一種苯醚氰菊酯膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

吳小勝 賈芳芳 崔海峰 王兆芹 魏力杰 崔娜 趙正苗 萬宇平

摘要：通過制備苯醚氰菊酯半抗原，研制出一種能夠檢測蔬菜、水果中苯醚氰菊酯的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為1 μg/kg，檢測時間僅為15 min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，該試紙條能夠應用到基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義。

關鍵詞：苯醚氰菊酯;膠體金免疫層析試紙條;快速檢測

中圖分類號：TS201.6;S482.3+5?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0196-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.040

Abstract： To establish a rapid assay for detection of cypermethrin in vegetables and fruit，and gold immunochromatography assay was studied. The limit of detection is 1 μg/kg. And we can obtain the results in 15 minutes. The assay gives no false positive and false negative results. The method is accurate，simple，reliable and convenient to rapidly detect cypermethrinon the spot.

Key words： cypermethrin; gold immunochromatography assay strip; rapid detection

苯醚氰菊酯屬于擬除蟲菊酯類殺蟲劑，擬除蟲菊酯類殺蟲劑是中國應用范圍非常廣泛的農藥種類。苯醚氰菊酯分子式為C24H25NO3，作為新一代衛生殺蟲劑，主要用于防治蚊蠅、蟑螂等害蟲，低毒，目前研究報道較少，檢測方法局限于高效液相色譜法等儀器方法[1-10]。儀器方法較難應用于基層實驗室的大批量樣本檢測，苯醚氰菊酯膠體金免疫層析試紙條較好地解決了該問題。該試紙條能夠檢測蔬菜、水果中的苯醚氰菊酯農藥殘留，靈敏度較高，檢測時間短，檢測方便，是理想的初篩方法，并具有實際應用價值。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

苯醚氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等標準品（純度≥95%）購自北京標準物質研究中心，氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）均購自美國Sigma公司，檸檬酸三鈉、碳酸鉀購自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本復溶液、膠體金分析儀由北京勤邦生物技術有限公司提供;渦旋儀、均質器均購自湖南湘立科學儀器有限公司。

1.2?方法

1.2.1?苯醚氰菊酯半抗原的制備

1）取苯醚氰菊酯（化合物a）0.375 g，加四氫呋喃30 mL溶解，0～5 ℃攪拌20 min，加氫化鋁鋰0.11 g，恢復到室溫，逐漸加熱回流反應4 h。停止反應，加冰水30 mL，乙酸乙酯30 mL×3，萃取3次，合并有機相，蒸干，二氯甲烷/正己烷（V/V，1/10）80 mL重結晶，得到0.34 g產物化合物b，收率91.89%。

2）取0.34 g化合物b，加乙醇50 mL溶解，加1-甲酰基環丙烷-2-羧酸0.12 g，加三乙胺0.1 mL，室溫攪拌8 h，轉移到0～5 ℃攪拌10 min，加硼氫化鈉0.11 g，繼續攪拌1 h。反應停止，旋蒸蒸干，加水30 mL，乙酸乙酯30 mL×3，萃取3次，合并有機相，蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇（V/V，10/1）洗脫分離，得到0.38 g半抗原產物化合物d（圖1），收率為88.37%。

1.2.2?免疫原的制備

1）苯醚氰菊酯半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯物合成。取20 mg化合物d，加2 mL DMF溶解，加17 mg NHS、23 mg EDC，室溫攪拌1 h，得到半抗原活化液A液，取BSA 100 mg，加0.05 mol/L PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃攪拌過夜，0.02 mol/L PB緩沖液透析純化，得到免疫原苯醚氰菊酯-BSA，-20 ℃保存，備用。

2）苯醚氰菊酯半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯物合成。取12 mg化合物d，加2 mL DMF溶解，加11 mg NHS、17 mg EDC，室溫攪拌1 h，得到半抗原活化液A液，取卵清蛋白80 mg，加0.05 mol/L PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃攪拌過夜，0.02 mol/L PB緩沖液透析純化，得到免疫原苯醚氰菊酯-OVA，-20 ℃保存，備用。

1.2.3?膠體金的制備?取0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱至沸騰;一邊攪拌，一邊加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5 mL;待氯金酸水溶液變為酒紅色，繼續煮沸15 min，冷卻后，4 ℃避光保存。

1.2.4?苯醚氰菊酯單克隆抗體-膠體金標記物的制備?在磁力攪拌下，用0.2 mol/L Na2CO3溶液調節膠體金溶液pH至7.2，每毫升膠體金溶液中加入50 μg苯醚氰菊酯單克隆抗體，混勻，靜置10 min，加入10% BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，置4 ℃備用。

1.2.5?標記物凍干?將100 μL苯醚氰菊酯單克隆抗體-膠體金標記物加入到微孔板中，置于冷凍干燥機，冷阱溫度為-50 ℃，預凍3 h，再真空干燥15 h，即得到苯醚氰菊酯單克隆抗體-膠體金標記物凍干的微孔試劑。

1.2.6?檢測方法?向微孔中加入100 mL待檢樣本溶液，混勻，室溫下孵育3 min，吸取70 mL滴至試紙條上，反應10 min，根據圖2判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果。其他時間判讀無效。

1.2.7?樣本檢測限?在空白蔬菜、水果樣本中分別添加苯醚氰菊酯標準品至質量濃度為0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/L，按照“1.2.6”用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據試驗結果確定樣本檢測限。

1.2.8?試紙條的檢測

1）特異性。分別配制500 μg/L氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等藥物，用此試紙條檢測，重復3次，判斷試紙條的特異性。

2）準確性。農業農村部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性。取經儀器確證的50份陰性蔬菜、水果樣品（質量濃度小于1 μg/kg），50份陽性蔬菜、水果樣品（質量濃度大于1 μg/kg），用該試紙條檢測苯醚氰菊酯藥物殘留，計算假陽性率和假陰性率。《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定：試紙條假陽性率應小于5%，假陰性率應為零。

3）穩定性。將試紙條保存于2～8 ℃環境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續測定15個月。具體方法為：分別檢測經儀器確證的20份陰性蔬菜、水果樣品（質量濃度小于1 μg/kg），20份陽性蔬菜、水果樣品（質量濃度大于1 μg/kg），重復測定2次，根據試驗結果判定試紙條的穩定性。

2?結果與分析

2.1?膠體金的鑒定

肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質、透明度較高。取冷卻后的膠體金溶液在透射電鏡下觀察膠體金顆粒的均一程度，測量膠體金顆粒粒徑，經透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布較均勻，粒徑為20 nm左右（圖3）。

2.2?樣本檢測限

配置苯醚氰菊酯濃度分別為0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/L的蔬菜、水果樣品進行檢測，確定檢測限。該試紙條的檢測限為1 μg/kg，結果見表1、圖4、圖5。

2.3?特異性

該試紙條檢測500 μg/L的氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等藥物，結果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好（表2）。

2.4?準確性

用該試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用該試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測結果均為陽性（表3），說明試紙條假陰性率為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。

2.5?穩定性

12個月內，試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求，從第13個月起，試紙條會出現少量失效、假陰性等現象（表4）。

3?討論

目前，有關檢測苯醚氰菊酯的文獻非常有限，通過制備苯醚氰菊酯半抗原，讓其與載體蛋白偶聯得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，對試紙條進行了特異性、準確性、穩定性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時間僅為15 min，檢測限為1 μg/kg，比現有文獻中儀器方法用時更短，操作更簡便。

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