Box-Behnken設計-響應面法優化小槐花中檸檬酚的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝

黃周鋒 胡筱希 黃建猷 譚曉 陸國壽 梁新巧

中圖分類號 R283.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1085-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.12

摘 要 目的：優化小槐花中檸檬酚的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝。方法：以檸檬酚含量為評價指標，乙醇體積分數、固液比、硫酸銨加入量、超聲時間、超聲溫度為考察因素，在單因素試驗的基礎上，使用Box-Behnken設計-響應面法優化小槐花中檸檬酚的提取工藝并進行驗證。結果：小槐花中檸檬酚的最優提取工藝為乙醇體積分數95.35%，固液比1 ∶ 50.35（g/mL），硫酸銨加入量4.49 g，超聲時間48.7 min，超聲溫度57.6 ℃。3次驗證試驗中，檸檬酚的含量分別為0.637 8、0.638 4、0.625 4 mg/g，與預測值（0.630 5 mg/g）相近。結論：優化的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝穩定、可行，可用于小槐花中檸檬酚的提取。

關鍵詞 小槐花;檸檬酚;雙水相提取;超聲提取;Box-Behnken設計;響應面法;工藝優化

Optimization of Ultrasonic-assisted Ethanol-（NH4）2SO4 Aqueous Two-phase Extraction of Citrusinol from Desmodium caudatum by Box-Behnken Design-response Surface Methodology

HUANG Zhoufeng1，2，HU Xiaoxi1，HUANG Jianyou1，TAN Xiao1，LU Guoshou1，LIANG Xinqiao3（1. Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences， Nanning 530022， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Standards， Nanning 530022， China; 3. College of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530022， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize ultrasonic-assisted ethanol-（NH4）2SO4 aqueous two-phase extraction technology of citru- sinol from Desmodium caudatum. METHODS： Using the content of citrusinol as indexes， with ethanol volume fraction， solid-liquid ratio， （NH4）2SO4 addition amount， ultrasonic time and ultrasonic temperature as factors， based on the single factor tests， Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the extraction technology of citrusinol. RESULTS： The optimized extraction technology of citrusinol included that ethanol volume fraction was 95.35%， the solid-liquid ratio was 1 ∶ 50.35 （g/mL）， （NH4）2SO4 addition amount was 4.49 g， ultrasonic time was 48.7 min， ultrasonic temperature was 57.6 ℃. In 3 times of validation tests， the extraction rates of citrusinol were 0.637 8， 0.638 4， 0.625 4 mg/g， respectively， which was close to predicted value （0.630 5 mg/g）. CONCLUSIONS： The optimized ultrasonic-assisted ethanol-（NH4）2SO4 aqueous two-phase extraction technology is stable and feasible， and can be used for the extraction of citrusinol from D. caudatum.

KEYWORDS? ?Desmodium caudatum; Citrusinol; Aqueous two-phase extraction; Ultrasonic extraction; Box-Behnken design; Response surface methodology; Technology optimization

小槐花[Desmodium caudatum（Thunb.）DC.]為豆科山螞蝗屬植物，以全株入藥，為廣西壯、瑤民族常用藥材，被收載于《廣西中藥材標準》[1]、《廣西壯族自治區壯藥質量標準》[2]、《中國瑤藥學》[3]。小槐花壯藥名為棵文沾，瑤藥名為握麻紅，主要分布于廣西、安徽、浙江、江西等省。本課題組前期對壯瑤藥小槐花進行了深入的研究，并從中提取分離出了一種A環并吡喃環黃酮結構的化合物檸檬酚（化學結構見圖1）;隨后的活性研究發現，該化合物可通過破壞人肝癌HepG2細胞的F-actin骨架，阻止紡錘體形成，從而抑制癌細胞的增殖，并呈劑量依賴性，提示檸檬酚具有潛在的抗腫瘤作用[4-9]。

目前，黃酮類化合物多以有機溶劑回流或超聲提取，溶劑用量大且后續處理復雜[10-11]。雙水相提取具有分相快、條件溫和、操作安全方便、污染小等優點，現已廣泛應用于中藥有效成分分離和生物化學等領域[12-15]。中藥中的活性成分大多為微量成分，且初生代謝產物和次生代謝產物共存，因此為提高活性成分的提取效果，本研究以乙醇-硫酸銨為雙水相[16]（與常見的碳酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化銨等鹽相比，硫酸銨在乙醇中的溶解度更低，更利于黃酮類成分的分離），利用超聲與雙水相體系相結合的方法提取小槐花中的檸檬酚;以檸檬酚含量為評價指標，采用Box-Behnken設計-響應面法優化其提取工藝，旨在為小槐花藥材中活性成分的有效提取及其進一步開發利用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）;HH-S2型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）;JJ224BC型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）;KS- 3200DE型超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）;LDZ4-0.8A型離心機（北京醫用離心機廠）。

1.2 藥品與試劑

小槐花藥材采自廣西鹿寨縣，經廣西壯族自治區中醫藥研究院盧文杰主任中藥師鑒定為小槐花[D. caudatum（Thunb.）DC.]的全草，標本存放于廣西壯族自治區中醫藥研究院中藥研究所標本室;檸檬酚對照品（本實驗室自制，HPLC法檢測純度：≥98%）;甲醇為色譜純，磷酸、乙醇、硫酸銨等其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 小槐花粗提物的制備

稱取小槐花藥材600 g，加20倍量（mL/g）50%乙醇，于90 ℃回流提取2次，每次1 h;合并2次提取液，減壓濃縮至200 mL后，加乙醇500 mL醇沉;濾過，濾液蒸干，即得粗提物35.41 g。

2.2 檸檬酚的含量測定

采用HPLC法檢測。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBrige-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（80 ∶ 20，V/V）;測定波長：282 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備 ①對照品貯備液：精密稱取檸檬酚對照品1.0 mg，加無水乙醇定容至5 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）使溶解，制得質量濃度為200 μg/mL的對照品貯備液，備用。②供試品溶液：精密稱取“2.1”項下所得粗提物0.2 g，加無水乙醇定容至50 mL，超聲使溶解，制得供試品溶液。③空白溶液：取適量無水乙醇溶液經超聲處理后，作為空白溶液。

2.2.3 系統適用性試驗 取對照品溶液（50 μg/mL，用無水乙醇將“2.2.2①”項下對照品貯備液稀釋所得）、供試品溶液、空白溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（見圖2）。結果，供試品溶液與對照品溶液在相應位置有相同的色譜峰，且空白溶液對待測物的測定無干擾;理論板數按檸檬酚計不低于2 000，分離度>1.5，表明本方法專屬性強。

2.2.4 線性關系考察 取“2.2.2①”項下對照品貯備液適量，用無水乙醇稀釋，得質量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的系列標準溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質量濃度（c，μg/mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為A=48 790c+64 160（R2=0.999 3），檸檬酚檢測質量濃度的線性范圍為6.25～200 μg/mL。

2.2.5 定量限與檢測限考察 取“2.2.4”項下線性范圍下限質量濃度（6.25 μg/mL）的標準溶液，用無水乙醇倍比稀釋，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結果，檸檬酚的定量限、檢測限分別為293、88 ng/mL。

2.2.6 精密度、重復性與穩定性試驗 ①取“2.2.4”項下50 μg/mL檸檬酚標準溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。結果，檸檬酚峰面積的RSD為1.35%（n=6），表明儀器精密度良好。②取同一批粗提物樣品共6份，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，按外標法計算檸檬酚的含量（mg/g）。結果，樣品中檸檬酚的平均含量為0.587 2 mg/g，RSD為1.01%（n=6），表明本方法的重復性較好。③取同一份供試品溶液，在室溫下分別放置0、2、4、6、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，得檸檬酚峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內的穩定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知檸檬酚含量的小槐花粗提物約1.0 g，共6份，分別加入一定量的對照品貯備液，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算檸檬酚的加樣回收率，結果見表1。

2.3 單因素試驗

精密稱取小槐花粗提物適量，以檸檬酚含量為評價指標，對乙醇體積分數（80%～100%）、固液比[1 ∶ 40～ 1 ∶ 60（g/mL，下同）]、硫酸銨加入量（1.5～5.5 g）、超聲時間（20～60 min）、超聲溫度（30～70 ℃）等因素[13]進行單因素試驗。

2.3.1 乙醇體積分數 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在固液比為1 ∶ 40、硫酸銨加入量為1.5 g、超聲溫度為30 ℃、超聲時間為20 min的條件下，分別用80%、85%、90%、95%、100%乙醇進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標法計算樣品中檸檬酚的含量。結果，乙醇的體積分數可影響雙水相的分水能力，當乙醇體積分數為80%～90%時，檸檬酚含量有隨乙醇體積分數升高而降低的趨勢;當乙醇體積分數>90%時，檸檬酚含量有隨乙醇體積分數升高而升高的趨勢;當乙醇體積分數為100%時，檸檬酚的含量最高，且趨于穩定，詳見圖3A。

2.3.2 固液比 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分數為80%、硫酸銨加入量為1.5 g、超聲溫度為30 ℃、超聲時間為20 min的條件下，分別以固液比1 ∶ 40、1 ∶ 45、1 ∶ 50、1 ∶ 55、1 ∶ 60進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標法計算樣品中檸檬酚的含量。結果，當固液比為1 ∶ 40～1 ∶ 50時，檸檬酚含量有上升的趨勢，提示增加溶劑量可有助于提高檸檬酚的溶出程度;當固液比超過1 ∶ 50后，檸檬酚含量先下降再升高，含量的下降可能與大量雜質溶出有關，詳見圖3B。

2.3.3 硫酸銨加入量 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分數為80%、固液比為1 ∶ 40、超聲溫度為30 ℃、超聲時間為20 min的條件下，分別加入硫酸銨1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 g進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標法計算樣品中檸檬酚的含量。結果，當硫酸銨加入量為1.5～2.5 g時，檸檬酚含量隨著硫酸銨加入量的增加而降低;當硫酸銨加入量為2.5～4.5 g時，檸檬酚含量也隨之增加;當硫酸銨加入量>4.5 g時，檸檬酚含量增加不明顯，且若再繼續加入硫酸銨，則雙水相體系飽和，使得其分相能力減弱，詳見圖3C。

2.3.4 超聲時間 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分數為80%、固液比為1 ∶ 40、超聲溫度為30 ℃、硫酸銨加入量為1.5 g的條件下，分別超聲提取20、30、40、50、60 min。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標法計算樣品中檸檬酚的含量。結果，當超聲時間為20～50 min時，檸檬酚含量呈波浪形上升;而當超聲時間>50 min時，檸檬酚含量有所下降;當超聲時間為50 min時，檸檬酚含量最高，詳見圖3D。

2.3.5 超聲溫度 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分數為80%、固液比為1 ∶ 40、超聲時間為20 min、硫酸銨加入量為1.5 g的條件下，分別在30、40、50、60、70 ℃下進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標法計算樣品中檸檬酚的含量。結果，當超聲溫度為30～50 ℃時，檸檬酚含量的變化并不明顯;當超聲溫度為50～60 ℃，檸檬酚含量明顯上升，且于60 ℃時達到最大值;當超聲溫度>60 ℃時，檸檬酚的含量又有所下降，詳見圖3E。

2.4 Box-Behnken設計-響應面法優化提取工藝

2.4.1 試驗設計 根據“2.3”項下單因素試驗結果和響應面中心組合試驗設計原理，選取乙醇體積分數（A）、固液比（B）、硫酸銨加入量（C）、超聲時間（D）、超聲溫度（E）等5個因素為響應因素，以檸檬酚含量為響應值，運用Design-Expert 8.0.6軟件設計5因素3水平響應面試驗，因素與水平見表2，試驗方案及結果見表3。

2.4.2 模型建立與方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行擬合，并建立二次多元回歸方程：Y=0.630+3.211×10-3A+0.015B-0.010C-0.013D-0.019E-0.045AB+0.015AC+0.048AD+0.018AE-4.720×10-3BC-5.124×10-3BD-0.063BE+2.843×10-3CD+7.192×10-3CE+0.051DE-0.076A2-0.096B2-0.073C2-0.052D2-0.086E2。對其進行方差分析，結果見表4。

由表4中模型的P值（<0.000 1）可知，該模型的擬合程度良好;檸檬酚含量與各試驗因素之間的線性關系顯著（R2=0.953 5），校正系數（R2Adj）為0.916 3，提示91.63%的檸檬酚含量變化可用該模型解釋，因此可用該模型分析和預測檸檬酚含量。由F值可知，5個因素對檸檬酚含量的影響大小為：E（超聲溫度）>B（固液比）>D（超聲時間）>C（硫酸銨加入量）>A（乙醇體積分數）;由各一次項對應的P值可知，除A外，其余因素均對檸檬酚含量具有顯著影響（P<0.05）;由各二次項對應的P值可知，5個因素均對檸檬酚含量具有顯著影響（P<0.000 1）;在交互相中，A與B、A與D、B與E、D與E之間具有顯著的交互作用（P<0.01）。

為進一步評價A與B、A與D、B與E、D與E之間交互作用對檸檬酚含量的影響并確定各因素的最佳水平范圍，本研究采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應面圖和等高線圖，結果見圖4。由圖4可見，上述交互因素的響應面形狀均較陡，等高線均呈明顯的橢圓形，說明各交互作用均較為明顯。求解二次多元回歸方程，得檸檬酚最優提取工藝為乙醇體積分數95.35%，固液比1 ∶ 50.35（g/mL），硫酸銨加入量4.49 g，超聲時間48.7 min，超聲溫度57.6 ℃;預測檸檬酸含量為0.630 5 mg/g。

2.5 驗證試驗

精密稱取小槐花粗提物0.2 g，按“2.4”項下最優工藝平行操作3次，所得檸檬酚的含量分別為0.637 8、0.638 4、0.625 4 mg/g，平均含量為0.633 9 mg/g（RSD=1.15%，n=3），與預測值0.630 5 mg/g相近（實測值與預測值的RSD為1.16%，n=3）。

3 討論

黃酮類化合物在植物體內主要以糖苷形式存在，游離的較少，現多采用回流或者超聲法進行提取[10-11，17]。雙水相提取由于具有操作簡便、分相快等優點，故在中藥成分提取分離中的應用日益廣泛[12]。雙水相體系含水量較高，與植物體內的生理環境相似;反應條件溫和，不容易造成活性成分發生改變;再輔以超聲、微波等手段，可進一步改善提取的效果[18]。乙醇-硫酸銨系統是常見的雙水相體系之一，其分離原理為：無機鹽在溶液中可電離出正、負離子，兩種離子在兩相間的分配系數不同，故而形成電位差，當被提取物進入雙水相體系后，由于其中所含化合物表面性質、電荷作用和分子間作用力的差異，導致其在提取過程中的化學平衡發生了變化，最終使得目標成分轉移至乙醇相，從而增加了目標成分的溶出速度和效率[19-20]。有研究指出，影響雙水相成相的因素很多，如溫度、pH值、雙水相物質組成及含量等;同時，目標成分的結構差異也是能否形成雙水相及各成分在兩相中分布的關鍵因素[21]。因此，對雙水相提取條件進行優化可準確預測體系中的分配規律，從而有效指導該技術的應用。基于此，本研究以檸檬酚含量為指標，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計-響應面法對超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取小槐花中檸檬酚的工藝進行了優化。

在前期預試驗中，本課題組對檸檬酚的定量分析條件進行了篩選，包括流動相（乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.05%磷酸水溶液）、流速（1.0、0.8、0.6 mL/min）、柱溫（20、25、30 ℃）等。綜合考慮色譜響應以及色譜峰峰形、分離度等因素，最終確定了“2.2.1”項的色譜條件。

本研究進一步參考已有文獻[13]，對超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝的乙醇體積分數、固液比、硫酸銨加入量、超聲溫度、超聲時間等5個因素進行單因素試驗;在此基礎上，采用Box-Behnken設計-響應面法對提取工藝進行優化。結果，由回歸模型預測超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取檸檬酚的最佳條件為乙醇體積分數95.35%，固液比1 ∶ 50.35（g/mL），硫酸銨加入量4.49 g，超聲時間48.7 min，超聲溫度57.6 ℃;檸檬酚預測含量為0.630 5 mg/g。經過3次驗證試驗，得檸檬酚的平均含量為0.633 9 mg/g，與預測值相近。檸檬酚為一種A環并吡喃環黃酮類化合物，回流或超聲提取所得產物的含量較低[17]，而本研究優化的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝可大大提高小槐花提取物中該化合物的含量。

綜上所述，本研究優化所得的小槐花中檸檬酚的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝穩定、可行。中藥成分復雜，傳統分離手段步驟繁多且耗時長，雙水相作為一種綠色環保的新型分離技術，可簡化樣品前處理過程，易于放大生產且可連續化操作，有助于單體化合物的分離[12-15]。但該法在應用時也存在一些不足，如分離選擇性偏低、易乳化、相分離時間較長等，后續可結合聯用高速逆流色譜、電泳等技術[22]來進一步提高提取效率。

參考文獻

[ 1 ] 廣西壯族自治區衛生廳.廣西中藥材標準：第1冊[S]. 1990年版.南寧：廣西科學技術出版社，1990：24.

[ 2 ] 廣西壯族自治區食品藥品監督管理局.廣西壯族自治區壯藥質量標準：第1卷[S].南寧：廣西科學技術出版社，2008：49.

[ 3 ] 覃迅云，羅金裕，高志剛.中國瑤藥學[M].北京：民族出版社，2002：934.

[ 4 ] 盧文杰，陸國壽，譚曉，等.壯瑤藥小槐花化學成分研究[J].中藥材，2013，36（12）：1953-1956.

[ 5 ] 劉瑛，陸國壽，盧文杰，等.檸檬酚對人肝癌HepG2細胞增殖的影響[J].天然產物開發與研究，2017，29（1）：135-140.

[ 6 ] 陸國壽，葉勇，盧文杰，等.壯、瑤藥小槐花中異檸檬酚的分離鑒定及含量測定研究[J].天然產物開發與研究，2014，26（9）：1450-1453.

[ 7 ] 陸國壽，譚曉，陳家源，等.小槐花中的脂溶性成分分析[J].廣西科學，2012，19（4）：355-357.

[ 8 ] 李燕婧，鐘正賢，盧文杰.小槐花水提物藥理作用研究[J].中醫藥導報，2013，19（4）：76-78.

[ 9 ] 李燕婧，鐘正賢，盧文杰.小槐花醇提物藥理作用研究[J].云南中醫中藥雜志，2013，34（5）：64-65.

[10] 李曉斌，陳振斌，楊旸，等.響應面分析法優化槐葉中黃酮類化合物的提取工藝[J].中國藥房，2015，26（7）：960- 964.

[11] 羅旭東，李成義，李俊岳，等.當歸葉總黃酮提取工藝優化[J].遼寧中醫雜志，2018，45（7）：1456-1459.

[12] 劉磊磊，李秀娜，趙帥.雙水相萃取在中藥活性成分提取分離中的應用進展[J].中草藥，2015，46（5）：766-773.

[13] 何自強，張惠玲，蘇天明.響應面法優化超聲波輔助乙醇-K2HPO4雙水相提取紅景天苷[J].天然產物研究與開發，2018，30（7）：1257-1265.

[14] 宋力飛，劉常青，李曼莎，等.星點設計-響應面法優化黃芪雙水相萃取工藝[J].中成藥，2017，39（1）：71-75.

[15] 張琳，周欣，趙鳳平，等.乙醇-硫酸銨雙水相提取陳皮黃酮工藝的優化[J].中成藥，2018，40（7）：1510-1514.

[16] 趙立輝，武文潔，楊昱涵.雙水相系統純化山楂葉黃酮類物質的研究[J].天然產物研究與開發，2009，21（5）：849-853.

[17] 邢東旭，廖森泰，李慶榮，等.僵蠶總黃酮超聲提取工藝的優化[J].中成藥，2017，39（8）：1727-1730.

[18] 朱紅菊，丁玉，賈亞偉，等. 桔皮中橙皮苷的新型雙水相萃取[J].食品與生物技術學報，2013，32（9）：995-1001.

[19] 肖星輝，張向前，李桂芳，等.雙水相萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮及其抗氧化活性[J].食品研究與開發，2017，38（16）：5-9.

[20] 陳麗娟，柳福智，岳強兵.正交試驗法優化微波協同雙水相提取甘草中總黃酮的工藝[J].中國藥房，2016，27（4）：525-528.

[21] 劉紹鵬，宗志敏，魏晴，等.雙水相體系中成相及有機物分配機理的初步研究[J].化工時刊，2010，24（12）：21-24.

[22] 李挺，曹學麗，董銀卯.雙水相體系逆流色譜技術在蛋白質分離中的應用[J].中國生物工程雜志，2006，26（2）：83-88.

（收稿日期：2019-08-07 修回日期：2020-02-07）

（編輯：張元媛）