松果菊苷對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體內(nèi)外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

韓一梅，靳偉民，曾會，王成，張輝

（漢中市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西漢中 723000）

結(jié)腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生活方式的改變，發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢[1-3]。目前，結(jié)腸癌的治療主要包括手術(shù)、化學(xué)和放射等方法，氟嘧啶是早期結(jié)腸癌患者術(shù)后輔助化療的主要藥物，但僅能減少25%的復(fù)發(fā)率[4-5]。因此，尋找新的有效的抗結(jié)腸癌藥物是關(guān)鍵。肉蓯蓉，為列當(dāng)科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 的干燥帶鱗葉肉質(zhì)莖，入腎、大腸經(jīng)，有補腎壯陽、潤腸通便之功效。松果菊苷（echinacoside）是肉蓯蓉中提取的一類苯乙醇苷類化合物[6]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。松果菊苷具有神經(jīng)保護、肝保護、抗凋亡、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、通便、抗糖尿病、促進骨形成及抗癌等多種生物學(xué)作用[7-15]。既往已有研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡發(fā)生[16]。本研究觀察了松果菊苷對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞體內(nèi)外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，以期進一步探討松果菊苷抗結(jié)腸癌的作用機制，為其開發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合率達到85%～90%以上時進行消化、傳代。

圖1 松果菊苷結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of echinacoside

1.2動物SPF 級4 周齡BALB/c 裸鼠，購自北京維通利華實驗動物公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為23 ～27 ℃，濕度為50% ～60%，所有裸鼠均自由進食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實驗。本研究中的動物實驗是在本院動物倫理委員會批準(zhǔn)后進行的。

1.3藥物與試劑松果菊苷（純度：≥98%）（武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號：29782-68-1）。RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）（美國Gibco 公司）；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒、原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶公司）；cleaved-caspase（cl-caspase）-3、cl-caspase-9、Ki67、E 鈣黏蛋白（E-cadherin）、N 鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）抗體（英國Abcam公司）；生物素標(biāo)記的山羊抗裸鼠二抗（北京博奧森生物科技公司）。

1.4儀器恒溫孵育箱（美國Thermo 公司）；CK40 熒光倒置顯微鏡、CX23 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；蛋白質(zhì)免疫印跡系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.5體外實驗

1.5.1 克隆形成實驗測定細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達到80%時，將細(xì)胞分為4組，分別加入終濃度為0（作為空白對照組）、10、25、50 μmol/L的松果菊苷處理24 h。收集細(xì)胞，每組取1×103個細(xì)胞接種到6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)10 d。然后用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇固定克隆，0.4%結(jié)晶紫染色。鏡下觀察并計算各組細(xì)胞克隆數(shù)。

1.5.2 BrdU染色法測定細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞接種于96 孔板，每孔2 × 104個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，用含體積分?jǐn)?shù)0.4%胎牛血清的培養(yǎng)液同步化孵育細(xì)胞72 h。分組，同“1.5.1”項。處理24 h后，加入終濃度為0.03 μg/mL 的BrdU，繼續(xù)孵育40 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3 次，用40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。鏡下隨機選取5個視野觀察并拍照。實驗至少重復(fù)3 次，每組6 個復(fù)孔。BrdU陽性細(xì)胞呈綠色熒光。BrdU陽性細(xì)胞率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.3 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞接種于6 孔板，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達到80%時，分組，同“1.5.1”項。處理24 h后，收集細(xì)胞，調(diào)整密度至1×106個/mL。取100 μL細(xì)胞加入 5 μL 的 Annexin V-FITC 和 10 μL 的 PI 染色液，室溫避光孵育15 min 后，上機檢測。具體步驟按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作。

1.5.4 Transwell 實驗測定細(xì)胞侵襲能力 將細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達80%時，分組，同“1.5.1”項。處理24 h 后，收集細(xì)胞，接種于Matrigel 包被好的Transwell 小室上層，密度為1×105個/mL，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，下層加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用40 g/L多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下每組隨機選取5個視野，對染色細(xì)胞進行計數(shù)。實驗至少重復(fù)3次，每組6個復(fù)孔。

1.5.5 劃痕實驗測定細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞接種于6 孔板，每孔1 × 106個細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達90%時，用滅菌的10 μL 槍頭在底部劃痕，PBS 洗滌去除脫落細(xì)胞。分組，同“1.5.1”項。加入5 μg/mL 絲裂霉素C和無血清培養(yǎng)基配制的相應(yīng)終濃度的藥物處理24 h。倒置顯微鏡下測量0 h和24 h時劃痕的寬度。劃痕閉合率（%）=（0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.6體內(nèi)實驗

1.6.1 動物模型建立與給藥 將60 只BALB/c 裸鼠隨機分為空白對照組，松果菊苷10、25、50 mg/kg組，每組15 只。收集人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個/mL，給予所有裸鼠背部皮下注射細(xì)胞懸液0.2 mL 構(gòu)建結(jié)腸癌移植瘤模型。同時，松果菊苷10、25、50 mg/kg組裸鼠分別腹腔注射相應(yīng)濃度的松果菊苷溶液5 μL/g，空白對照組裸鼠腹腔注射等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)注射28 d。

1.6.2 觀察移植瘤體積及裸鼠存活情況 每天記錄裸鼠生存情況。每5 d 測量1 次移植瘤體積。移植瘤體積=長×寬×高/2[17]。

1.6.3 免疫組織化學(xué)法測定移植瘤中Ki67、VEGF的表達水平 給藥結(jié)束后，頸椎脫臼處死裸鼠，摘取裸鼠背部移植瘤組織，置于40 g/L多聚甲醛溶液中充分固定，石蠟包埋后制作成5 μm 的石蠟切片。切片脫蠟處理后，用0.01 mol/L 枸櫞酸鈉溶液進行抗原修復(fù)。PBS清洗3次，滴加體積分?jǐn)?shù)為5%山羊血清室溫封閉2 h，隨后滴加Ki67（或VEGF）抗體（稀釋度為1∶200），4 ℃孵育過夜。第2 天用PBS 洗去Ki67（或VEGF）抗體，滴加山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h。最后滴加DAB顯色，用蘇木精復(fù)染，每張切片在生物顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)陽性細(xì)胞。鏡下，陽性細(xì)胞可見棕黃色著染，正常細(xì)胞呈藍(lán)色。陽性細(xì)胞率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.4 TUNEL法測定移植瘤細(xì)胞凋亡水平 切片脫蠟處理后，根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書對切片進行染色，每張切片在生物顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)凋亡細(xì)胞。鏡下，陽性細(xì)胞核有棕黃色著染者為凋亡細(xì)胞，正常細(xì)胞呈藍(lán)色。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）法測定移植瘤中 E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 的表達水平 采用含蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解、提取移植瘤組織總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。取等量變性后的蛋白經(jīng)凝膠電泳進行分離，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，分別加入E-cadherin（或N-cadherin，或 Vimentin）抗體（稀釋度為1∶500），4 ℃孵育過夜。棄一抗，緩沖液清洗后加入對應(yīng)二抗（稀釋度為1∶2 000），室溫孵育1 h。滴加發(fā)光顯色液，于暗室曝光、顯影。以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值（p）表示。

圖2 松果菊苷對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體外增殖能力的影響Figure 2 Effects of echinacoside on proliferation of colon cancer SW480 cells in vitro

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示。多組比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，進一步組間兩兩比較采用Dunnett檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1松果菊苷抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體外增殖應(yīng)用細(xì)胞克隆形成實驗和BrdU 染色實驗觀察松果菊苷對SW480 細(xì)胞體外增殖能力的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，松果菊苷10、25、50 μmol/L組細(xì)胞克隆數(shù)量和BrdU 陽性細(xì)胞百分比均明顯降低（P＜ 0.05 或P＜ 0.01），且呈劑量依賴性。見圖2-A，-B。表明松果菊苷可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體外增殖。

2.2松果菊苷誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察松果菊苷對SW480 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，松果菊苷10、25、50 μmol/L 組 SW480 細(xì)胞凋亡率均增加，且呈劑量依賴性，其中松果菊苷25、50 μmol/L 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05 或P＜ 0.01）。見圖3。表明松果菊苷可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3松果菊苷抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲和遷移應(yīng)用Transwell 實驗和劃痕實驗觀察松果菊苷對SW480 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，松果菊苷10、25、50 μmol/L 組侵襲細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞劃痕閉合率均降低（P＜ 0.05 或P＜ 0.01），且呈劑量依賴性。見圖4-A、-B。結(jié)果表明松果菊苷可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體外侵襲和遷移。

圖3 松果菊苷對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effects of echinacoside on apoptosis of colon cancer SW480 cells

圖4 松果菊苷對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Figure 4 Effects of echinacoside on invasion and migration of colon cancer SW480 cells

2.4松果菊苷抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長比較各組結(jié)腸癌移植瘤裸鼠生存率和移植瘤體積，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察松果菊苷對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤中Ki67 表達的影響。結(jié)果顯示：與空白對照組比較，松果菊苷10、25、50 μmol/L 組裸鼠存活率均增加，移植瘤體積均減小，Ki67 陽性細(xì)胞率均降低，且呈劑量依賴性，其中松果菊苷25、50 μmol/L 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05 或P＜0.01）。見圖5-A、-B、-C。結(jié)果表明松果菊苷可抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長，促進結(jié)腸癌移植瘤裸鼠存活。

2.5松果菊苷促進結(jié)腸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡應(yīng)用TUNEL實驗和Western Blot實驗觀察松果菊苷對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：與空白對照組比較，松果菊苷10、25、50 mg/kg組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡率，cl-caspase-3 和cl-caspase-9蛋白表達水平均增加，且呈劑量依賴性，其中松果菊苷 25、50 μmol/L 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜ 0.01）。見圖6-A，-B。表明松果菊苷可能通過促進結(jié)腸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡，抑制移植瘤生長，促進移植瘤裸鼠存活。

2.6松果菊苷抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤轉(zhuǎn)移應(yīng)用免疫組織化學(xué)實驗和Western Blot 實驗觀察松果菊苷對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，松果菊苷10、25、50 mg/kg組裸鼠移植瘤中VEGF 陽性細(xì)胞率，N-cadherin、Vimentin 蛋白表達水平均降低，E-cadherin 蛋白表達水平均升高，且呈劑量依賴性，其中松果菊苷25、50 μmol/L 組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05 或P＜0.01）。見圖7-A，-B。表明松果菊苷可能通過調(diào)控VEGF、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤轉(zhuǎn)移。

圖5 松果菊苷對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長的影響Figure 5 Effects of echinacoside on the growth of transplanted tumors in colon cancer nude mice

圖6 松果菊苷對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響Figure 6 Effects of echinacoside on the cell apoptosis of transplanted tumors in colon cancer nude mice

3 討論

Ki67 是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的增殖細(xì)胞特異性核蛋白，主要表達于G1、G2和M 期的細(xì)胞中，是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)志[18-19]。本研究通過體外培養(yǎng)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞和構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型觀察松果菊苷對結(jié)腸癌的影響，結(jié)果顯示，松果菊苷可劑量依賴性地抑制結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞體外克隆形成和增殖水平，抑制裸鼠移植瘤生長及增殖標(biāo)記蛋白Ki67 表達水平，增加裸鼠存活率。可見，松果菊苷可有效治療結(jié)腸癌。

圖7 松果菊苷對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤轉(zhuǎn)移的影響Figure 7 Effects of echinacoside on SW480 metastasis of transplanted tumors in colon cancer nude mice

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡形式。當(dāng)細(xì)胞受到各種異常刺激后，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放并與pro-caspase-9 形成凋亡體激活caspase-9，進而激活下游級聯(lián)caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究結(jié)果顯示，松果菊苷可劑量依賴性地誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞發(fā)生凋亡，增加裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡率和凋亡關(guān)鍵蛋白cl-capase-3、cl-capase-9 表達水平。結(jié)果表明松果菊苷可能通過促進結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，進而抑制癌細(xì)胞增殖、減緩腫瘤生長，延長裸鼠生存時間。

此外，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥惡化的重要標(biāo)志，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是治療癌癥的關(guān)鍵。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移涉及多種細(xì)胞因子[21]，其中VEGF能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加腫瘤血管通透性，促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，還能促進腫瘤新血管的生成，為癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)支撐，從而加速癌癥進程[22-24]。在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是必不可少的初始步驟，EMT 涉及諸如E 鈣黏蛋白（E-cadherin）表達減少、N 鈣黏蛋白（N-cadherin）表達增加、細(xì)胞骨架成分轉(zhuǎn)化為波形蛋白（Vimentin）等一系列變化過程，最終使細(xì)胞喪失上皮表型形成具有高遷移和侵襲能力的間質(zhì)表型[25-26]。本研究結(jié)果顯示，松果菊苷可下調(diào)體外培養(yǎng)的SW480 細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕閉合率，下調(diào)裸鼠移植瘤中VEGF、N-cadherin、Vimentin表達水平，升高E-cadherin表達水平。表明松果菊苷可抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤轉(zhuǎn)移，其機制與調(diào)控EMT 相關(guān)蛋白 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達有關(guān)。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)外實驗探討松果菊苷對人結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移的作用，結(jié)果表明松果菊苷可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，促進結(jié)腸癌裸鼠存活。可為松果菊苷臨床治療結(jié)腸癌提供實驗依據(jù)。