降糖三黃片對(duì)高糖高脂飲食大鼠胰島β細(xì)胞去分化的作用

王保華，劉闖，李賽美

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

2 型糖尿病是一種進(jìn)展代謝性疾病[1]。高糖高脂飲食產(chǎn)生的糖脂毒性可增加胰島β細(xì)胞的代謝壓力，損傷胰島β細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。研究證實(shí)，具有“可逆性”的胰島β細(xì)胞去分化是導(dǎo)致其功能損傷的重要機(jī)制之一[2-3]。降糖三黃片是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中成藥院內(nèi)制劑，已應(yīng)用于臨床治療2 型糖尿病10 余年。前期一系列研究表明，降糖三黃片可降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗，有效治療代謝綜合征，延緩2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[4-6]。本研究通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)SD 大鼠建立糖脂代謝紊亂模型，模擬臨床2型糖尿病自然發(fā)病的病理過程，并觀察降糖三黃片對(duì)高糖高脂飲食大鼠胰島β細(xì)胞去分化的作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只，5周齡，體質(zhì)量100 ～120 g，購買及飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44007200032631。分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，光照12 h/12 h 晝夜明暗交替，環(huán)境溫度22 ～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。高糖高脂飲食按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配方：基礎(chǔ)飼料52.6%、豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%。

1.2藥物降糖三黃片，由桃仁、大黃、桂枝、黃芪、玄參、生地黃等9味中藥組成，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)：粵20071185，規(guī)格：0.25 g/片。

1.3主要試劑和儀器空腹血糖（FBG）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等試劑盒，購自上海科華生物工程股份有限公司；胰島素（Insulin）抗體、胰十二指腸同源盒因子（Pdx1）抗體、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（FOXO1）抗體和肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A 蛋白（MafA）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔/鼠二抗，購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；戊巴比妥鈉，購自德國默克公司；胰島素（Insulin）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；血糖儀及試紙條，購自美國雅培公司；細(xì)胞因子定量抗體蛋白芯片（GSeries Rat Cytokine Array 67，GSR-CAA-67）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、半乳凝素3（Galectin-3）、金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP-1）、神經(jīng)纖毛蛋白2（Neuropilin-2）抗體試劑盒，購自廣州瑞博奧（RayBiotech）生物科技有限公司。KDC-2046 低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；7020 全自動(dòng)生化分析儀（日本HITACHI 公司）；Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；RM2235 輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、HI1210 攤片機(jī)、HI1220 烘片機(jī)（德國Leica 公司）；BX43 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；芯片洗板機(jī)（美國Thermo Scientific 公司）；InnoScan 300 Microarray Scanner 熒光掃描儀（法國 Carbonne 公司）。

1.4動(dòng)物分組、造模與給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將30 只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組，每組10 只。正常組給予普通飲食，模型組和中藥組給予高糖高脂飲食建立糖脂代謝紊亂模型，持續(xù)180 d。造模同期，中藥組大鼠給予降糖三黃片混懸液（675 mg·kg-1·d-1，10 mL/kg 體質(zhì)量）灌胃，正常組和模型組大鼠給予等體積的蒸餾水灌胃，每日1次。給藥劑量參考人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比率表[7]和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[8]制定。

1.5標(biāo)本制備給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，按照45 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，低溫高速離心機(jī)離心（3 000 r/min，10 min），吸取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩３浞直┞陡骨唬〈笫笠认伲糜隗w積分?jǐn)?shù)4%甲醛中性溶液中固定。

1.6指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.6.1 大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量變化情況 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、飲水量、攝食量、尿量、死亡情況。每周統(tǒng)計(jì)并記錄各組大鼠體質(zhì)量。

1.6.2 腹腔注射的糖耐量實(shí)驗(yàn)（IPGTT） 各組大鼠隔夜禁食12 h 后，一次性腹腔注射50%葡萄糖溶液（2 g·kg-1），于腹腔注射葡萄糖前（即0 min）以及葡萄糖腹腔注射后的30、60、120 min 時(shí)間點(diǎn)分別從鼠尾末端采血，用血糖儀（雅培）測(cè)定大鼠血糖水平。

1.6.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平，按照試劑盒和儀器操作說明書進(jìn)行操作。

1.6.4 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測(cè)大鼠空腹胰島素（FINS）并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMA-β） 根據(jù)試劑盒和儀器操作說明書進(jìn)行操作。酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測(cè)樣品孔。梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，在標(biāo)準(zhǔn)孔依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測(cè)樣品孔加入40 μL 樣品，生物素標(biāo)記的抗體10 μL。除空白孔外，其余各孔混勻后加酶標(biāo)試劑50 μL，封板、孵育，洗板5 次。后加入顯色劑A、B 各50 μL，震蕩、混勻后37 ℃下顯色10 min。加終止液50 μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)。采用穩(wěn)態(tài)評(píng)估模型[9]計(jì)算HOMA-IR[HOMA-IR=（FBG×FINS）22.5]和HOMA-β[HOMA-β=20×FINS（FBG-3.5）]。

1.6.5 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察胰腺組織病理變化 將大鼠的胰腺組織放置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木素染色、分化、親和、對(duì)比染色、分化、脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡（×100）下觀察胰島與β細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.6.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠胰腺組織Insulin、MafA、Pdx1、FOXO1 的表達(dá) 大鼠的胰腺組織經(jīng)固定、石蠟包埋、切片、展片、撈片、脫蠟、抗原修復(fù)、滅活、封閉、滴加一抗、37 ℃復(fù)溫、滴加二抗、DAB 顯色、蘇木素染色、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡（×400）下觀察。Insulin 陽性表達(dá)為胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色；MafA、Pdx1、FOXO1 陽性表達(dá)為胞漿或胞核呈現(xiàn)棕黃色。隨機(jī)選取3個(gè)視野拍攝，測(cè)定胰島細(xì)胞的平均光密度值（OD）。

1.6.7 基于蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)大鼠血清細(xì)胞因子含量 能夠一次性檢測(cè)67 個(gè)大鼠血清細(xì)胞因子的定量抗體蛋白芯片（GSR-CAA-67）由QAR-CYT-3和QAR-CYT-4兩部分組成，各檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子如圖1所示，其中每個(gè)因子有4個(gè)重復(fù)。根據(jù)試劑盒說明書的操作方法進(jìn)行檢測(cè)，玻璃芯片干燥后，每個(gè)孔中加入100 μL 的樣品稀釋液孵育1 h以封閉芯片，吸去每個(gè)孔的稀釋液后添加100 μL的標(biāo)準(zhǔn)液和大鼠血清，4 ℃搖床孵育過夜。芯片洗板機(jī)清洗玻片，分別進(jìn)行檢測(cè)抗體混合物、Cy3-鏈霉親和素的孵育，采用激光掃描儀InnoScan 300掃描信號(hào)。應(yīng)用GSR-CAA-67 的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選不同組別大鼠之間相關(guān)差異表達(dá)的炎癥因子。

1.6.8 蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性驗(yàn)證 為驗(yàn)證GSR-CAA-67 定量抗體蛋白芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確度，采用ELISA 法對(duì)大鼠血清半乳凝素3（Galectin-3）、金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP-1）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、神經(jīng)纖毛蛋白2（Neuropilin-2）含量進(jìn)行再次測(cè)定。具體操作步驟同“1.6.4”項(xiàng)。

圖1 67個(gè)大鼠細(xì)胞因子定量抗體蛋白芯片上細(xì)胞因子位點(diǎn)序列圖圖譜Figure 1 Array Profile of Rat Cytokine Antibody Array G series 67（GSR-CAA-67）

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量比較隨著時(shí)間延長，各組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏。模型組大鼠體質(zhì)量較正常組顯著增加（P＜0.05），自實(shí)驗(yàn)第120 天起攝食、攝水量增加，大便干結(jié)，皮毛色澤較正常組粗澀。中藥組體質(zhì)量增加顯著小于模型組（P＜0.05），攝水量較模型組明顯減少，大便無干結(jié)，皮毛光澤程度與正常組無區(qū)別。各組大鼠體質(zhì)量結(jié)果見表1。

2.2各組大鼠口服葡萄糖耐量比較表2 與圖2結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組葡萄糖耐量曲線下面積（AUC）高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示高糖高脂飲食大鼠胰島β 細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌功能已經(jīng)開始受損。中藥組葡萄糖耐量AUC 處于正常組和模型組之間，說明降糖三黃片在一定程度上改善了高糖高脂飲食大鼠胰島β細(xì)胞功能，延緩了2型糖尿病病情的進(jìn)展。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of the rat body mass values in various groups

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of the rat body mass values in various groups

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組造模第180天753±51 877±52①827±50②N/只10 10 10造模第1天190±9 185±11 185±10造模第30天452±25 477±32 465±31造模第60天579±29 639±35①606±32②造模第90天645±31 711±34①680±36②造模第120天698±42 777±48①729±49②造模第150天743±39 844±47①800±50②

表2 各組大鼠腹腔注射葡萄糖耐量曲線下面積（AUC）比較Table 2 Comparison of AUC of glucose tolerance test in rats of various groups

表2 各組大鼠腹腔注射葡萄糖耐量曲線下面積（AUC）比較Table 2 Comparison of AUC of glucose tolerance test in rats of various groups

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組AUC值924.00±28.98 2 015.00±31.36①1 423.00±27.78②血糖[c/（mmol·L-1）]N/只10 10 10 0 min 5.68±0.41 12.60±0.63①8.72±0.53②30 min 9.58±0.58 18.26±0.67①14.16±0.43②60 min 7.72±0.43 17.90±0.52①12.50±0.61②120 min 6.80±0.70 16.02±0.66①10.16±0.48②

圖2 各組大鼠腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線比較Figure 2 Comparison of glucose tolerance test curves in rats of various groups

2.3各組大鼠生化指標(biāo)的變化表3 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清FBG、TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠血清FBG、TC、TG、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高（均P＜0.05）。

2.4各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β水平比較表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR水平顯著升高，F(xiàn)INS、HOMA-β水平顯著降低（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠HOMA-IR水平顯著降低，F(xiàn)INS、HOMA-β水平顯著升高（均P＜0.05）。提示降糖三黃片可提高胰島β細(xì)胞功能，減輕胰島素抵抗。

表3 各組大鼠血清FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平比較Table 3 Comparison of the serum levels of FBG，TC，TG，HDL-C and LDL-C in various groups

表3 各組大鼠血清FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平比較Table 3 Comparison of the serum levels of FBG，TC，TG，HDL-C and LDL-C in various groups

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組LDL-C 0.32±0.06 0.76±0.16①0.65±0.09②N/只10 10 10 FBG 6.77±0.63 13.59±1.58①7.71±0.79②TC 2.50±0.28 3.64±0.57①3.04±0.54②TG 1.77±0.53 2.24±0.37①1.45±0.47②HDL-C 0.70±0.07 0.54±0.09①0.63±0.07②

表4 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β水平比較Table 4 Comparison of the levels of FINS，HOMA-IR and HOMA-β in various groups

表4 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β水平比較Table 4 Comparison of the levels of FINS，HOMA-IR and HOMA-β in various groups

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組N/只10 10 10 FINS[J/（mIU·L-1)]16.35±1.03 14.39±1.52①16.55±2.19②HOMA-IR 4.92±0.59 8.67±1.45①5.71±1.19②HOMA-β 103.24±19.30 29.18±5.57①80.29± 14.11②

2.5各組大鼠胰腺組織病理變化比較圖3 結(jié)果顯示：正常組胰腺組織結(jié)構(gòu)完好，胰島邊緣平滑界限清楚，β細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，分布均勻；模型組胰腺組織可見不規(guī)則的胰島形態(tài)，體積增大、邊界模糊，胰島細(xì)胞增生及間質(zhì)纖維組織纖維化；中藥組胰島形狀改善，胰島細(xì)胞增生及間質(zhì)纖維組織纖維化程度均較模型組明顯減輕。

2.6各組大鼠胰腺組織Insulin、Pdx1、MafA、FOXO1蛋白表達(dá)比較表5、圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組胰腺Insulin、Pdx1、MafA 表達(dá)顯著下調(diào)，F(xiàn)OXO1表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05）；中藥組胰腺Insulin、Pdx1、MafA蛋白表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)OXO1表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）。

圖3 各組大鼠胰腺組織病理變化比較（HE染色，×100）Figure 3 Comparison of pathological features in rat pancreas of various group（by HE staining，×100）

表5 各組大鼠胰島組織Insulin、Pdx1、MafA、FOXO1表達(dá)比較Table 5 Comparison of the expression levels of Insulin，Pdx1，MafA，F(xiàn)OXO1 in rat pancreatic tissues of various groups

表5 各組大鼠胰島組織Insulin、Pdx1、MafA、FOXO1表達(dá)比較Table 5 Comparison of the expression levels of Insulin，Pdx1，MafA，F(xiàn)OXO1 in rat pancreatic tissues of various groups

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組N/只10 10 10 Insulin 2.91±0.56 2.25±0.69①2.91±0.43②Pdx1 1.96±0.48 1.45±0.39①1.97±0.61②MafA 1.52±0.68 0.78±0.31①1.48±0.70②FOXO1 1.28±1.11 2.36±0.88①1.26±0.79②

圖4 各組大鼠胰腺組織Insulin、Pdx1、MafA、FOXO1陽性表達(dá)細(xì)胞分布（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 4 Comparison of distribution of Insulin，Pdx1，MafA and FOXO1 positive cells in rats pancreatic tissues of various groups（by immunohistochemistry，×400）

2.7各組大鼠血清相關(guān)細(xì)胞因子變化比較基于高通量的蛋白芯片檢測(cè)及分析，篩選出正常組和模型組有顯著性差異的11 種細(xì)胞因子：TIMP-1、ICAM-1、Gas 1、腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子受體（TWEAK R）、Neuropilin-2、LIX、白細(xì)胞介素13（IL-13）、激活素A（Activin A）、血漿嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）、Galectin-3、Decorin；模型組和中藥組有顯著性差異的4 個(gè)細(xì)胞因子：Galectin-3、TIMP-1、Activin A、Eotaxin。將正常組與模型組的差異靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，各靶點(diǎn)之間聯(lián)系密切，其中TIMP-1在所有細(xì)胞因子中具有核心作用。如圖5、表6所示。

圖5 正常組與模型組差異細(xì)胞因子特征Figure 5 The characteristics of different cytokines in rat serum between normal group and Chinese medicine group

2.8蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性驗(yàn)證為了驗(yàn)證蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，挑選“2.7”項(xiàng)中2 個(gè)陽性結(jié)果和2 個(gè)陰性結(jié)果的細(xì)胞因子進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如表7 結(jié)果所示：與正常組比較，模型組Galectin-3、TIMP-1、ICAM-1、Neuropilin-2 具有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組ICAM-1、Neuropilin-2 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Galectin-3、TIMP-1 有顯著性差異（P＜0.05）。這與“2.7”項(xiàng)中蛋白芯片篩查結(jié)果一致，證明了蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。結(jié)合“2.7”項(xiàng)結(jié)果 ，故 認(rèn) 為 細(xì) 胞 因 子 Galectin- 3、 TIMP- 1、Activin A、Eotaxin 是降糖三黃片改善長期高糖高脂飲食大鼠胰島β細(xì)胞功能可能的分子靶標(biāo)。

表6 模型組與中藥組間差異蛋白Table 6 The data of different proteins between normal group and Chinese medicine group

表6 模型組與中藥組間差異蛋白Table 6 The data of different proteins between normal group and Chinese medicine group

差異蛋白Galectin-3 Activin A Eotaxin TIMP-1模型組16 381.5±5 496.4 19 355.2±5 778.3 93 896.8±12 262.1 45 102.3±9 717.1中藥組9 982.5±5 068.5 9 601.0±2 489.8 74 259.4（72 603.4，76 751.5）35 734.6±9 047.2 Fold change 0.61 0.50 0.79 0.79 P值0.01 0.00 0.01 0.03

表7 各組大鼠血清Galectin-3、TIMP-1、ICAM-1、Neuropilin-2含量比較Table 7 Comparison of the serum levels of Galectin-3，TIMP-1，ICAM-1，and Neuropilin-2 in various groups

表7 各組大鼠血清Galectin-3、TIMP-1、ICAM-1、Neuropilin-2含量比較Table 7 Comparison of the serum levels of Galectin-3，TIMP-1，ICAM-1，and Neuropilin-2 in various groups

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組Neuropilin-2[ρ/（pg·mL-1)]1.12±1.14 5.14±4.39①4.01±3.09 N/只10 10 10 Galectin-3[ρ/（pg·mL-1)]2.63±1.20 8.12±2.74①3.30±2.10②TIMP-1[ρ/（ng·mL-1)]8.43（7.21，13.04)2.82±4.20①1.75±4.19②ICAM-1[ρ/（ng·mL-1)]13.77（12.44，16.68)48.60±24.19①52.88±45.10

3 討論

2 型糖尿病屬于中醫(yī)“消渴病”范疇。《內(nèi)經(jīng)》云“二陽結(jié)謂之消”“大腸移熱于胃，善食而瘦，又謂之食亦”，提示消渴病有胃腸熱結(jié)的表現(xiàn)。而瘀血內(nèi)生是2型糖尿病重要病機(jī)的觀點(diǎn)已成共識(shí)。作為國家中醫(yī)藥管理局糖尿病重點(diǎn)專科，本課題組倡導(dǎo)“經(jīng)典回歸臨床，臨床詮釋經(jīng)典”，通過臨床實(shí)踐觀察，基于病證結(jié)合的思路，提出2型糖尿病尤其是早期患者具有瘀熱互結(jié)在里，久則氣陰不足的病機(jī)特點(diǎn)。治療當(dāng)瀉熱、祛瘀、養(yǎng)陰并用，以《傷寒論》經(jīng)方桃核承氣湯（桃仁、桂枝、大黃等）加玄參、黃芪、生地黃等9 味藥開發(fā)出廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑降糖三黃片，方中桃仁、桂枝活血通脈，大黃通腑泄熱兼活血，玄參、生地黃滋陰清熱，黃芪益氣以助活血，全方清泄陽明胃腸燥熱，同時(shí)活血通脈，切合消渴病機(jī)特點(diǎn)。前期已通過急性和慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了該藥的安全性，10 余年的院內(nèi)臨床應(yīng)用已證明該藥在治療2 型糖尿病方面的顯著療效。進(jìn)行藥物機(jī)制的研究將有助于藥物的推廣運(yùn)用，對(duì)進(jìn)一步挖掘2 型糖尿病的中醫(yī)藥理論和方法，提高中醫(yī)藥防治2型糖尿病的療效具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)幼年及成年大鼠胰島功能衰退的發(fā)生發(fā)展演變過程，結(jié)果顯示，長期的高糖高脂飲食可以引起糖脂代謝紊亂，胰島素分泌能力的下降，這些病理變化很好地模擬了2型糖尿病的自然發(fā)病過程，為2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制及藥理研究打下了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，降糖三黃片可降低高糖高脂飲食大鼠FBG、TG、LDL-C、TG、HOMA-IR 水平，升高HDL-C、HOMA-β、FINS 水平，表明降糖三黃片具有改善糖脂代謝紊亂，提高胰島β細(xì)胞功能的作用。

MafA 和Pdx1 是胰島β 細(xì)胞分化、成熟及分泌胰島素不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子[10-11]，前者在體內(nèi)調(diào)節(jié)胰島素分泌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，后者負(fù)責(zé)胰島β細(xì)胞的存活、胰島素表達(dá)和分泌途徑的調(diào)節(jié)[12-13]，是成熟胰島β細(xì)胞的標(biāo)志性基因，也是檢測(cè)胰島β細(xì)胞去分化的重要方法[14]。β細(xì)胞中FOXO1通過競(jìng)爭性結(jié)合到Pdx1 啟動(dòng)子區(qū)，抑制Pdx1 的表達(dá)[15]。本研究中，高糖高脂飲食導(dǎo)致大鼠胰腺組織FOXO1 表達(dá)上調(diào)，Pdx1、MafA、Insulin 蛋白表達(dá)下調(diào)，而經(jīng)降糖三黃片干預(yù)后，高糖高脂飲食大鼠胰腺組織FOXO1 蛋白表達(dá)下調(diào)，Pdx1、MafA、Insulin蛋白表達(dá)上調(diào)。因此，長期高糖高脂飲食引起胰島β細(xì)胞去分化導(dǎo)致其分泌功能受損，降糖三黃片通過調(diào)控FOXO1/Pdx1 通路減輕胰島β 細(xì)胞去分化而提高胰島功能。

營養(yǎng)和能量攝入過剩引起的內(nèi)臟脂肪堆積，釋放大量脂肪因子和細(xì)胞因子，引起慢性代謝性炎癥，損害胰島素分泌和敏感性，并與胰島β細(xì)胞去分化有關(guān)[16]。蛋白質(zhì)抗體芯片技術(shù)是一種高通量、高特異性的蛋白功能分析技術(shù)，能短時(shí)、高效、同步完成多種因子的檢測(cè)，其強(qiáng)大的信息量使研究者更全面了解各因子之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，尤其適合研究具有多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控機(jī)制的中藥復(fù)方。本研究基于蛋白芯片技術(shù)證實(shí)高糖高脂飲食引起大鼠血清Galectin-3、ICAM-1、TIMP-1、IL-13、Neuropilin-2、Activin A、Eotaxin等11 種與代謝性炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子含量升高，而降糖三黃片可以降低大鼠Galectin-3、TIMP-1、Activin A、Eotaxin 的含量。Galectin-3 即半乳糖凝集素，參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程[17]，可調(diào)控糖脂代謝，是糖尿病的一個(gè)危險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子，與胰島β細(xì)胞功能指數(shù)呈負(fù)相關(guān)[18]，對(duì)胰島功能具有預(yù)測(cè)作用。TIMP-1 在胰腺纖維化導(dǎo)致的β細(xì)胞功能損傷密切相關(guān)，而Activin A、Eotaxin在胰腺的炎癥損傷方面有重要的作用[19-20]。因此，降低Galectin-3、TIMP-1、Activin A、Eotaxin 含量可能是降糖三黃片延緩糖脂毒性下胰島β細(xì)胞去分化的潛在作用機(jī)制。

綜上所述，降糖三黃片具有調(diào)控胰腺FOXO1/Pdx1 通路抑制“糖脂毒性”作用下的胰島β 細(xì)胞去分化的作用，并與細(xì)胞因子TIMP-1、Galectin-3、Activin A、Eotaxin 密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究將對(duì)其內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行深入挖掘，以期為2型糖尿病的中醫(yī)藥治療提供重要思路。