可遞送siRNA的非病毒納米載體的研究進展

劉麗麗 張吉麗

摘 要：近年來，siRNA技術作為一種新型的基因治療手段，對疾病的治療起著至關重要的作用，但是siRNA的靶向遞送也面臨巨大的挑戰。設計非病毒納米載體用于安全、高效地將siRNA運送至靶點是當前研究的熱點，本文對目前可遞送siRNA的非病毒納米載體的設計進行了綜述，并提出了目前存在的問題，及新型載體設計的展望。

關鍵詞：siRNA;遞送系統;聚合物;脂質;多肽;無機納米顆粒

基因技術的發展日新月異，基因藥物的研發也倍受人們關注。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）在1998年由Fire等發現，是一類可以特異性抑制靶基因表達的雙鏈RNA。隨著對RNAi的認識不斷深入，2001年Elbashir等證明了合成的雙鏈小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）在哺乳動物細胞中可以使靶基因特異性沉默。RNAi已經用于腫瘤、病毒感染、乙型肝炎、癌癥等多種疾病的治療。小干擾RNA（siRNA）是RNAi的效應分子，可在體內誘導RNAi效應。

siRNA由于其體積小、包封率高以及安全性高等特點，已成為具有廣闊發展前景的核酸類藥物。雖然siRNA具有明顯的優點，但是在臨床應用中仍存在亟待克服的障礙：siRNA在血清中穩定性較差，易被RNase降解。21-核苷酸的siRNA相對較小，即使是經化學修飾保持穩定的siRNA分子吸收入血后也易經尿迅速排泄。全身給藥后siRNA的非特異性分布會明顯降低靶組織的局部濃度。siRNA需克服血管內皮壁和多重的組織屏障以達到靶細胞。當siRNA到達靶細胞后還必須有效內吞、細胞攝取和保持細胞內RNAi有活性及完整性。siRNA的脫靶效應。siRNA的免疫原性刺激。

因此，要將siRNA分子成功導入生物體并發揮有效的治療作用，首先應解決載體問題。大多數研究的解決方案主要有直接局部給藥、化學修飾、病毒載體和非病毒載體等多種技術。在現有的解決方案中，非病毒載體具有低免疫原性、易合成、不受基因大小限制、安全性高等優點，明顯優于其他給藥技術。非病毒載體包括多種載體方式給藥，納米粒載體是由生物材料制備的非病毒載體，粒徑大小在1～1000nm。納米粒在遞送siRNA方面具有很多優點，比如提高siRNA在體內的穩定性，具有靶向功能，降低細胞毒性和免疫原性，增加細胞攝取和內化行為等，這些都有利于提高siRNA的基因沉默效率。因此，文中對siRNA非病毒納米傳遞載體的研究進展進行了綜述。

一、非病毒納米載體分類

非病毒納米載體材料可分為：聚合物類、脂質類和多肽類以及無機納米材料等。現分別就各類材料中的具體載體設計進行介紹：

（一）聚合物類

由于siRNA帶負電，所以帶正電的陽離子聚合物可以通過靜電引力與之結合，從而完成siRNA的包載。聚合物載體材料又可分為天然高分子聚合物與合成高分子聚合物。

1.天然高分子聚合物。膠原蛋白類是一類天然高分子物質，由胃蛋白酶純化而來，具有生物可降解以及良好的生物相容性。Takeshita等人通過將等體積的膠原蛋白與siRNA溶液相混合，制備了一種siRNA/膠原蛋白復合物，體外試驗測定其具有長循環特性和癌組織蓄積性，并且無免疫原性

環糊精（cyclodextrins，CDs）為多聚糖形成的環狀結構，具有良好的生物相容性，不會誘發免疫反應，在動物和人體中的毒性均較低，顯示出良好的非病毒基因遞送潛質。Davis利用環糊精聚合物所帶的正電荷與siRNA通過靜電作用組裝形成納米粒，成功地將siRNA遞送到靶細胞中。結果表明，利用這種新型的基因遞送載體遞送siRNA能夠顯著抑制小鼠轉移尤文氏肉瘤的生長速度。

殼聚糖（chitosan）（α（l，4）2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖）是甲殼素脫乙酞化的產物，來源廣泛，是一種天然的、無毒、可生物降解并且低免疫原性的陽離子聚合物。鑒于直接使用殼聚糖作為轉運載體的遞送效率有限，Tripathi等向殼聚糖骨架引入一個低分子量的CP1PEI提高了基因轉運能力。

2.合成高分子聚合物。該類化合物主要包括聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）及其修飾物、聚丙交酯乙交酯（polylactide-co-glycolide，PLGA）、以及聚酰胺-胺型樹枝狀高分子（polyamidoaminedendrimei，PAMAM）等。

PEI聚乙烯亞胺是研究最廣泛用于系列核酸的遞送載體，分子結構有大量的仲胺基團和叔胺基團，具有“質子海綿效應”、高的電荷密度和較強的緩沖能力，能夠保護核酸免受核酸酶的降解，并能輔助核酸從內涵體中釋放。PEI分為分枝狀和線狀兩種類型，分枝狀的轉染效率優于線狀;對于不同分子量的交聯PEI，低分子量毒性小，但轉染率低于高分子量的PEI;轉染效率隨著偶聯的分枝狀PEI數量增加而增加。PEI作為siRNA載體的機制為：PEI分子中大量的質子化氨基基團可以與siRNA形成非共價的高電解質分子復合物，被細胞內吞后，通過獨特的“質子海綿效應”，增強質子和水的內流，導致細胞內涵體破裂釋放出siRNA到胞漿。

PLGA聚丙交酯乙交酯是乳酸和乙醇酸通過酯鍵連接的共聚物，在體內代謝的最終產物為二氧化碳和水，是一類無毒、生物可降解、生物相容性好的高分子材料。研究表明，影響PLGA納米載體介導siRNA轉染的因素有：溶液pH，納米粒子與siRNA的比例等。

PAMAM是一種有規律的高分散性排列的結構大分子，其結構形狀，表面電荷，分子量大小可以調整，可以通過內部封裝，表面吸附，化學偶聯等來裝載藥物，可以用來遞送siRNA。PAMAM的化學結構表面上有伯胺基，內部有叔胺基，可有效控制粒徑在納米級范圍內，而且可引起“質子海綿”效應，促進siRNA在細胞質中釋放。

（二）脂質類

脂質體（liposome）是在納米水平上高度有序的脂質聚合體，一類球形小泡形狀的脂質雙層膜結構，是由磷脂、膽固醇等膜材包合而成，組織相容性好，制備產物釋放容易，是目前廣泛使用的一種siRNA遞送載體。脂質體一般包括中性脂質體、陽離子脂質體。

核苷酸脂質顆粒（stablenucleicacidlipidparticles，SNALP）即由多種脂質構成。siRNA的SNALP構型現已成功用于小鼠皮下腫瘤的絲/蘇氨酸蛋白激酶（Polo-likekinaselike1PLK1）的沉默研究及食蟹猴的載脂蛋白B（apolipoproteinB，ApoB）沉默研究等多項研究中。利用SNALP來靶向乙型肝炎病毒（HBV），結果顯示：制得的SNALP中的siRNA在體內的穩定性大大增加，血漿半衰期明顯延長，毒性和免疫刺激等不良反應也相應減少。

（三）多肽類

因為多肽的低毒性，被廣泛用來用于siRNA的運送載體材料。但是，相對于其他陽離子材料來說，它不能有效的壓縮核酸以及在細胞質中釋放核酸，因此在用作核酸的載體材料時通常可以選擇性的加以修飾。

來自狂犬病毒糖蛋白（RVG）的短肽使siRNA能夠經過血管傳遞到腦部。在RGV肽的羧基末端采用合成的方法接上9個精氨酸殘基經純化、生物素酰化得到的RVG-9R，將其與siRNA在5%的葡萄糖溶液中混合制得RVG-9R/siRNA復合物。給予綠色熒光蛋白（GFP）轉基因小鼠尾靜脈注射復合物后，會引起特定的外源基因沉默，且只在大腦中發現了GFP基因沉默現象，而在肝和脾臟中均未發現，這說明RVG-9R/siRNA復合物具有腦靶向性，結果表明：該siRNA傳遞載體很有可能應用于病毒性腦炎的治療。

魚精蛋白是人工合成的一段富含精氨酸的蛋白質，有很好地抗原結合能力和轉載能力。Peer等構建了靶向人淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）的抗體-魚精蛋白融合蛋白，并證實其能有效轉運siRNA并特異誘導沉默效應;并以類似方法將魚精蛋白-siRNA包裹在脂質體內，通過全身給藥途徑，成功抑制了小鼠結腸炎模型的疾病進展。

精氨酸—甘氨酸—天門冬氨酸（RGD）是許多黏附蛋白的高度保守氨基酸序列。Todd等采用第三代納米管接上RGD和PEG間斷共載阿霉素（DOX）和siRNA，制得G3-[PEG-RGD]-[DOX]。結果顯示：將阿霉素共載于該納米載體后，與游離阿霉素相比，對惡性膠質瘤U87細胞顯示出更大的細胞毒性，該納米載體所載的siRNA相比于裸siRNA顯示出更強的基因沉默效應。

（四）無機納米顆粒

無機納米顆粒作為siRNA載體能包裹、濃縮、保護siRNA避免核酸酶的降解，幾乎無毒性，制備簡易，保存方便，比表面積大，具有良好的生物相容性和可降解性，穩定性好等優點，具有廣闊的前景。常用的siRNA遞送載體有以下幾種：

金納米顆粒（AuNPs）在用于siRNA遞送載體的過程中，易于被細胞攝取，且無明顯的細胞毒性，可直接通過離子作用、共價鍵或物理吸附作用與藥物、siRNA等相結合，或通過結合PEG或其他形成保護膜的分子，阻止體內納米顆粒的聚合，確保給藥后更長的藥物循環時間。

單壁納米碳管和多壁納米碳管也是具有應用前景的基因靶向遞送材料。Podesta等制備了胺基修飾的MWNT攜帶siRNA的轉運載體，成功延長了荷瘤裸鼠的生存期。

Mccarroll等應用脂質和樹狀聚合物使SWNT功能化，并將其與siRNA形成的復合物注射于小鼠體內，有效沉默ApoB的表達，且注射后48h80%的復合物已從體內清除，證實SWNT并未引起siRNA的聚合，也未抑制體內的生物降解和藥物清除過程。

盡管無機納米載體金納米顆粒以及單壁納米碳管和多壁納米碳管等擁有廣闊的應用前景，但細胞毒性也是要克服的問題。采用表面修飾方法可以提高轉染效率，降低毒性，使其作為siRNA的非病毒載體成為可能。

二、新材料的構想和設計

siRNA具有安全性高、免疫原性低、不受基因大小限制、合成快速等優點，在遞送過程中，醫藥工作者們對于載體開發方面做了大量的工作，但是我們由以上幾類siRNA的非病毒納米載體的了解中，我們可以看到不同的非病毒納米載體有不同的優缺點，因此，將多種載體聯合應用或者設計新型的載體材料勢在必行。

新近報道的一種螺旋狀噬菌體外殼蛋白融合肽DMPGTVLP作為獨特的配體遞送Liposome/siRNA，有較好的靶向性，有望得到廣泛應用。YelenaVachutinsky等人曾設計了一種聚合物膠束用于靶向新生血管的質粒DNA的傳遞，在其基礎上構想了一種新的siRNA的載體材料。制備用二硫鍵交聯的嵌段共聚物膠束，可以提高膠束在細胞外的穩定性，將殼聚糖巰基化，再與聚乙二醇形成共聚物。最后經固化交聯作用形成穩定的膠束。由于聚乙二醇與殼聚糖具有良好的生物相容性與生物可降解性，而RGD作為一種整合物受體識別模塊具有良好的新生血管靶向性，推測該結構將會成為一個比較理想的siRNA的傳遞系統。

三、小結與展望

siRNA作為一種疾病的治療藥物在研究和應用的方面現已經取得很大成功，進一步深入的研究其機制，設計更加優質的載體運載siRNA是目前醫藥工作者以及科研人員的努力方向。隨著現代科學技術的發展、現代藥劑學和分子生物學等學科的不斷進步，我相信在不久的將來，siRNA體內遞送系統的研究工作將會取得突破性進展。

參考文獻：

[1]FireA，XuS，MontgomeryMK，etal.Potentandspecificgeneticinterferentbydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.

[2]ElbashirsM，LendeckelW，TuschlT.RNAinterferenceismediatedby21-and22-nucleotideRNAs[J].GenesDeli.2001，15（2）：188-200.

[3]XieFY，WoodlemC，LuPY.HarnessinginvivosiRNAdeliveryfordrugdiscoveryandtherapeuticdevelopment[J].DrugDiscovToday.2006，11（2）：67-73.

[4]龔建勇.小干擾RNA非病毒載體研究進展[J].藥品評價.2013，10（24）：006-01（九）.

[5]KimDH，RossiJJ.StrategiesforsilencinghumandiseaseusingRNAinterference[J].NatRevGenet.2007，8（3）：173-184.

[6]MaJB，YuanRY，MeisterG，etal.Structuralbasisfor5-end-speci?crecognitionofguideRNAbytheA.fulgidusPiwiprotein[J].Nature，2005，434（7033）：666-670.

[7]MichaelH，etal.SmallinterferingRNA（siRNA）deliveryintomurinebonemarrow-derivedmacrophagesbyelectroporation[J].JImmunologicalMethods，2010，353（1-2）：102-110.

[8]LimMJ，MinSH，LeeJJ，etal.TargetedtherapyofDNAtumorvirus-associatedcancersusingvirus-activatedtranscriptionfactors[J]，MolTher，2006，13（5）：899-909.

[9]HammondSM，BernsteinE，BeachD，etal.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells[J].Nature.2000，404（6775）：293-296.

[10]TakeshitaF，MinakuchiY，NagaharaS，etal.EfficientdeliveryofsmallinterferingRNAtobone-metastatictumorsbyusingatelocollageninvivo[J].ProcNatlAcadScUSA，2005，102（34）：12177-12182.

[11]DavisME，ThefirsttargeteddeliveryofsiRNAinhumansviaaself-assembling，cyclodextrinpolymer-basednanoparticle：fromconcepttoclinic[J].MolPharm，2009，6（3）：659-668.

[12]DavisME，ZuckermanJK，ChoiCH，etal.EvidenceofRNAiinhumanfromsystemicallyadministeredsiRNAviatargetednanoparticle.Nature，2010，464（7291）：1067-1070.

作者簡介：劉麗麗（1979-）女，講師，研究方向：畜禽養殖及疾病防治。

通訊作者：張吉麗（1992-）女，博士，主要從事抗寄生蟲藥物研發工作。