自血穴注療法對痤瘡小鼠Th1/Th2免疫偏移的調節作用

黃晉權，曾智文，張東淑

（南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州 510510）

痤瘡是一種常見的、高發的、復雜的損容性皮膚病，屬于中醫學“粉刺”“面瘡”的范疇。近年來，由于空氣質量、工作壓力、日常飲食及接觸電腦時間等因素導致痤瘡發病率逐年升高，有效的預防和治療已成為現階段醫學界關注的重要問題。本課題組前期應用靳瑞教授首創的自血穴注療法治療痤瘡，取得了較好的臨床療效[1]。本課題組又通過循證醫學方法評價自血穴位注射治療痤瘡的隨機對照試驗[2-4]，結果亦顯示自血穴位注射是一種相對安全的治療措施，可以改善痤瘡患者的皮損程度、降低痤瘡患者證候積分、改善患者生活質量，其治療痤瘡的療效優于西藥或中藥治療方法，并推測自血穴位注射通過調節Th1/Th2免疫偏移與皮損局部微生態環境失衡，發揮治療尋常痤瘡的作用，該法是自血穴位注射治療尋常痤瘡的重要途徑之一。為傳承靳瑞教授針灸學術特色，為自血穴注療法臨床應用治療痤瘡提供依據，進一步驗證自血穴注療法對痤瘡Th1/Th2 免疫偏移的調節作用，本研究擬觀察自血穴注療法對痤瘡小鼠Th1/Th2 免疫偏移的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物30 只SPF 級雌性昆明小鼠，體質量20～25 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK（粵）2016-0041。飼養于廣州市疾病預防控制中心SPF級動物房，飼養溫度為（22±2）℃，相對濕度為40%～60%，12 h/12 h明暗周期。

1.2試劑與儀器丙酸桿菌株（Propionibacterium acnes，P.acnes），購自廣東省微生物菌種保藏中心，于厭氧條件下4 ℃保存。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素4（IL-4）雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，購自杭州聯科生物技術股份有限公司，4 ℃保存。阿奇霉素（Azithromycin），購自廣州沛瑜生物制品有限公司，批號：83905-01-5。顯微鏡（日本Nikon 公司）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3動物分組與模型復制將小鼠適應性喂養1 周后，按隨機數字表隨機分成5 組，即正常組、模型組、自血穴注組、針刺組、阿奇霉素組，每組6 只。除正常組外，其他各組小鼠均構建痤瘡模型。方法[5]：應用1%戊巴比妥鈉0.01 mL/g 麻醉小鼠后，背部脫毛，于脫毛區域（1 cm × 1 cm）皮下注射P.acnes混懸液[6]0.1 mL，隔天1次，連續注射5次。正常組小鼠僅麻醉。采用紅斑、丘疹、膿皰、水腫、色變等表觀指標及病理指標作為模型評價指標[5]，其量化總積分大于0.6 即可判斷模型構建成功。

1.4治療方法自血穴注組于建模后應用尾靜脈注射固定器固定小鼠，剪去尾毛后消毒，用乙醇反復擦拭使尾部血管擴張。用剪刀割去尾尖1～2 mm，使血液自由滴入1.5 mL EDTA 抗凝EP 管。血流過慢時可從小鼠尾巴根部向尾尖擠出血液，采血量與穴位注射量根據前期研究工作基礎擬定[7]，共采血0.2 mL，采血結束，傷口消毒并壓迫止血。然后用注射器吸取EP 管中的血液，左手抓取小鼠，右手持注射器，助手固定其肢體，局部消毒，雙側足三里、曲池穴注射，0.05 mL/穴，隔天1 次，連續治療5 次。正常組、模型組于相應時段捉抓小鼠；針刺組麻醉后針刺雙側足三里、曲池穴，留針15 min；阿奇霉素組以阿奇霉素（劑量為1.0 g-1·kg-1·d）灌胃給藥，劑量換算參考文獻[8]。后4組治療頻次與療程均同自血穴注組。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 皮損積分 觀察小鼠治療前后背部紅斑、丘疹、囊腫及干燥脫屑等皮損變化情況，自擬皮損評分標準。按紅斑（丘疹）、囊腫、脫屑3項分別計分：無，0 分；輕，1 分；中，2 分；重，3 分。以總分計分。于治療開始當天記錄皮損評分，每天1次。

1.5.2 蘇木素—伊紅（HE）染色法觀察皮損組織病理 取皮損局部組織，以40 g/L 多聚甲醛溶液固定、脫水、透明處理、石蠟包埋后切片、HE 染色，封片后于顯微鏡下觀察病理改變。在顯微鏡（×100）下，每組隨機挑選3 張非連續切片，隨機取5個非重疊視野/片。采用Image Pro Plus 6.0軟件定量測定小鼠表皮、真皮厚度。

1.5.3 ELISA 法檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-4水平 治療結束后，麻醉小鼠，下腔靜脈取血，以3 000 r/min 離心10 min 獲取血清。具體方法按照TNF-α、IL-4 ELISA試劑盒說明書操作。

1.6統計方法采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。計量資料若符合正態分布以均數±標準差表示，多組比較采用方差分析，符合方差齊性組間兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊采用Tamhane's T2 檢驗。不符合正態分布者，則對數轉換，符合條件采用方差分析，否則采用非參數檢驗，多組間比較采用Krukal-Wallis Rank Test。相關性比較采用Spearman 相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組痤瘡小鼠治療前后背部皮損表現與評分比較治療前，各組痤瘡小鼠背部皮膚均可見紅斑、丘疹及囊腫，部分有脫屑等表現。治療第10 天各組小鼠背部皮損表現：模型組小鼠皮損雖稍有減輕趨勢，但仍有紅斑、丘疹、囊腫、脫屑等表現；自血穴注組小鼠背部皮損較模型組明顯減輕，可見紅斑、丘疹、囊腫大部分消退，干燥脫屑癥狀減輕；阿奇霉素組、針刺組小鼠背部皮損較模型組均有不同程度改善，紅斑大部分消退，囊腫、干燥脫屑癥狀減輕。

各組痤瘡小鼠治療前后背部皮損評分結果見表1。表1 結果顯示：治療前，各組小鼠皮損評分比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；治療后，3個治療組皮損評分均有不同程度下降，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），其中自血穴注組下降更為明顯。

2.2各組小鼠皮損組織病理學觀察與表皮、真皮厚度比較圖1結果顯示：正常組皮膚組織病理無異常改變，可見表皮層扁平整齊，真皮層組織及附屬結構清晰可辨，細胞形態飽滿；模型組皮膚組織明顯水腫，血管明顯充血擴張，可見大量炎性細胞浸潤及較大范圍膿腫形成；與模型組比較，自血穴注組、針刺組、阿奇霉素組皮膚組織水腫減輕，血管擴張減輕，炎性細胞浸潤減少。

表1 各組痤瘡小鼠治療前后背部皮損評分比較Table 1 Comparison of the skin lesion scores in acne mice of various groups before and after treatment

表1 各組痤瘡小鼠治療前后背部皮損評分比較Table 1 Comparison of the skin lesion scores in acne mice of various groups before and after treatment

*：自血穴注組因治療過程中固定操作不當致小鼠死亡1 只；①P ＜0.01，與模型組比較

治療后皮損評分4.17±1.17 1.00±1.00①1.67±1.03①1.83±1.84①6.317＜0.01組別模型組自血穴注組針刺組阿奇霉素組F值P值n/只6 5* 6 6治療前皮損評分6.17±0.75 5.40±1.52 5.50±1.76 5.50±1.38 0.3735＞0.05

圖1 各組痤瘡小鼠皮損組織病理形態比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of the histopathological features of injured skin tissues in various groups（by HE staining，×100）

圖2結果顯示：與正常組比較，模型組表皮厚度增加，真皮厚度減小（均P＜0.01）。針刺組、自血穴注組、阿奇霉素組表皮厚度較模型組減小（P＜0.05），3 個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；自血穴注組和阿奇霉素組真皮厚度較模型組增加，但自血穴注組差異無統計學意義（P＞0.05），而針刺組真皮厚度較模型組減小，差異亦無統計學意義（P＞ 0.05）。

2.3各組小鼠血清TNF-α、IL-4水平和TNF-α/IL-4比值比較圖3結果顯示：與正常組比較，模型組血清TNF-α水平明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，自血穴注組、阿奇霉素組血清TNF-α 水平不同程度升高（均P＜0.01），針刺組小鼠血清TNF-α水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

各組血清IL-4 水平比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。

與正常組比較，模型組TNF-α/IL-4 比值明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，自血穴注組TNF-α/IL-4比值明顯升高（P＜0.05），針刺組、阿奇霉素組血清TNF-α水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4皮損評分與TNF-α/IL-4比值相關性分析圖4結果顯示，皮損評分與TNF-α/IL-4 比值呈顯著負相關（r=-0.416，P=0.028）。提示外周血Th2細胞在痤瘡的發病中占主導地位。

3 討論

圖2 各組小鼠表皮厚度、真皮厚度比較Figure 2 Comparison of the thickness of epidermis and dermis in various groups

圖3 各組小鼠血清TNF-α、IL-4水平和TNF-α/IL-4比值比較Figure 3 Comparison of the levels of serum TNF-α and IL-4，and the ratio of TNF-α/IL-4 in various groups

圖4 痤瘡小鼠皮損評分與TNF-α/IL-4比值相關性分析Figure 4 Correlation of skin lesion scores in acne mice with ratio of TNF-α/IL-4

自血穴注療法是在經絡學說基礎上發展而來，它吸取了祖國醫學有關經絡穴位對內臟的特異性關系的理論，以血液中含有豐富營養、激素和免疫抗體等物質為刺激因子，刺激局部血液循環，激發機體的免疫功能，同時通過經絡循行作用，調節人體陰陽平衡，從而達到加快疾病治愈過程的目的[9]。足三里穴是足陽明胃經的合穴，曲池穴是手陽明大腸經的合穴。因陽明經多氣多血且穴位處肌肉豐厚，血液循環較好，因此，取足三里、曲池穴作為自血穴注療法的注射點。本研究結果顯示，自血穴注足三里、曲池可改善痤瘡模型小鼠皮損表現與評分，使皮損局部炎性細胞減少、組織水腫減輕，并顯著減輕表皮過度增生，與阿奇霉素療效相當。進一步探討自血穴注療法治療痤瘡的作用機理有重要的研究意義。

痤瘡的發病機制存在多因素性，除微生物感染、皮脂分泌過多、毛囊皮脂腺導管過度角化及性激素水平異常外，在痤瘡的炎癥發展過程中，炎性因子、細胞免疫、體液免疫應答均參與了痤瘡炎癥機制。痤瘡患者存在免疫應答失調[10]，細胞免疫和體液免疫均參與了痤瘡發病過程，痤瘡患者皮損處毛囊皮脂腺周圍浸潤的淋巴細胞包括T淋巴細胞和B淋巴細胞，其中T淋巴細胞占絕大多數，且以CD4+細胞為主。CD4+T 細胞為外周血T淋巴細胞一大亞群，在未受抗原刺激時被稱為Th0細胞，Th0細胞在識別抗原肽結合的抗原遞呈細胞后向Th1或Th2細胞轉化。Th1細胞主要分泌TNF-α等特征性細胞因子，介導細胞免疫、炎癥反應與組織損傷；Th2細胞主要分泌IL-4等細胞因子，介導體液免疫，與持續感染、免疫抑制等有關。現代免疫學的發展證明了Th1/Th2細胞兩者之間既對立制約、消長平衡，又互根互用，如同中醫陰陽之間的關系不可分割。“Th1/Th2 免疫平衡”符合陰陽平衡的理論[11]，與中醫陰陽平衡之間存在密切的相關性。有研究顯示，痤瘡患者Th1細胞因子較健康者低下，存在Th1/Th2免疫失衡現象，且與痤瘡嚴重程度顯著相關[12]。痤瘡瘢痕形成患者的機體免疫模式由Th1向Th2漂移[13]，反映了“Th1/Th2免疫失衡”的發病機制，也符合機體陰陽失衡是疾病發生、發展的內核特點。使機體恢復陰陽的和諧狀態——“調和陰陽、以平為期”，才能達到治療疾病的目的。有研究表明，自身血作為微量變應原刺激機體，產生類似特異性免疫療法（specific immunotherapy，SIT）的效用，即早期降低肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等效應細胞活性，進而活化T 淋巴細胞，糾正Th1/Th2 免疫偏移，參與對免疫系統的修飾及對炎癥反應的調控，維持免疫自穩，誘導免疫耐受[14-15]。本研究結果顯示：痤瘡模型小鼠血清TNF-α 表達水平較正常組顯著降低（P＜0.01）；痤瘡模型小鼠血清IL-4水平與正常組比較，差異無統計學意義（P＜0.05）；痤瘡模型小鼠血清TNF-α/IL-4 比值較正常組降低（P＜0.05），且與痤瘡皮損的嚴重程度呈顯著負相關（P＜0.05）。提示外周血Th2 細胞在痤瘡的發病中占主導地位。而自血穴注治療后TNF-α 水平顯著上升（P＜ 0.01），TNF-α/IL-4比值趨于正常。表明自血穴注可起到免疫調節效應，糾正Th1/Th2免疫失衡，維持免疫穩態，從而減輕皮損炎性反應過度，促進炎性細胞消退，發揮“調和陰陽、以平為期”的作用。

綜上所述，自血穴注療法可有效治療痤瘡，其可能通過調節Th1/Th2免疫偏移、抑制表皮過度增生發揮改善痤瘡炎性皮損的作用，體現了“調和陰陽、以平為期”的特點，為從免疫角度研究自血穴注療法的作用機制提供了新思路，為自血穴注療法的臨床應用提供了實驗基礎。