沙苑子多糖促進兔半月板纖維軟骨細胞增殖的作用機制研究

沈驊睿 敖亮 王立勝 汪國友 郝琦 李婷

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1097-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.14

摘 要 目的：研究沙苑子多糖促進兔半月板纖維軟骨細胞（以下簡稱“軟骨細胞”）增殖的作用機制。方法：分離1月齡新西蘭大白兔軟骨細胞。將軟骨細胞分為正常對照組（PBS）、陽性對照組（硫酸氨基葡萄糖，10 mg/mL）和沙苑子多糖高、中、低（40、20、10 mg/mL）劑量組，分組給藥干預。采用光學顯微鏡觀察軟骨細胞的形態學特征;采用MTT法檢測軟骨細胞增殖抑制率，并用流式細胞術觀察細胞周期;采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白（Col Ⅱ）、堿性磷酸酶蛋白（ALP）的表達水平;采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應和Western blotting法檢測轉化生長因子β1（TGF-β1）、骨形態發生蛋白2（BMP-2）mRNA及蛋白的表達水平。結果：軟骨細胞培養72 h后，細胞融合成單層，多數呈現細長梭型外觀。與正常對照組比較，陽性對照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組軟骨細胞的增殖抑制率、G1/G0期細胞百分比均顯著降低（P<0.05），S期細胞百分比和Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平及TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）。與陽性對照組比較，沙苑子多糖高劑量組軟骨細胞的增殖抑制率、G1/G0期細胞百分比均顯著降低（P<0.05），S期細胞百分比和Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平及TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）;沙苑子多糖低劑量組軟骨細胞的增殖抑制率、G1/G0期細胞百分比均顯著升高（P<0.05），S期細胞百分比和Col Ⅱ、ALP蛋白及TGF-β1、BMP-2 mRNA和蛋白的相對表達水平均顯著降低（P<0.05）;沙苑子多糖中劑量組上述指標差異均無統計學意義。結論：沙苑子多糖可促進軟骨細胞增殖，降低G1/G0期細胞百分比，促進細胞向S期轉化;其作用機制可能與上調TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達，促進Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平升高有關。

關鍵詞 沙苑子多糖;半月板;纖維軟骨細胞;增殖;Ⅱ型膠原蛋白;堿性磷酸酶蛋白;轉化生長因子β1;骨形態發生蛋白2;機制

Study on the Mechanism of Enhancement Effects of Astragalus complanatus Polysaccharides on the Proliferation of Meniscal Fibrochondrocyte Cells in Rabbits

SHEN Huarui1，AO Liang1，WANG Lisheng1，WANG Guoyou1，HAO Qi1，LI Ting2（1.Dept. of Joint Surgery， the Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine of Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China;2.School of Pharmacy， Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mechanism of enhancement effects of Astragalus complanatus polysaccharides （ACP） on the proliferation of meniscal fibrochondrocytes cells in rabbits. METHODS： The meniscal fibrochondrocytes cells were isolated from 1-month-old New Zealand white rabbits. The meniscal fibrochondrocytes cells were divided into normal control group （PBS）， positive control group （glucosamine sulfate， 10 mg/mL） and ACP high-dose， medium-dose and low-dose groups （40， 20， 10? ? ?mg/mL）. The morphology of meniscal fibrochondrocytes cells were observed under microscope. Cell proliferation rate was detected by MTT assay. Cell cycle was observed with flow cytometry. ELISA assay was used to detect relative expression of medium collagen type Ⅱ （Col Ⅱ） and alkaline phosphatase protein （ALP） in meniscal fibrochondrocytes cells. RT-qPCR and Western blotting assay were adopted to detect mRNA and protein expression of transforming growth factor β1 （TGF-β1） and bone morphogenetic protein 2 （BMP-2）. RESULTS： After cultured for 72 h， meniscal fibrochondrocytes cells were fused into a single layer， and most of them were slender type in appearance. Compared with normal control group， the proliferation rate of meniscal fibrochondrocytes cells and the percentage of cells at G1/G0 phase were decreased significantly in positive control group and ACP high-dose， medium-dose and low-dose groups （P<0.05）; the percentage of cells at S phase， protein expression of Col Ⅱ and ALP， mRNA and protein expression of TGF-β1 and BMP-2 were increased significantly （P<0.05）. Compared with positive control group， inhibitory rate of meniscal fibrochondrocytes cells proliferation and the percentage of cells at G1/G0 phase were decreased significantly in ACP high-dose group （P<0.05）， while the percentage of cells at S phase， protein expression of Col Ⅱ and ALP， mRNA and protein expression of TGF-β1 and BMP-2 were increased significantly （P<0.05）. The inhibitory proliferation rate of meniscal fibrochondrocytes cells and the percentage of cells at G1/G0 phase were increased significantly in ACP low-dose group （P<0.05）， while the percentage of cells at S phase， protein expression of Col Ⅱ and ALP， mRNA and protein expression of TGF-β1 and BMP-2 were decreased significantly （P<0.05）. There was no statistical significance in above indexes of ACP medium-dose group. CONCLUSIONS： ACP can promote the proliferation of meniscal fibrochondrocytes cells， reduce the percentage of cells at G1/G0 phase， promote cell transformation to S phase; the mechanism of which may be related to up-regulating TGF-β1， BMP-2 mRNA and protein expression， promoting Col Ⅱ and ALP protein expression enhancement.

KEYWORDS? ?Astragalus complanatus polysaccharides; Meniscal fibrochondrocytes cells; Proliferation; Col Ⅱ; ALP; TGF-β1; BMP-2; Mechanism

半月板是膝關節的重要組成部分，具有載荷、吸收震蕩、潤滑、增加關節接觸面、營養關節軟骨等功能，而半月板損傷會導致關節不穩定、甚至出現骨性關節炎[1]。據統計，我國每10萬人中發生半月板損傷的患者約為60～70人[2]。半月板損傷患者多接受保留半月板或半月板重建和移植的治療辦法，但其療效仍存在較大的提升空間[3-4]。因此，研究半月板損傷治療的新途徑符合臨床需求。纖維軟骨細胞和細胞外基質構成了半月板外部結構，纖維軟骨細胞可從半月板中直接取出并進行體外培養、傳代，是研究半月板損傷修復的重要細胞來源[5]。

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪（Astragalus complanatus R.Br.）的干燥成熟種子，歸肝腎經，具有補腎助陽、養肝明目等功效[6]。沙苑子多糖為沙苑子的主要有效成分，相關研究表明，沙苑子多糖具有體外促成骨細胞增殖的作用[7]。但是，沙苑子多糖對半月板纖維軟骨細胞（以下簡稱“軟骨細胞”）的增殖是否有促進作用，目前尚未見文獻報道。

關節軟骨的主要成分是膠原蛋白，其中Ⅱ型膠原蛋白（Col Ⅱ）是軟骨細胞外基質的主要成分之一，具有抵抗外界壓力、維持軟骨結構的作用，其表達水平升高是軟骨細胞增殖的特征性指標[8]。堿性磷酸酶（ALP）是軟骨發育過程中的關鍵酶蛋白，其水平升高與軟骨細胞的分化與成熟密切相關[9]。轉化生長因子β（TGF-β）超家族對骨形成、纖維化、傷口愈合具有調節作用[10]，其中TGF-β1是骨重建的關鍵因子，參與軟骨細胞的增殖、分化、死亡等過程[11]。骨形態發生蛋白2（BMP-2）也是TGF-β超家族成員之一，是關節修復過程中必不可少的蛋白[12]。基于此，本文研究沙苑子多糖對軟骨細胞增殖的促進作用，并檢測細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白和TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白的表達水平變化，以期深入了解沙苑子多糖的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

Gallios型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）;Multiskan fc型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;BPN-50CHUV型二氧化碳培養箱（青島名博環保科技有限公司）; ECO 48型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（英國PCRmax公司）;MP4型垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）;XSP-12CAC型光學顯微鏡（上海締倫光學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

沙苑子多糖（陜西斯諾特生物技術有限公司，批號：171211C，純度：≥96%）;四唑鹽（MTT）比色法檢測試劑盒（北京群曉科苑生物技術有限公司，批號：YS171211A）;反轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號：180223CC）;RT-PCR試劑盒（南京威特森生物技術有限公司，批號：180115001）;細胞裂解液（南京碧云天生物技術研究所，批號：180221A）;胰蛋白酶（批號：20150623）、Ⅱ型膠原酶（批號：1225C071）均購自北京索萊寶生物科技有限公司;Col Ⅱ酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號：1803110001）、ALP ELISA試劑盒（批號：1802150002）均購自武漢云克隆科技股份有限公司;流式細胞周期檢測試劑盒（美國Biovision公司，批號：YLN180111002）;Col Ⅱ兔單克隆抗體（批號：1801002）、ALP兔單克隆抗體（批號：1802005）、TGF-β1兔單克隆抗體（批號：1804001）、BMP-2兔單克隆抗體（批號：1804009）、β-肌動蛋白（β-actin，批號：2015052250）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號：1711160）均購自美國Abcam公司;PCR引物合成由南京科佰生物科技有限公司完成。

1.3 動物

SPF級新西蘭大白兔1只，雄性，1月齡，體質量0.75 kg，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，動物生產許可證號：SCXK（甘） 2018-0001。

2 方法

2.1 細胞分離

參考文獻方法[13-14]分離軟骨細胞。將新西蘭大白兔適應性喂養1周后，剖取四肢膝關節半月板并剪碎成顆粒，加入0.25%的胰蛋白酶后置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化30 min;以1 500 r/min離心15 min，棄上清，向沉淀中加入0.3%Ⅱ型膠原酶后置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化4 h;取上層懸液，以1 500 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入含10% 胎牛血清的DMEM培養基進行重懸，再以5×104個/mL接種在細胞培養瓶中，于5%CO2、37 ℃條件下培養，備用。

2.2 沙苑子多糖對軟骨細胞形態的影響觀察

將軟骨細胞以5×104個/孔接種于96孔板中，分為正常對照組、陽性對照組（硫酸氨基葡萄糖，10 mg/mL，劑量根據臨床用藥劑量及預試驗結果確定）和沙苑子多糖高、中、低劑量組（40、20、10 mg/mL，劑量根據文獻[15]及預試驗確定），每組設置3個復孔，加入相應藥物（用磷酸鹽緩沖液配制），正常對照組加入等體積PBS。各組細胞于5%CO2、37 ℃條件下培養0、48、72 h后，用光學顯微鏡觀察軟骨細胞的生長情況。

2.3 沙苑子多糖對軟骨細胞增殖抑制率的影響考察

采用MTT法檢測。將軟骨細胞以5×104個/孔接種于96孔板中，按“2.2”項下方法進行分組和給藥，每組設置5個復孔，并于藥物干預24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h。棄細胞培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置于搖床避光孵育10 min后，于酶標儀上測定各孔的吸光度值，然后計算細胞增殖抑制率[15]：細胞增殖抑制率=（正常對照組吸光度值-試驗組吸光度值）/正常對照組吸光度值×100%。

2.4 沙苑子多糖對軟骨細胞周期的影響考察

采用流式細胞術檢測。將軟骨細胞以1×106個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法進行分組和給藥，每組設置5個復孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養72 h。收集細胞于1.5 mL離心管中，加入70%無水乙醇固定1 h后，按細胞周期檢測試劑盒說明書進行相關操作，然后使用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。

2.5 沙苑子多糖對軟骨細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平的影響考察

采用ELISA法檢測。將軟骨細胞以5×104個/孔接種于96孔板中，按“2.2”項下方法進行分組和給藥，每組設置5個復孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養72 h后，按ELISA試劑盒說明書進行相關操作，檢測Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平。

2.6 沙苑子多糖對軟骨細胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達水平的影響考察

采用逆轉錄PCR（RT-PCR）法檢測。將軟骨細胞以1×106個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法進行分組和給藥，每組設置5個復孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養72 h。收集細胞至1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol試劑，靜置30 min，加入1/5體積氯仿，渦旋振蕩15 s后，以12 000 r/min離心15 min。取上層清液，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后冰浴10 min，以12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中加入1 mL 70%無水乙醇，以12 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，風干沉淀，加入無RNA酶水溶解沉淀。按反轉錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉錄為? cDNA，再按PCR試劑盒說明書操作進行PCR擴增。TGF-β1上游引物為5′-TACCACTACGGATCGTTAGA-3′，下游引物為5′-GACTGAACTAGCTAGCAATCGA-3′，產物長度為131 bp;BMP-2上游引物為5′-TAAGCTGACATGGTACCAGAT-3′，下游引物為5′-TAACGTATGACCATAGGAAT-3′，產物長度為112 bp;β-actin上游引物為5′-ACAGTAATGCCGTAACGTTC-3′，下游引物為5′-GATGCAATGGCTCAGATAGCA-3′，產物長度為109 bp。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環;最后72 ℃延伸10 min。然后采用熒光分析軟件對各孔ct值進行分析，以β-actin為內參計算TGF-β1、BMP-2 mRNA的相對表達水平。

2.7 沙苑子多糖對軟骨細胞中TGF-β1、BMP-2 蛋白表達水平的影響考察

采用Western blotting檢測。將軟骨細胞以1×106? ? 個/孔接種于6孔板中，按“2.2”項下方法進行分組和給藥，每組設置5個復孔，于5%CO2、37 ℃條件下培養72 h。收集細胞至1.5 mL離心管中，加入1 mL細胞裂解液，于4 ℃搖床上裂解4 h，再于4 ℃條件下以12 000? ? ?r/min離心10 min，取上清進行BCA蛋白定量。取蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，再轉移至PVDF膜，室溫封閉2 h后，加入TGF-β1、BMP-2一抗（1 ∶ 1 000），孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min;再加入相應二抗（1 ∶ 10 000），室溫孵育2 h;以TBST緩沖液洗膜2次，每次5 min;然后加入化學發光液，以β-actin為內參，采用化學發光成像系統分析蛋白條帶的相對灰度值來表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行試驗數據分析。計量資料以x±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，組內不同時間點數據比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞形態觀察結果

軟骨細胞培養0 h時，細胞呈現球形懸浮狀態;培養48 h時，大部分細胞已出現貼壁，細胞形態拉長，呈多角形，偶見橢圓形貼壁細胞;培養72 h時，細胞融合成單層，多數呈現細長梭型外觀，少部分仍為橢圓形外觀，表明軟骨細胞分離培養成功，詳見圖1。

3.2 細胞增殖抑制率測定結果

與正常對照組比較，陽性對照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細胞培養24、48、72、96 h后的細胞增殖抑制率均顯著降低（P<0.05）;與陽性對照組比較，沙苑子多糖高劑量組細胞培養24、48、72、96 h后細胞增殖抑制率均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細胞培養24、48、72、96 h后細胞增殖抑制率均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細胞培養24、48、72、96 h后細胞增殖抑制率差異無統計學意義，詳見表1。

3.3 細胞周期檢測結果

與正常對照組比較，陽性對照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組G1/G0期細胞百分比均顯著降低，S期細胞百分比均顯著升高（P<0.05）。與陽性對照組比較，沙苑子多糖高劑量組G1/G0期細胞百分比顯著降低，S期細胞百分比顯著升高（P<0.05）;沙苑子多糖低劑量組G1/G0期細胞百分比顯著升高，S期細胞百分比顯著降低（P<0.05）;沙苑子多糖中劑量組G1/G0期和S期細胞百分比差異無統計學意義，詳見圖2、表2。

3.4 細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白相對表達水平檢測結果

與正常對照組比較，陽性對照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;與陽性對照組比較，沙苑子多糖高劑量組細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平差異無統計學意義，詳見表3。

3.5 細胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達水平檢測結果

與正常對照組比較，陽性對照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05）;與陽性對照組比較，沙苑子多糖高劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2 mRNA表達水平差異無統計學意義，詳見表4。

3.6 細胞中TGF-β1、BMP-2蛋白表達水平檢測結果

與正常對照組比較，陽性對照組和沙苑子多糖高、中、低劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;與陽性對照組比較，沙苑子多糖高劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），沙苑子多糖低劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2 蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），沙苑子多糖中劑量組細胞中TGF-β1、BMP-2蛋白表達水平差異無統計學意義，詳見圖3、表5。

4 討論

半月板損傷常出現在交通傷和運動傷中，常表現為關節的機械性阻礙，最終導致關節功能障礙[16]。該損傷可導致嚴重骨性關節炎，甚至致殘[17]。目前，臨床常用硫酸氨基葡萄糖治療半月板損傷，其具有抗炎、改善關節功能、抑制關節軟骨損傷的作用[18]，故本研究將其作為陽性對照藥。

“腎主骨，生髓”是傳統中醫理論，沙苑子具有補腎助陽的功效，常用于治療遺尿、尿頻[6]。有研究報道，沙苑子可清除骨骼肌氧化自由基，提高大鼠運動能力[19]。此外，沙苑子和狗脊、肉蓯蓉等聯合用藥可治療大鼠骨質疏松[20]。沙苑子多糖是沙苑子的主要成分之一，但其對軟骨細胞的作用目前尚未見報道。基于此，本研究使用沙苑子多糖處理兔軟骨細胞，結果發現，沙苑子多糖可促進軟骨細胞的增殖，提高細胞增殖活性。另有研究表明，ALP活性增加可促進生長板軟骨細胞分化成熟[21]。本研究使用沙苑子多糖處理兔半月板纖維軟骨細胞后發現，細胞中Col Ⅱ、ALP蛋白的表達水平均顯著升高，表明沙苑子多糖對Col Ⅱ和ALP的表達具有促進作用。

BMP-2可刺激蛋白多糖合成，促進軟骨分化，促進軟骨修復[22]。Col Ⅱ和ALP是TGF-β1/BMP-2信號通路的下游信號因子，當TGF-β1和BMP-2聯合在骨髓基質細胞中過表達時，可促進Col Ⅱ、ALP蛋白的高表達，從而促進骨增殖與分化[23]。本研究結果顯示，沙苑子多糖處理兔半月板纖維軟骨細胞后可顯著升高TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達水平，由此表明，Col Ⅱ和ALP的表達升高可能與沙苑子多糖上調TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達水平有關。

綜上所述，沙苑子多糖可促進兔軟骨細胞的增殖，降低G0/G1期細胞百分化，促進細胞向S期轉化;其機制可能與上調TGF-β1、BMP-2 mRNA及蛋白表達，促進Col Ⅱ、ALP蛋白表達水平升高有關。

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（收稿日期：2020-01-12 修回日期：2020-03-11）

（編輯：唐曉蓮）