡以及熱、機械和化學效應。Madadlou等[3]研究高強度超聲處理酪蛋白時發現，超聲處理能夠改變酸誘導酪蛋白凝膠形成的pH值，彈性也顯著增加，且具有良好微觀結構。Zisu等[4]研究發現超聲增加了乳清蛋白熱誘導凝膠強度，超聲處理和熱凝結乳制品的凝膠強度和持水性得到顯著改善。Zhang Peipei等[5]研究經超聲處理的肌纖維蛋白形成凝膠時，發現超聲處理會增加凝膠的保水性。Cui Qiang等[6]研究發現超聲處理大豆-乳清混合蛋白，其凝膠性得到改善。

目前，國內外研究主要通過蛋白改性來提高乳液凍融穩定性，但對提高蛋白凝膠凍融穩定性的相關報道較少。而采用超聲與谷氨酰胺轉氨酶（glutamine transaminase，TG）復合改性技術提高改性產物凍融穩定性的研究更鮮見報道。本實驗以SPI為原料，采用超聲改性SPI，然后通過TG交聯形成凝膠，以粒徑、表面疏水性分析以及內源性熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜等方法探究超聲改性對SPI結構影響，以凍融循環過程中TG誘導的SPI凝膠的持水性、質構、微觀結構及可溶性蛋白含量變化，研究超聲處理的TG誘導SPI凝膠凍融穩定性，為冷凍食品專用SPI的產業化生產提供理論和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕 山東禹王實業有限公司；TG 一鳴生物制品有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；BCD-206L3CT型冰箱 合肥美菱股份有限公司；粒度分布儀 美國布魯克海文儀器公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；TA-XT2i型質構儀 英國SMS公司；掃描電子顯微鏡 日立高新技術公司；LD4-2A型低速臺式離心機 北京京立離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參照Zhang Zeyu等[7]方法。脫脂豆粕粉碎過篩，以質量比1∶10溶于去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調pH值至8.5，室溫攪拌2 h。然后4 000 r/min離心20 min，取上清液，用2 mol/L HCl溶液調pH值至4.5。4 000 r/min離心5 min，沉淀物即為SPI。水洗兩次后復溶，用2 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0。冷凍干燥后，獲得SPI粉末。

1.3.2 超聲改性

將SPI溶于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0），SPI質量濃度為40 mg/mL。加入疊氮鈉，4 ℃水合過夜。超聲處理參考Hu Hao等[8]的方法。將樣品液分裝至100 mL錐形瓶中，超聲波處理器的鈦探頭浸入樣品液中，距離瓶底約1 cm處，設置超聲功率為360 W，以超聲時間分別為0、10、20、30、40 min處理樣品，備用。

1.3.3 粒徑分布測定

用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）稀釋樣品液至蛋白質量濃度為1 mg/mL，顆粒折射率和分散劑折射率分別為1.460和1.330。

1.3.4 表面疏水性測定

用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L、pH 7.0）稀釋成蛋白質量濃度分別為0.02、0.01、0.005、0.002 5 mg/mL的樣品，8 mL樣品中加入20 μL的8-苯氨基-1-萘磺酸（8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖液，pH 7.0）熒光探針，混勻后，25 ℃避光15 min后測定熒光強度。設置激發和發射波長分別為390 nm和470 nm，狹縫5 nm[9]。測定熒光強度，對蛋白溶液質量濃度作圖（y＝0.135 1x＋0.039 5，R2＝0.999 1），線性良好，回歸線斜率為蛋白質表面疏水性。

1.3.5 內源熒光光譜測定

將樣品液用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L、pH 7.0）稀釋至蛋白質量濃度為5 mg/mL，于激發波長347 nm、發射波長范圍375～550 nm掃描[10]。樣品液稀釋至質量濃度為0.5 mg/mL，于激發波長290 nm、發射波長范圍300～400 nm掃描。狹縫5.0 nm，掃描速率240 nm/min。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將改性處理后的樣品冷凍干燥，與KBr粉末混合研磨，將混合粉末壓制成薄片，使用FTIR-8400型FTIR儀進行全波段掃描，設置分辨率為4 cm-1，掃描次數32 次，測量范圍為4 000～400 cm-1[11]。

1.3.7 凝膠制備

將改性處理的樣品配制成蛋白質量濃度為100 mg/mL的溶液，加入TG（TG和SPI質量比為3∶100）溶解，調pH值至7.0。將樣品液分裝至燒杯中，45 ℃水浴2 h后，90 ℃加熱滅酶10 min。將制得的凝膠4 ℃下冷藏過夜。

1.3.8 凍融循環

將凝膠樣品置于-20 ℃冷凍儲存22 h后，25 ℃解凍2 h，隨機選取出一批樣品進行后續測定。如此為一次凍融循環（1 FTC），凍融循環共5 次。

1.3.9 持水性測定

參考Zhang Sha等[12]的方法，略加改動。 取一定凝膠置于離心管，記錄凝膠質量m，離心管和凝膠總質量m1，4 000 r/min離心10 min后，小心除去離心管內水分，測離心管及凝膠質量m2。持水性按下式計算。

式中：m為凝膠質量/g；m1為離心管和凝膠離心前總質量/g；m2為離心管和凝膠離心后總質量/g。

1.3.10 質構特性測定

參考Jin等[13]的方法，略加改動。測定時使用P/0.5柱形探頭為測定探頭，探頭下行速率為1 mm/s，檢測速率和后撤速率均為 5 mm/s，觸發力為5 g。

1.3.11 掃描電子顯微鏡觀察

參考Aguirre-Mandujano等[14]的方法，將凝膠切成（2 mm×5 mm）小塊，用體積分數為2.5%戊二醛溶液（pH 6.8）固定，4 ℃保存。用體積分數為50%、70%和90%的乙醇溶液分別脫水一次，無水乙醇脫水3 次，然后用混合液（無水乙醇與叔丁醇體積比1∶1）和純叔丁醇各置換1 次，每次置換15 min。冷凍干燥后進行離子漸射鍍金，于掃描電子顯微鏡（5 kV）下觀察。

1.3.12 可溶性蛋白質量分數測定

參考Peng Xingyun等[15]的方法。將凝膠靜置至室溫，切取定量凝膠于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）研磨破碎，定容后磁力攪拌0.5 h，10 000 r/min離心30 min。取上清液，考馬斯亮藍法測定其可溶性蛋白質量分數。

1.4 數據處理與分析

所有實驗重復3 次取平均值，采用SPSS 19.0軟件進行數據處理和顯著性分析（單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著），使用Origin 8.6軟件作圖，通過Peakfit 4.12軟件計算蛋白二級結構。所有結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 粒徑分析結果

圖1 超聲時間對SPI蛋白溶液粒徑的影響Fig. 1 Particle size distribution of ultrasonic-treated SPI solutions

超聲處理后SPI粒度分布和粒徑大小如圖1所示，SPI樣品雙峰分布顯著，隨著超聲時間延長，SPI粒徑分布向更小且峰更窄的趨勢發展，平均粒徑隨超聲時間延長而降低。由圖1B可知，與SPI相比，超聲處理SPI溶液中蛋白質平均粒徑顯著降低，從489.2 nm降低至130.9 nm。王喜波等[16]研究超聲處理SPI和乳清蛋白混合物時得到相似結論。其原因可能是超聲處理產生的空化效應等，減弱了蛋白分子間的相互作用，減少蛋白聚集。

2.2 超聲時間對SPI表面疏水性的影響

圖2 超聲時間對SPI表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of ultrasonication time on surface hydrophobicity of SPI

不同超聲時間處理后SPI的表面疏水性變化如圖2所示，未處理的SPI表面疏水性較低，經超聲處理后，SPI的表面疏水性顯著提高。Jiang Lianzhou等[17]研究高強度超聲波處理對牛血清白蛋白功能和結構性質的影響時也得到類似結論。在一定超聲時間范圍內，SPI表面疏水性隨著超聲時間延長而增加，由5 013.9升至6 642.9。Hu Hao[18]和Sun Yanjun[19]等研究乳濃縮蛋白和SPI時也發現相似結果。這些結果表明超聲處理改變蛋白三級結構，蛋白質分子發生去折疊和展開[3]，蛋白分子變性，蛋白內部的疏水基團因超聲處理而暴露[10]，蛋白質表面疏水性增強。

2.3 內源熒光光譜分析結果

圖3 不同蛋白樣品的內源熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of SPI ultrasonicated for different durations

在280 nm波長處，蛋白質的色氨酸和酪氨酸殘基都將被激活，因此可以從熒光的波動確定蛋白質的三級結構的變化[20]。由圖3可知，隨著超聲時間延長，SPI內源熒光強度降低，超聲40 min時熒光強度最低。其原因可能是超聲處理破壞蛋白質結構，疏水性氨基酸殘基暴露，更多的生色團在溶劑中暴露，降低熒光強度。超聲波處理后，SPI內源熒光的最大熒光強度λmax并未發生顯著變化，表明色氨酸殘基所在的微環境的極性沒有變化[21]。Zhang Qiuting等[22]也得到相似的研究結果。

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖4 不同蛋白樣品的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 FTIR spectra of SPI ultrasonicated for different durations

圖4 是SPI在4 000～400 cm-1范圍內的傅里葉變換紅外光譜圖，利用PeakFit 4.12軟件進行處理，通過去卷積計算可以得到蛋白質二級結構含量變化。酰胺I帶中波長范圍1 648～1 664 cm-1為α-螺旋結構，1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊結構，1 664～1 681 cm-1和1 637～1 648 cm-1分別為β-轉角和無規卷曲結構[23]。從表1可以看出，超聲SPI的二級結構較未處理發生變化，其α-螺旋結構相對含量減少，β-轉角和無規卷曲結構相對含量增加，表明蛋白結構由有序向無序趨勢發展。這可能是超聲的空化效應破壞了剛性蛋白質結構，增加蛋白質分子柔性[24]。β-折疊相對含量能夠反映蛋白質疏水作用力，β-折疊相對含量降低表明蛋白表面疏水基團暴露，疏水性增強[25]，蛋白質在疏水作用力下聚集體被破壞。這與表面疏水性結果互相印證。

表1 不同蛋白樣品二級結構相對含量Table 1 Secondary structure composition of SPI ultrasonicated for different durations%

2.5 超聲時間對凝膠持水性的影響

圖5 超聲時間對凝膠持水性的影響Fig. 5 Effect of ultrasonication time on water-holding capacity of the gel

凝膠的持水性是凝膠品質評價重要指標之一，蛋白質凝膠的持水性取決于凝膠網絡結合水的能力[26]。如圖5所示，超聲SPI凝膠的持水性顯著高于SPI樣品，且隨超聲時間的延長而增加，凍融循環0 次時，超聲處理40 min，其凝膠的持水性最高為90.05%，較未超聲處理凝膠增加了15.93%。超聲處理改變蛋白結構，疏水基團暴露出來，TG交聯形成二硫鍵，形成更加緊密且規則的三維網絡結構，提高其凝膠性，凝膠持水性與蛋白質粒徑和溶解度有關，提高溶解度和降低粒徑都會提高凝膠持水性[27]。隨著超聲時間的延長，蛋白粒徑降低和溶解度增加，都促使TG交聯形成緊密、均一的凝膠結構，促進水在凝膠網絡結構中聚集，增加凝膠持水性。Han Minyi等[28]發現凝膠持水性增加，其凝膠硬度和彈性等凝膠性也會增加，這也與本實驗的凝膠硬度和彈性結果一致。

相同超聲時間下，隨著凍融循環次數的增加，凝膠的持水性隨之降低。肖旭華[29]研究肌球蛋白凝膠凍融特性時，也得到相似結論。低溫導致游離水和結合水凍結，形成低密度冰晶，反復凍結和解凍降低了晶體的總數，平均晶體尺寸增加，導致凝膠內部孔徑隨之增加，增大了水分在凝膠中流動空間[30]，從而造成持水性的降低。SPI凝膠持水下降程度最大，降低了49.23%。超聲40 min時，超聲SPI凝膠凍融循環5 次時持水性較凍融循環0 次時降低了38.59%，由此可見超聲處理SPI能提高凝膠的凍融穩定性。這可能與超聲處理改變蛋白的分子結構有關，超聲產生的空穴現象降低SPI粒徑，有助于蛋白發生水合，提高蛋白-水分子間相互作用，增強對水分子的束縛作用，有助于形成更加緊密的網絡結構[30]。此外，研究表明，TG通過催化肽結合的谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基的ε-氨基發生酰基轉移，形成更強的ε-賴氨酸異肽鍵作用力，減小冰晶對凝膠網絡的破壞[31]，從而提高凍融過程中的持水性。

2.6 超聲時間對凝膠微觀結構的影響

圖6 不同樣品凝膠凍融前后的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 Scanning electron microscope images of native and ultrasonictreated gel samples with different freeze-thaw cycles

掃描電子顯微鏡可以更加直觀地觀察不同超聲處理條件下TG誘導SPI凝膠在凍融循環過程中微觀結構的三維網絡。圖6顯示了超聲處理前后SPI凝膠凍融循環0 次和5 次在100 倍和5 000 倍放大倍數下凝膠的微觀結構圖。從圖6中可見，凍融循環0 次時，未超聲的樣品形成了表面粗糙、松散、孔洞較大的網絡結構，超聲后SPI凝膠組織形成了表面光滑、緊湊、均勻的孔隙小的網狀結構。這種現象的產生可能是由于超聲的空化現象顯著降低蛋白粒徑，增加了暴露于蛋白表面的活性基團，促進TG交聯反應形成更加均勻致密的凝膠結構[32]。

凍融循環5 次后，凝膠的微觀結構存在顯著變化，呈明顯的蜂窩狀結構。Charoenrein等[33]觀察凍融過程中淀粉凝膠微觀結構變化，也發現凍融后淀粉凝膠網絡變成海綿狀結構。冷凍形成冰晶使凝膠整體平均孔徑變大，凝膠網絡結構形成具有冰晶嵌入的蜂窩狀結構[33]。溫度的升高引起冰晶融化，凝膠和水發生相分離，形成析水孔道，引起脫水縮和[34]，導致凝膠呈現蜂窩狀結構。這也解釋了凝膠持水性隨凍融次數增加而降低這一變化趨勢。SPI凝膠網狀結構較不規則，體現了較差的凍融穩定性。超聲SPI凝膠表面光滑平整，基質緊密。凍融循環引起的脫水縮合作用破壞了凝膠網絡結構，同時也會造成凝膠體系蛋白質的濃縮，在高放大倍數（×5 000）觀察到凝膠纖維狀結構。超聲作用減小SPI粒徑，有助于形成更加緊密的網絡結構，超聲的機械效應引起蛋白分子結構展開，促使形成鍵能更強的ε-賴氨酸異肽鍵，減弱凍結形成的冰晶對凝膠網絡結構的破壞作用，從而降低凍融過程對凝膠的破壞作用。

2.7 超聲時間對凝膠質構的影響

圖7 超聲時間對凝膠質構的影響Fig. 7 Effect of ultrasonication time on texture of the gel

凝膠硬度和彈性受凝膠網絡形成的影響。如圖7所示，在超聲處理條件下，SPI凝膠的硬度和彈性均隨處理時間的延長呈現增加趨勢。超聲40 min時，凝膠硬度和彈性達到最大，凍融循環0 次，其凝膠硬度和彈性分別為522.94 g和0.96 mm，分別是SPI的1.78 倍和1.14 倍，表明超聲處理能改善TG誘導SPI凝膠的硬度和彈性。超聲產生的空穴作用和微束流作用可以促進疏水基團的暴露，隨著處理時間的延長，蛋白質變性，更多的疏水基團暴露，蛋白分子間的交聯度提高，所形成的凝膠網絡更加精細，促使凝膠硬度和彈性增加。Zhao等[35]也得到相似結論。

隨著凍融循環次數的增加，所有樣品凝膠的硬度和彈性也隨之增加。Fuchigami等[36]研究高壓冷凍豆腐發現豆腐在冷凍后硬度和彈性都會增加。冷凍使水分形成冰晶，引起蛋白濃縮的同時也會破壞凝膠結構，形成蜂窩狀空洞型結構，而且蛋白質-蛋白質相互作用取代蛋白質-水作用，從而增大凝膠硬度和彈性[34]。凍融循環5 次后，SPI凝膠硬度和彈性較凍融循環0 次時分別增加了1 186.23 g和0.36 mm，超聲40 min的凝膠樣品經凍融循環5 次其凝膠硬度和彈性較凍融循環0 次時分別增加了510.23 g和0.07 mm，超聲的SPI凝膠的硬度和彈性在凍融過程中變化程度小于SPI凝膠。說明超聲處理能夠減緩凍融過程中SPI凝膠劣變程度。

2.8 超聲時間對凝膠可溶性蛋白質量分數的影響

圖8 超聲時間對凝膠可溶性蛋白質量分數的影響Fig. 8 Effect of ultrasonication time on soluble protein content of the gel

從圖8可以看出，凍融循環0 次時，SPI凝膠的可溶性蛋白質量分數最高，為14.14%，超聲處理后，凝膠的可溶性蛋白質量分數顯著降低（P＜0.05），且隨超聲時間的延長而降低，超聲處理40 min時，凝膠可溶性蛋白質量分數達到最低，為13.56%。超聲處理導致蛋白質的展開、肽鍵的破壞和親水氨基酸殘基在蛋白質內部的暴露，增加蛋白溶解度[37]，有利于形成更加均勻致密的網絡，這種網絡結構的形成需要大量蛋白參與，因此可溶性蛋白含量降低。

凍融循環5 次后，SPI可溶性蛋白質量分數較凍融循環0 次顯著降低（P＜0.05），減少了7.23%。冷凍引起蛋白變性，發生聚集和肽鏈展開，導致凝膠結構進一步重排，可溶蛋白通過蛋白間相互作用結合到原有網絡結構，使凝膠的網絡結構變得粗糙，從而引起凝膠在凍藏過程中品質的劣變[2]。超聲時間為40 min時，凝膠可溶性蛋白質量分數達到最低，為9.91%，較凍融循環0 次減少了3.65%，表明超聲處理能改善TG誘導的SPI凝膠凍融穩定性。

3 結 論

隨著凍融循環次數的增加，凝膠的持水性和可溶性蛋白質量分數都呈下降趨勢，硬度隨之而增加。掃描電子顯微鏡觀察凝膠微觀結構發現，凍融循環5 次后的凝膠孔洞大，蛋白基質松散，呈明顯的蜂窩狀結構。說明凍融導致凝膠劣變，凍融穩定性降低。

通過粒徑、表面疏水性、內源熒光光譜分析和傅里葉變換紅外光譜分析證明了超聲處理導致SPI分子結構發生變化。超聲處理能夠提高SPI凝膠的持水性、硬度和彈性，且凝膠微觀結構更加均勻致密。凍融循環過程中，超聲SPI凝膠持水性、硬度、彈性和可溶性蛋白質量分數變化幅度明顯小于SPI凝膠，表明超聲處理能夠提高凝膠凍融穩定性。

杜昱蒙等[38]研究濕熱法制備SPI-葡萄糖糖基化產物熱致凝膠的抗凍性，發現當葡萄糖與SPI質量比為1∶2、蛋白含量為40 mg/g、反應時間1.5 h時進行糖基化反應，其凝膠抗凍性最好。與其相比，本實驗不需要添加糖，縮短了改性時間，提高效率、節省能源、降低成本。