葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)流感病毒FM1感染模型小鼠的治療作用

肖奕珂，許華沖，鄧力，陳孝銀

（暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510632）

流行性感冒（influenza），簡(jiǎn)稱流感，是由流感病毒引起的急性發(fā)熱性呼吸道傳染病，經(jīng)飛沫傳播，傳染范圍廣泛[1]。尋找流感病毒治療的更優(yōu)方案有重要的研究意義。既往研究表明，葛根芩連制劑能治療流感[2]，方中葛根、黃芩、黃連、甘草都具有抗病毒作用[3-5]。葛根芩連湯的主要有效成分是葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿[6]。據(jù)報(bào)道，微生物發(fā)酵可增加葛根芩連湯中葛根素、黃芩苷等黃酮類化合物的含量[7-9]。當(dāng)前研究已發(fā)現(xiàn)，部分黃酮類化合物具有抗病毒作用[10]?；诟鸶诉B湯含有抗病毒成分，而發(fā)酵能增加其抗病毒成分的文獻(xiàn)研究背景，本研究擬探討葛根芩連湯發(fā)酵液防治流感的理論基礎(chǔ)及葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)流感小鼠的治療作用及機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)雌性C57BL/J 小鼠32 只，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)置于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。飼養(yǎng)于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)P2 實(shí)驗(yàn)室，日光照12 h，溫度（22±2）℃，濕度50%。

1.2藥物及制備葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連、甘草組成，葛根、黃芩、黃連、甘草比例為8∶3∶3∶2[4，7，11]，各中藥材購(gòu)于康美藥業(yè)股份有限公司。將上述中藥材煎煮去藥渣后，制備成含生藥量為1.0 g·mL-1的溶液，旋蒸，微生物發(fā)酵，制成葛根芩連湯發(fā)酵液[9，12]。磷酸奧司他韋顆粒，由宜昌東陽(yáng)光長(zhǎng)江藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20080763。

1.3主要試劑與儀器流感病毒鼠肺適應(yīng)株（FM1）由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室提供，血凝效價(jià)1∶16。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）；GAPDH抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；Toll 樣受體7（TLR-7）多克隆抗體（美國(guó)Bioworld Technology 公司）。T100 梯度 PCR 儀、CFX96 touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、PowerPac Basic 電泳系統(tǒng)、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Chemidoc MP 全能型成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4分組與模型構(gòu)建將32只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、西藥治療組、中藥治療組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠均經(jīng)乙醚輕度麻醉后進(jìn)行FM1 流感病毒鼠肺適應(yīng)株滴鼻處理，50 μL/只，連續(xù)3 d，建立流感模型[13-14]。

1.5給藥方法參照人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值確定藥物劑量[15]。造模結(jié)束后，中藥治療組給予葛根芩連湯發(fā)酵液（生藥劑量為10 g·kg-1）灌胃，西藥治療組給予磷酸奧司他韋（劑量為22.75 mg·kg-1）灌胃，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。共灌胃4 d，每天2次。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 觀察小鼠肺大體形態(tài) 給藥結(jié)束后，脫頸處死，解剖取肺，觀察肺大體形態(tài)。

1.6.2 病毒血凝實(shí)驗(yàn) 取肺組織，研磨勻漿，取25 μL上清，在微量反應(yīng)板上選好一排孔，按倍比稀釋法，從第1孔稀釋到第8孔，每孔加入1.2%雞紅細(xì)胞懸液25 μL，充分混勻，室溫靜置45 min，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.6.3 RT-PCR 檢測(cè)小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平 取小鼠肺組織，應(yīng)用TRIzol試劑盒提取組織總RNA，核酸蛋白定量分析儀測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm、280 nm的吸光度（OD，D）值，根據(jù)D（260）/D（280）值，判斷RNA 純度。將純度合格的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，采用SYBR 法進(jìn)行PCR檢測(cè)。2-△△Ct法計(jì)算肺組織中FM1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 s，60 ℃30 s，循環(huán)次數(shù)40。FM1 引物序列：上游，5'-GACCAATCCTG TCACCTCTGAC-3'；下游，5'-GGGCATTTGGAC AAACGTCTACG-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度240 bp。GAPDH引物序列：上游，5'-TGATGACATCAAGAAGGT GGTGAAG-3'；下游，5'-TCCTTGGAGGCCATGT AGGCAT-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度240 bp。

1.6.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)小鼠肺組織TLR-7 蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取肺組織，研磨，離心，提取上清液，即組織總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法檢測(cè)蛋白濃度。制備上樣樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），轉(zhuǎn)印，封閉，分別孵育一抗（TLR-7 按1∶1 000稀釋；GAPDH按1∶1 000稀釋）和二抗，化學(xué)發(fā)光成像，以Image J 軟件分析目標(biāo)帶的凈光密度值。

1.6.5 蘇木素—伊紅（HE）染色法觀察小鼠結(jié)腸組織病理情況 取3 ～4 mm結(jié)腸組織，40 g/L多聚甲醛固定，酒精脫水，透明，浸蠟，包埋，切片及貼片，染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性及方差齊性，多組比較采用單因素方差分析，否則采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肺大體形態(tài)變化圖1 結(jié)果顯示：空白對(duì)照組小鼠肺組織呈淡粉色。模型對(duì)照組小鼠肺組織充血腫脹，呈暗紅色。中藥治療組、西藥治療組肺組織局部充血腫脹，較模型對(duì)照組減輕，色澤介于暗紅與淡粉之間。

圖1 各組小鼠肺大體形態(tài)變化Figure 1 Comparison of the macroscopic pathological features of lung in various groups

2.2各組小鼠肺組織FM1 mRNA表達(dá)水平比較呼吸道標(biāo)本核酸陽(yáng)性作為流感確診的關(guān)鍵指標(biāo)[1，16]。圖2結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平增高（P＜ 0.05）。表明模型對(duì)照組小鼠肺組織病毒核酸高表達(dá)，因此確定模型構(gòu)建成功。治療后，與模型對(duì)照組比較，中藥治療組、西藥治療組小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平下降（P＜0.05），且中藥治療組小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平低于西藥治療組（P＜0.05）。表明葛根芩連湯發(fā)酵液能有效降低流感小鼠肺組織病毒核酸高表達(dá)，治療效果優(yōu)于奧司他韋。

圖2 各組小鼠肺組織FM1 mRNA表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of the expression level of FM1 mRNA in lung tissue of various groups

2.3各組小鼠肺流感病毒血凝效價(jià)比較陰性對(duì)照組紅細(xì)胞呈紐扣狀沉淀在底部，證明實(shí)驗(yàn)無(wú)其他干擾因素。陽(yáng)性對(duì)照，即病毒原液稀釋度1∶2 ～1∶16 引起血凝反應(yīng)，從1∶32 開(kāi)始即不再發(fā)生血凝反應(yīng)，表明其血凝價(jià)為1∶16。表1結(jié)果顯示，模型對(duì)照組肺組織勻漿稀釋度為1∶2 ～1∶128 時(shí)引起血凝反應(yīng)，1∶256 開(kāi)始不再反應(yīng)，表明其血凝價(jià)為1∶128。模型對(duì)照組病毒血凝價(jià)高于病毒感染原液，說(shuō)明流感病毒株毒力經(jīng)鼠肺傳染后活性增強(qiáng)。西藥治療組病毒血凝價(jià)均在稀釋度1∶2 ～1∶8時(shí)引起血凝反應(yīng)，1∶16 開(kāi)始不再反應(yīng)，表明其血凝價(jià)為1∶8。中藥治療組病毒血凝價(jià)均在1∶2 ～1∶16引起血凝反應(yīng)，1∶32 開(kāi)始不再反應(yīng)，表明其血凝價(jià)為1∶16。表明葛根芩連湯發(fā)酵液治療可降低小鼠肺流感病毒血凝效價(jià)。

表1 各組小鼠肺流感病毒血凝效價(jià)比較Table 1 Comparison of the influenza virus hemagglutinin titer in various groups

2.4各組小鼠肺組織TLR-7蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較圖3結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肺組織TLR-7 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，中藥治療組、西藥治療組小鼠肺組織TLR-7 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；但與西藥治療組比較，中藥治療組小鼠肺組織TLR-7表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠肺組織TLR-7蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Figure 3 Comparison of the relative expression level of TLR-7 protein in lung tissue of various groups

2.5各組小鼠結(jié)腸組織病理變化比較圖4 結(jié)果顯示：空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織單層柱狀上皮細(xì)胞排列緊密，大腸腺形態(tài)完好，黏膜層、黏膜下層、肌層清晰可見(jiàn)，紋理分明。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織單層柱狀上皮細(xì)胞排列疏松，大腸腺形態(tài)萎縮；中藥治療組、西藥治療組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)與空白對(duì)照組相近。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化比較（HE染色，×100）Figure 4 Comparison of the pathological features in colon tissue of various groups（by HE staining，×100）

3 討論

微生物發(fā)酵技術(shù)在中國(guó)已有數(shù)千年的歷史，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“湯液醪醴論”講述了古人利用微生物發(fā)酵將五谷轉(zhuǎn)化成為治病的醪醴[17]，唐朝已有文獻(xiàn)論述將中藥制成藥酒的方法及用途[12]。由《湯液醪醴論》可知：“古人釀五谷為酒，備邪氣時(shí)至，服之萬(wàn)全?！蔽⑸锇l(fā)酵能延長(zhǎng)保存時(shí)間，還可以改變藥物的性味，增添新的功效。研究葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)流感的治療作用有助于開(kāi)發(fā)中藥新劑型，延長(zhǎng)湯劑的保質(zhì)時(shí)間，降低防腐劑等添加劑的使用，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。與葛根芩連湯原液相比，發(fā)酵液中未出現(xiàn)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，生物堿含量穩(wěn)定，黃芩苷、小檗堿等異黃酮含量增加[9]，黃芩苷[18]、小檗堿[19]可抑制神經(jīng)氨酸酶活性?；诹啃шP(guān)系[20]，可以認(rèn)為酵母發(fā)酵能增加葛根芩連湯的抗病毒成分，增強(qiáng)治療作用。發(fā)酵使大分子多糖類成分減少，增加了小分子糖含量[21]。與大分子多糖不同，小分子糖不僅具有免疫調(diào)節(jié)功能，還能促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)，抑制大腸桿菌生長(zhǎng)[22]。腸道菌群失調(diào)是流感病情加重的原因之一[23]。與大分子多糖相比，小分子糖類可能更有利于腸道菌群恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯發(fā)酵液能有效降低流感小鼠肺組織病毒核酸的高表達(dá)，治療效果優(yōu)于奧司他韋。

天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵御微生物感染的第一道防線。Toll樣受體家族在機(jī)體天然免疫對(duì)病原體的識(shí)別方面發(fā)揮著非常重要的作用[24]。其中TLR-7可以識(shí)別病毒ssRNA，啟動(dòng)MyD88 依賴的信號(hào)通路，激活核因子NF-κB，進(jìn)而引起白細(xì)胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等促炎癥因子和I 型干擾素的產(chǎn)生，介導(dǎo)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答[25]。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯發(fā)酵液可使流感小鼠肺組織TLR-7 表達(dá)下調(diào)，表明葛根芩連湯發(fā)酵液可能通過(guò)抑制TLR-7表達(dá)在流感治療中發(fā)揮抗炎作用。

流感為上呼吸道感染，病位在肺[1]，中醫(yī)認(rèn)為：“肺與大腸相表里，肺病可以治腸?！盵26]葛根芩連湯主治陽(yáng)明里熱，病位在腸[27]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織單層柱狀上皮細(xì)胞排列疏松，大腸腺形態(tài)萎縮。中藥治療組、西藥治療組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的與空白對(duì)照組相近。保護(hù)小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的完整可能是葛根芩連湯發(fā)酵液治療流感的原因之一。

綜上所述，葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)流感模型小鼠具有治療效果，可抑制肺組織病毒核酸表達(dá)，抑制肺組織TLR-7 蛋白表達(dá)，維持腸正常生理組織結(jié)構(gòu)形態(tài)穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)仍存在以下不足：（1）尚未能探明葛根芩連湯發(fā)酵液治療流感的“肺與大腸相表里”的內(nèi)在機(jī)制；（2）尚未能探明葛根芩連湯發(fā)酵液治療流感小鼠的主要原因是其黃酮類成分的抗病毒作用，還是輔助免疫系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞達(dá)到清除病毒的治療效果。但可為后續(xù)研究指明研究方向。在后續(xù)研究中將探討葛根芩連湯發(fā)酵液對(duì)TLR-7 信號(hào)通路及其介導(dǎo)的細(xì)胞因子的影響，以進(jìn)一步闡明其抗肺炎病毒機(jī)制。