基于Notch信號(hào)通路的黃芩素抑制急性肺栓塞模型大鼠血小板聚集及肺組織保護(hù)作用機(jī)制研究

吳忠勇 王金忠 周森 林明 王小智

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）09-1091-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.13

摘 要 目的：探索黃芩素抑制急性肺栓塞模型大鼠血小板聚集及肺組織保護(hù)作用的機(jī)制。方法：將36只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=6）和造模組（n=30），造模組大鼠采用自體血栓法復(fù)制急性肺栓塞模型，正常對(duì)照組大鼠行假手術(shù)。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽性藥物組（低分子肝素鈣0.01 mL/kg，皮下注射）和黃芩素低、中、高劑量組（25、50、100 mg/kg，腹腔注射），每組6只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，各給藥組大鼠給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)給藥7 d。給藥結(jié)束后，檢測(cè)大鼠血漿二磷酸腺苷（ADP）和花生四烯酸（AA）活化后的血小板聚集率及血小板活化指數(shù)（RPI）;采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清中血小板活化標(biāo)志物血小板顆粒膜蛋白（CD62P）和溶酶體顆粒膜蛋白（CD63）以及生長(zhǎng)分化因子15（GDF-15）、N端B型利鈉肽（NT-proBNP）水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)大鼠肺組織中Notch2、Notch3及Notch信號(hào)配體DLL1、JAG2 mRNA表達(dá)水平;分別采用免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血漿ADP活化后血小板聚集率、AA活化后血小板聚集率、RPI值以及血清中CD62P、CD63、GDF-15、NT-proBNP水平均顯著升高（P<0.05）;肺組織處于嚴(yán)重炎性浸潤(rùn)狀態(tài);肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，黃芩素各劑量組大鼠上述指標(biāo)變化均顯著改善（P<0.05）。結(jié)論：黃芩素能夠降低急性肺栓塞模型大鼠血小板聚集，改善大鼠肺組織病理狀態(tài);其機(jī)制可能與激活Notch信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芩素;急性肺栓塞;Notch信號(hào)通路;血小板聚集;大鼠;機(jī)制

Study on Mechanism of Platelet Aggregation Inhibitory Effects and Lung Tissue Protective Effects of Baicalein in Model Rats with Acute Pulmonary Embolism Based on Notch Signaling Pathway

WU Zhongyong，WANG Jinzhong，ZHOU Sen，LIN Ming，WANG Xiaozhi（Dept. of Critical Medicine， the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570311， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the mechanism of baicalein platelet aggregation inhibitiory effect and lung tissue protective effect of baicalein in model rats with acute pulmonary embolism. METHODS： Totally 36 rats were randomly divided into normal control group （n=6） and modeling group （n=30）. The acute pulmonary embolism model was established by autologous thrombus replication in modeling group， and the sham operation of rats in normal control group was carried out. After modeling， 30 model rats were randomly divided into model control group， positive drug group （low molecular weight heparin calcium 0.01 mL/kg， subcutaneous injection）， baicalein low-dose， middle-dose and high-dose groups （25， 50， 100 mg/kg， intraperitoneal injection）， with 6 rats in each group. Normal control group and model control group were intraperitoneally injected constant volume of normal saline; administration groups were given relevant medicine， once a day， for consecutive 7 d. After medication， platelet aggregation rates of rats after activated with adenosine diphosphate （ADP） and arachidonic acid （AA） and platelet activation index （RPI） were detected; lung histopathology was observed by HE staining; serum platelet activation markers granule membrane （CD62P） and lysosomal membrane glycoprotein （CD63）， growth differentiation factor-15 （GDF-15） and N-terminal B-type natriuretic peptide （NT-proBNP） were measured by ELISA. The mRNA expression levels of Notch2， Notch3 and Notch signaling ligand PLL1， JAG2 were detected by RT-PCR method. The protein expression levels of Notch2， Notch3， DLL1 and JAG2 in lung tissue were detected by immunohistochemistry and Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal control group， plasma ADP-activated platelet aggregation rate， AA-activated platelet aggregation rate， RPI， serum levels of CD62P， CD63， GDF-15 and NT-proBNP were increased significantly （P<0.05）. The lung tissue of rats was in a state of severe inflammatory infiltration. mRNA and protein expression levels of Notch2， Notch3， DLL1 and JAG2 in lung tissue decreased significantly （P<0.05）. Compared with model control group， changes of above indexes of rats were improved significantly in baicalein groups （P<0.05）. CONCLUSIONS： Baicalein can reduce platelet aggregation and improve the pathological state of lung tissue in rats with acute pulmonary embolism. Its mechanism may be related to activating Notch signal pathway.

KEYWORDS Baicalein; Acute pulmonary embolism; Notch signal pathway; Platelet aggregation; Rat; Mechanism

急性肺栓塞是指由于體循環(huán)的各種栓子脫落阻塞肺動(dòng)脈及其分支引起肺循環(huán)障礙的臨床病理生理綜合征，其發(fā)病率僅次于冠心病及高血壓，目前臨床上主要采用低分子肝素進(jìn)行治療[1-3]。Notch信號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的多個(gè)物種之中，主要通過調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡來影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[4-5]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白的水平異常與肺組織的發(fā)育和損傷修復(fù)密切相關(guān)[6-7]。黃芩素是從唇形科植物高黃芩（Scutellaria altissima L.）中提取分離得到的單體化合物。研究表明，黃芩素具有抗炎、抗免疫、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、修復(fù)肺組織損傷及保護(hù)肺功能等藥理作用[8-10]。隨著研究的深入，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃芩素與地塞米松、長(zhǎng)春新堿、來那度胺等藥物聯(lián)合使用后，能夠通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)白血病、骨髓瘤等疾病的治療作用[11]。但有關(guān)黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，目前尚無文獻(xiàn)明確報(bào)道。因此，本研究通過考察黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠血小板聚集的抑制及對(duì)肺組織的保護(hù)作用，并從Notch信號(hào)通路角度探討其作用機(jī)制，為黃芩素的藥理作用研究提供新的思路和參考。

1 材料

1.1 儀器

AD340型酶標(biāo)儀（美國Beckman Coulter公司）;DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀、DYCZ-40G型轉(zhuǎn)印電泳儀（北京海天友誠科技有限公司）;T-100 型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀、Gel Doc XR型凝膠成像儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司];DFC360 FX型熒光顯微鏡（德國 Leica 公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芩素對(duì)照品（武漢遠(yuǎn)啟醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20180623，純度：>98%）;低分子肝素鈣注射液[葛蘭素史克（中國）投資有限公司，批號(hào)：20180726，規(guī)格：0.5 mL];肝素（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號(hào)：20190622，純度：>98%）;Notch2、Notch3兔單克隆抗體以及RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、RNA提取試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒2X PCR Master Mix（碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：AF7590、AF7592、P0013B、P0018S、R0011、D7170M、D7228）;Notch信號(hào)配體DLL1兔單克隆抗體、Notch信號(hào)配體JAG2兔單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（lgG）二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20230-1-AP 、19696-1-AP 、10494-1-AP、SA00001-2）;血漿二磷酸腺苷（ADP）溶液（上海榕柏生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：RBX-82154）;花生四烯酸（AA）溶液（上海滬崢生物科技有限公司，批號(hào)：HZD-2312）;血小板顆粒膜蛋白（CD62P）、血小板溶酶體顆粒膜蛋白（CD63）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海博麥德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201853062、201847218）;生長(zhǎng)分化因子15（GDF-15）、N端B型利鈉肽（NT-proBNP）? ELISA檢測(cè)試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)：20352614、19263357）;Notch2、Notch3、DLL1、JAG2、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的特異性引物均由上海生物工程股份有限公司合成。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)健康成年SD大鼠36只，雄性，6周齡，體質(zhì)量（180±20） g，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0003。大鼠于溫度（22±2） ℃、濕度（50±10）%的動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 急性肺栓塞大鼠模型的建立

將36只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=6）和造模組（n=30）。參照文獻(xiàn)方法[12]，造模組大鼠采用自體血栓法復(fù)制急性肺栓塞模型：先從大鼠自身眼眶靜脈取血，制成直徑為0.5 mm大小的顆粒狀血栓混懸液;然后腹腔注射7%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，鈍性分離右頸靜脈，迅速從右頸總靜脈注入0.5 mL血栓混懸液（約15～20個(gè)血栓）。當(dāng)大鼠出現(xiàn)明顯發(fā)紺和呼吸加快、加深時(shí)，則視為造模成功。正常對(duì)照組大鼠行假手術(shù)（除不注入血栓混懸液外，其余與造模組同法操作）。將造模成功的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、陽性藥物組和黃芩素低、中、高劑量組，每組6只。黃芩素低、中、高劑量組大鼠分別腹腔注射25、50、100 mg/kg黃芩素[13]（以生理鹽水為溶劑），陽性藥物組大鼠皮下注射0.01 mL/kg低分子肝素鈣[14]，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥7 d[14]。末次給藥24 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.2 大鼠血漿血小板聚集率和血小板活化指數(shù)（RPI ）測(cè)定

自大鼠眼眶后靜脈叢取血，置于含有肝素的抗凝管中，一部分血液樣本以800 r/min離心10 min，取上清液，即得富血小板血漿（PRP）;剩余部分血漿以3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得貧血小板血漿（PPP）。對(duì)血漿中的血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)后，用 PPP 調(diào) PRP 中血小板數(shù)至 3×109～4×109 L-1，然后取調(diào)節(jié)后血漿250 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育5 min，分別加入誘導(dǎo)劑ADP溶液（5 μmol/L）和AA溶液（5 mmol/L）各10 μL，用血小板聚集儀測(cè)量血小板最大聚集率。另一部分血液樣本分別用乙二胺四乙酸（EDTA）及含4%甲醛的EDTA溶液稀釋，并通過全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)血液樣本中紅細(xì)胞和血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算PRI：PRI=[血小板計(jì)數(shù)（EDTA）/血小板計(jì)數(shù)（EDTA-4%甲醛）]×K。式中K為校正系數(shù)，K=紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（EDTA）/紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（EDTA-4%甲醛）。

2.3 大鼠血清中CD62P和CD63水平檢測(cè)

采用ELISA 法進(jìn)行檢測(cè)。自大鼠眼眶后靜脈叢取血，置于干凈離心管中，4 ℃下靜置4 h，然后在4 ℃下以3 500 r/min離心10 min。取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)血小板活化標(biāo)志物CD62P和CD63水平。

2.4 大鼠血清中GDF-15和NT-proBNP水平檢測(cè)

采用ELISA 法進(jìn)行檢測(cè)。大鼠眼眶采血后，用7%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，置于干凈離心管中，4 ℃下靜置4 h，然后在4 ℃下以3 500 r/min離心10 min。取上層血清，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測(cè)GDF-15和NT-proBNP水平。

2.5 大鼠肺組織病理學(xué)變化觀察

采用蘇木精-伊紅染色（HE）法進(jìn)行觀察。大鼠腹主動(dòng)脈取血后處死，迅速分離肺組織，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈表面血液，并用濾紙吸干表面水分后，放入10%中性甲醛中固定24 h，常規(guī)制備5 μm組織切片并行HE染色后，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2.6 大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取大鼠肺組織，按照RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA，檢驗(yàn)其純度后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA 5 μL，2X PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，雙蒸水定容至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔct法計(jì)算Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA的表達(dá)水平。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

2.7 大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

2.7.1 免疫組化法檢測(cè) 將大鼠肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制備3 μm切片。切片常規(guī)脫蠟至水，以3%雙氧水室溫下封閉20 min，以枸櫞酸鹽緩沖液加熱抗原修復(fù)，以5%胎牛血清（BSA）封閉，在37 ℃下放置30 min;滴加Notch2、Notch3、DLL1、JAG2一抗? ? （1 ∶ 200），4 ℃過夜。次日使用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，依操作順序加入二抗（1 ∶ 100），37 ℃下孵育15 min，PBS沖洗;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（試劑C），37 ℃下孵育15 min，PBS沖洗;室溫下以二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，封片。采用顯微鏡觀察，在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽性細(xì)胞，并根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)算免疫組化積分。將陽性細(xì)胞按染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分（染色深淺需與背景比較）。再將陽性細(xì)胞按所占的百分比進(jìn)行評(píng)分：陰性為0分，陽性細(xì)胞比例≤10%為1分，陽性細(xì)胞比例在>10%～50%之間為2分，陽性細(xì)胞比例在>50%～75%之間為3分，陽性細(xì)胞比例>75%為4分。兩者評(píng)分的乘積即為免疫組化表達(dá)積分[15]。

2.7.2 Western blotting法檢測(cè) 取大鼠肺組織放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液（每20 mg組織加入200 μL蛋白裂解液），勻漿，直至充分裂解。將勻漿液在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，將上清液移至另一干凈離心管中，并加入上樣緩沖液，混勻，100 ℃下水浴5 min，采用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣后，在300 mA、80 V條件下電泳至指示劑溴酚藍(lán)遷移至分離膠與濃縮膠的分界處，調(diào)節(jié)電壓為120 V，繼續(xù)電泳至蛋白分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量切割目標(biāo)蛋白，并在300 V、170 mA條件下轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封閉液室溫下封閉1 h，分別經(jīng)Notch2、Notch3、DLL1、JAG2和GAPDH抗體（1 ∶ 1 000）孵育后，4 ℃下過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗（1 ∶ 2 000），室溫下孵育1 h。PBST清洗后顯色液顯影，采用凝膠成像儀成像，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度值檢測(cè)，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠血漿血小板聚集率及RPI的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血漿ADP活化后血小板聚集率、AA活化后血小板聚集率及RPI值均顯著升高（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，黃芩素各劑量組以及陽性藥物組大鼠血漿ADP活化后血小板聚集率、AA活化后血小板聚集率及RPI值均顯著降低（P<0.05），且黃芩素的作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴趨勢(shì)。各組大鼠血漿血小板聚集率及RPI值測(cè)定結(jié)果見表2。

3.2 黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠血清中CD62P和CD63水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中CD62P、CD63水平顯著升高（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，黃芩素各劑量組以及陽性藥物組大鼠血清中CD62P、CD63水平均顯著降低（P<0.05），且黃芩素的作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴趨勢(shì)。各組大鼠血清中CD62P、CD63水平測(cè)定結(jié)果見表3。

3.3 黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠血清中GDF-15和NT-proBNP水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中GDF-15、NT-proBNP水平顯著升高（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，黃芩素各劑量組以及陽性藥物組大鼠血清中GDF-15、NT-proBNP水平均顯著降低（P<0.05），且黃芩素的作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴趨勢(shì)。各組大鼠血清中GDF-15、NT-proBNP水平測(cè)定結(jié)果見表3。

3.4 黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠組織病理學(xué)的影響

正常對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)明顯病理學(xué)變化。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織肺泡滲出較多，肺泡間隔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見肺組織水腫。與模型對(duì)照組比較，黃芩素低、中劑量組大鼠肺泡水腫減輕，但肺泡間隔內(nèi)仍有大量炎性細(xì)胞聚集;黃芩素高劑量組及陽性藥物組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肺泡滲出和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。各組大鼠肺組織病理學(xué)檢查顯微圖見圖1。

3.5 黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，黃芩素各劑量組及陽性藥物組大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），且黃芩素的作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴趨勢(shì)。各組大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表4。

3.6 黃芩素對(duì)急性肺栓塞模型大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與模型對(duì)照組比較，黃芩素各劑量組及陽性藥物組大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），且黃芩素的作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴趨勢(shì)。各組大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2蛋白表達(dá)免疫組化法檢測(cè)染色顯微圖見圖2，免疫組化表達(dá)積分檢測(cè)結(jié)果見表5;上述蛋白表達(dá)Western blotting法檢測(cè)電泳圖見圖3，蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見表6。

4 討論

急性肺栓塞患者體內(nèi)血栓阻塞肺動(dòng)脈后，一方面會(huì)伴有肺組織壞死等病理過程，進(jìn)而導(dǎo)致疾病進(jìn)一步惡化;另一方面，血栓會(huì)使肺組織血管的血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，誘導(dǎo)血小板活化，引起血小板聚集，導(dǎo)致血栓進(jìn)一步加重、肺組織壞死范圍不斷擴(kuò)大[1-3]。目前，臨床常采用皮下注射低分子肝素的方法進(jìn)行急性肺栓塞的治療，故本研究采用低分子肝素鈣作為陽性藥物。GDF-15和NT-proBNP是心肌組織病理性損傷的重要標(biāo)志物[15]。急性肺栓塞發(fā)病后，通常會(huì)引起心肌組織細(xì)胞損傷、心衰等變化[16]。研究表明，急性肺栓塞患者血清中GDF-15、NT-proBNP水平的升高會(huì)使患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加[2-5]。CD62P和CD63是血小板活化釋放的特異性標(biāo)志物，可反映機(jī)體血小板的活化程度及血栓形成傾向，CD62P、CD63的異常升高標(biāo)志著機(jī)體內(nèi)血小板的高度活化，可誘發(fā)或進(jìn)一步加重血栓性疾病[17]。

Notch通路的激活及信號(hào)傳遞是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體的相互作用，Notch蛋白經(jīng)過3次剪切，由胞內(nèi)段（NICD）釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，進(jìn)而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[4-7]。近年來的研究表明，Notch信號(hào)通路的表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切：Notch信號(hào)通路的過度激活可以誘發(fā)肺癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步惡化、轉(zhuǎn)移;同時(shí)，Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的異常表達(dá)與心肌缺血再灌注損傷、腦梗死、肺纖維化、腎缺血再灌注損傷等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-5，18]。Notch2、Notch3、DLL1、JAG2是Notch信號(hào)通路中重要的受體蛋白，其在哺乳動(dòng)物肺組織中均有不同程度的表達(dá)，且參與肺泡、氣道表皮細(xì)胞損傷修復(fù)等生理過程[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，連續(xù)給藥7 d后，黃芩素各劑量組大鼠血漿中ADP活化后血小板聚集率、AA活化后血小板聚集率、RPI值、血清血小板活化標(biāo)志物CD62P和CD63水平以及血清GDF-15、NT-proBNP水平均顯著降低。這提示黃芩素能夠顯著降低急性肺栓塞模型大鼠的血小板顆粒膜蛋白水平、抑制血小板進(jìn)一步活化聚集，進(jìn)而抑制大鼠肺栓塞癥狀及肺栓塞的進(jìn)一步加重，并且可修復(fù)急性肺栓塞引起的心肌細(xì)胞損傷，降低急性肺栓塞大鼠心衰等并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，黃芩素各劑量組大鼠組織病理學(xué)狀態(tài)均有不同程度的改善。同時(shí)，黃芩素各劑量組大鼠肺組織中Notch2、Notch3、DLL1、JAG2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，這提示黃芩素能夠升高急性肺栓塞模型大鼠肺組織Notch通路相關(guān)蛋白水平，改善急性肺栓塞疾病狀態(tài)下Notch通路的過度抑制，激活Notch通路，恢復(fù)相關(guān)蛋白的正常表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)急性肺栓塞模型大鼠的改善作用。

綜上所述，黃芩素能夠抑制急性肺栓塞模型大鼠血小板的聚集，改善大鼠肺組織病理狀態(tài)，其機(jī)制可能與激活Notch信號(hào)通路有關(guān)。

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（收稿日期：2019-12-31 修回日期：2020-02-21）

（編輯：林 靜）