姜黃素對四氯化碳誘導鯉肝臟損傷的修復作用

張媛媛，宋理平，郭 輝，王曉麗

姜黃素對四氯化碳誘導鯉肝臟損傷的修復作用

張媛媛1，宋理平1，郭 輝2，王曉麗1

（1. 山東省淡水漁業研究院，山東 濟南 250013；2. 山東大學齊魯兒童醫院，山東 濟南 250022）

【】研究姜黃素對四氯化碳誘導的鯉（）肝臟損傷的修復作用，為篩選治療魚類肝臟綜合征的綠色藥物提供理論依據。在基礎飼料中分別添加0、60、120、240 mg/kg姜黃素，制備4種等氮、等能飼料。試驗設5組，陰性對照組注射橄欖油，飼喂基礎飼料，陽性對照組和各姜黃素組注射體積分數15%的CCl4溶液，分別以添加0、60、120、240 mg/kg姜黃素飼料飼喂14 d，測定各組谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）活力，丙二醛（MDA）含量，血漿總蛋白（TP）含量，總能氧化能力（T-AOC），肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力，以及肝細胞核相關轉錄因子2（Nrf2）含量等指標，并對各組肝臟細胞進行組織學觀察，研究姜黃素對鯉肝損傷的修復作用。在四氯化碳誘導初期，陽性對照組，60、120、240 mg/kg姜黃素組的GPT、GOT活力和MDA含量顯著高于陰性對照組(< 0.05)，隨著投喂時間的增加，各姜黃素組GPT、GOT活力和MDA含量平均值均有不同程度的降低，其中，120 mg/kg組的GPT、GOT活力和MDA含量以及240 mg/kg組的GPT活力差異顯著(< 0.05)；TP含量，T-AOC、SOD、GSH-Px活力，GSH含量的變化趨勢與GPT和GOT等相反，且隨著投喂時間的增加，120 mg/kg組的T-AOC、SOD、GSH-Px活力和TP、GSH含量以及240 mg/kg組的SOD、GSH-Px活力和GSH含量呈先降后升趨勢(< 0.05)，其余各組差異均不顯著 (> 0.05)；肝臟組織切片顯示，飼料中添加姜黃素可一定程度上修復鯉魚幼魚的肝臟損傷，且以120 mg/kg組效果最佳；飼料中添加姜黃素可提高鯉魚肝臟mRNA表達量，促使Nrf2由肝細胞質轉至細胞核中。姜黃素可通過介導Nrf2提高鯉魚相關抗氧化酶的活力，對魚體的肝臟損傷進行修復。當姜黃素的添加水平為120 mg/kg時，機體的抗氧化功能最強，對肝臟損傷的修復作用最強。

鯉；肝臟損傷；修復；姜黃素；Nrf2

魚類在水產養殖過程中常受抗生素等藥物或化學物質的應激，致使其生理動態平衡嚴重紊亂。CCl4等有毒物質的侵襲可直接作用于肝臟細胞膜、細胞器膜或生物大分子，導致魚體肝臟膜脂質過氧化，膜蛋白變性，膜結構性損壞，最終導致肝細胞壞死[1]，俗稱肝膽綜合征，近年來較為頻發，死亡率高。目前，關于魚類肝膽綜合征的治療主要以抗生素為主，但魚類內服抗生素等藥物不僅會引起腸道反應而食欲不振，還對魚體肝膽、腎臟等造成直接損傷，且易在魚類體內產生耐藥性，并造成藥物殘留而威脅人類健康[2-3]。姜黃素是目前世界上銷量最大的天然食用色素之一，其毒性低、不良反應少，是世界衛生組織和美國食品藥品管理局以及多個國家認定的安全藥物[4]。2014年，農業部批準姜黃素作為新飼料添加劑，現已證明其有殺菌消炎[5-6]、抗氧化[7]、清除自由基[7]及抗癌[8]等多種功效。有研究顯示，姜黃素可明顯激活人類肝癌細胞中HepG2細胞的核相關轉錄因子2（nuclesr factor crythroid 2-related factor 2, Nrf2）系統，并對抗葡萄糖氧化酶，（glucose oxidase, GO）氧化應激所致的蛋白激酶B （protein kinase B，PKB）磷酸化損害[9]，亦可通過誘導Nrf2活性對蛋氨酸-膽堿所引起的小鼠（）非酒精性脂肪肝炎有一定保護作用[10]，還可保護人類或小鼠等免受鎘[11]、汞[12]等毒性物質引起的腎臟、睪丸等組織嚴重損傷[13]。目前對姜黃素的應用研究主要在哺乳動物方面，在魚類中的研究尚處起步階段，主要集中在對機體的促生長、提高免疫以及抗氧化功能方面，即姜黃素對大黃魚（）[14]、羅非魚（）[15]、草魚（）[16]、大菱鲆（）[17]等生長、消化吸收、非特異性免疫和抗氧化功能研究。在姜黃素對魚體肝臟損傷方面研究僅見對草魚[18]、建鯉（var.）[19]和鯽（）肝細胞[20]急性肝臟損傷的保護作用研究，缺乏對魚類肝臟損傷修復作用的研究。本研究以CCl4構建魚體肝臟損傷模型，結合魚體生理、抗氧化及相關分子指標，探討姜黃素可否通誘導Nrf2活力，對魚體肝臟損傷進行修復，為姜黃素作為無公害中成漁藥在魚病防治中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚與養殖管理

幼鯉（）約50 g，由山東省淡水漁業研究院良種場提供。試驗開始前，用通威飼料公司提供的沉性飼料暫養1周，隨機將450尾大小、規格、體質基本一致的幼魚隨機放入15個循環水養殖桶（水體積250 L）中，試驗分為5組。每組試驗所用循環桶在空間位置上隨機分散排布，減少試驗組之間因光線等因素造成的誤差。每天分別于8:30、12:30和4:30近飽食投喂1次，每次投喂持續30 min以上。每天吸污1次，飼養期間水溫24.5 ~ 27.5 ℃，溶解氧6 mg/L以上，氨氮0.1 mg/L以下，亞硝酸鹽0.1 mg/L以下，pH 6.8 ~ 7.0。

1.2 試驗設計

對鯉魚腹腔注射由橄欖油稀釋的體積分數5%、10%、15%、20%、25%、30% CCl4，觀察7 d，確定造成鯉魚肝臟損傷但不致死的CCl4體積分數為15%。

試驗分為5組，每組3個平行，每個平行30尾魚。試驗組按每100 g體質量0.5 mL的比例對鯉魚腹腔注射體積分數15%的CCl4溶液(溶于橄欖油)，注射12 h后，鯉魚出現明顯的活力弱、不進食等病癥，向魚體飼喂添加0（基礎飼料，陽性對照）、60、120、240 mg/kg姜黃素飼料；陰性對照組按相同比例腹腔注射橄欖油，養殖模式處理同試驗組，飼喂無添加姜黃素飼料（基礎飼料）。在開始投喂飼料時以及投喂后1、4、7、14 d時分別采樣，分析姜黃素對CCl4誘導的肝臟損傷的影響。

1.3 試驗飼料

由山東省淡水漁業研究院營養與飼料加工研究室制備。將飼料原料粉碎，過孔徑380 μm的篩，采用逐級混勻方法充分混勻原料，加水后用小型顆粒機（SLP-45，中國水產科學研究院漁業機械研究所）制成直徑為3 mm的顆粒，基礎飼料見表1。

表1 試驗飼料配方與營養水平

注：1）每千克維生素預混料包含以下維生素：VA, 900 000 IU; VD,200 000 IU; VE, 4 500 mg; VK3, 220 mg; VB1, 320 mg; VB2, 1090 mg; 煙酸 2 800 mg; VB5, 2 000 mg; VB6, 500 mg; VB12, 1.6 mg; VC, 5 000 mg; 泛酸, 1 000 mg; 葉酸, 165 mg; 膽堿, 60 000 mg。

2）每千克礦物質預混料包含以下礦物質：FeSO4·7H2O, 25 g; CuSO4·5H2O, 2.0 g; ZnSO4·7H2O, 22 g; Na2SeO3, 0.04 g; KI, 0.026 g; MnSO4·4H2O, 7 g; CoCl2·6H2O, 0.1 g。

Notes: 1) One kilogram vitamin premix supplied the following vitamins: Vitamin A, 900000 IU; Vitamin D, 200000 IU; Vitamin E, 4500 mg; Vitamin K3, 220 mg; Vitamin B1,320 mg; Vitamin B2, 1090 mg; Niacin, 2800 mg; Vitamin B5, 2000 mg; Vitamin B6, 500 mg; Vitamin B12, 1.6 mg; Vitamin C, 5000 mg; Pantothenate, 1000 mg; Folic acid, 165 mg; Choline, 60000 mg.

2) One kilogram mineral premix supplied the following minerals: FeSO4·7H2O, 25 g; CuSO4·5H2O, 2.0 g; ZnSO4·7H2O, 22 g; Na2SeO3, 0.04 g; KI, 0.026 g; MnSO4·4H2O, 7 g; CoCl2·6H2O, 0.1 g.

1.4 采樣與處理

每桶隨機取魚3尾，用100 mg/L的MS-222快速深度麻醉，采血（尾靜脈），血樣在抗凝管中以4 ℃、6 000 r/min條件離心10 min，制備的血漿于?80 ℃下凍存備用。每尾魚同時采集肝臟，一部分存于波恩氏液中以備切片用，另一部分存儲在?80 ℃冰箱以進一步分析。

1.4.1 血漿肝功能指標測定 總蛋白(TP)、谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT)和總抗氧化能力(T-AOC) 用南京建成生物工程研究所科技有限公司試劑盒采用比色法測定。

1.4.2 肝臟抗氧化指標測定 凍存的肝臟樣品在4 ℃冰箱溶解后，用生理鹽水沖洗去血液，用濾紙吸干，以生理鹽水為介質按照1∶9（1 g組織樣品、9 mL生理鹽水）制成勻漿液，離心10 min (3 000 r/min)，取上清液，用南京建成生物工程研究所科技有限公司試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 和谷胱甘肽(GSH)。SOD活力由黃嘌呤氧化產生活性氧陰離子(O2-) 的清除率來計算[21]，MDA含量、GSH和GSH-Px活力用比色法測定[22]。

1.4.3 組織形態學分析 每個網箱中隨機取魚3尾，麻醉，在冰盤上剖取肝臟，放入預先配制好的波恩氏固定液(體積分數1.22%的飽和苦味酸75 mL，體積分數40%甲醛溶液25 mL，冰醋酸5 mL)中固定[23]。然后水洗，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片(切片機型號為Leica RM-2255，德國)，附貼于用蛋白甘油處理過的載玻片上進行HE染色，用中性樹膠封片，置于光學顯微鏡(NIKON DS-Fi1) 下觀察。

1.4.4 肝臟mRNA測定 用天根生物科技有限公司的試劑盒采用Trizol法提取各時間段的鯉魚肝組織總RNA，測定總RNA純度，使OD260/OD280為1.8 ~ 2.0，并凝膠電泳檢測總RNA質量；利用反轉錄試劑盒 (天根生物科技有限公司) 反轉錄為 cDNA；根據鯉魚mRNA的基因全序列設計引物(表2) 進行實時熒光定量PCR反應，反應條件： 95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，循環40次。Sybergreen 法檢測目的基因的擴增，β-actin為內參基因，所有反應均設3個重復。mRNA水平采用2-ΔΔCt法計算[24]。

1.4.5 核內Nrf2含量監測 采用western blot技術檢測肝臟細胞核內Nrf2含量。取鯉肝組織100 mg，用溶液法抽提總蛋白，Bradford法測定蛋白質濃度，變性后電泳，蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用50 g/L脫脂奶粉TBS溶液于室溫下封閉2 h，用Nrf2一抗 (1∶1 000，武漢三鷹生物技術有限公司) 于4℃下孵育18 ~ 24 h，用洗膜緩沖液TBST（Tris Buffered Saline Tween）洗膜3 次，每次8 min，用辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗(1∶10 000，Jackson ImmunoResearch) 室溫下孵育2 h，用TBST同法洗膜3 次，進行2 min的免疫印跡化學發光（ECL）反應，暗室中曝光、顯影和定影。用HRP偶聯內參GAPDH一抗孵育2 h 后，用TBST 洗膜4 次，每次10 min，進行2 min ECL反應，同法曝光、顯影和定影。利用QuantiScan 3.0 軟件測量目的蛋白和內參蛋白條帶灰度值，相對表達量以Nrf2灰度值與內參GAPDH灰度值比值表示。

表2 Nrf2基因熒光定量PCR引物

1.5 數據統計與分析

采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，數據差異顯著時，采用Duncan’s檢驗法進行多重比較, 差異水平定為0.05。試驗結果以平均值±標準誤(Mean±S.E.M) 表示。

2 結果與分析

2.1 四氯化碳誘導肝臟損傷后姜黃素對鯉血液生理指標的影響

圖1可見，經四氯化碳誘導損傷后鯉血漿GPT活力受姜黃素投喂時間影響顯著。陰性對照組GPT活力在整個試驗期內較為穩定，活力較低；陽性對照組，120、240 mg/kg姜黃素組的GPT活力呈先升后降的變化趨勢 (< 0.05)，而60 mg/kg姜黃素組無顯著差異。此外，鯉魚血漿GPT活力也受姜黃素添加量的影響。在投喂飼料1 d時，陽性對照組和各姜黃素組的GPT活力均顯著高于陰性對照組(< 0.05)；投喂4 d時，陽性對照組顯著高于陰性對照組 (< 0.05)，60、120、240 mg/kg組平均值高于陰性對照但差異不顯著 (> 0.05)；投喂7 d時，120 mg/kg組的GPT活力顯著低于陽性對照組 (< 0.05)，與陰性對照組無顯著差異，60、240 mg/kg組平均值也低于陽性對照組，但差異不顯著；投喂14 d時，各姜黃素組的GPT活力與陰性對照組均無顯著差異。

如圖1所示，四氯化碳誘導肝臟損傷后鯉魚血漿中GOT活力與GPT活力相似，亦受姜黃素添加量和飼料投喂時間的顯著影響。陽性對照組和120 mg/kg組的GOT活力隨著飼料投喂時間的增加均出現先升后降的變化趨勢 (< 0.05)，而60、240 mg/kg組的變化并不明顯。此外，在投喂飼料1 d時，陰性對照組GOT活力顯著低于陽性對照組和各姜黃素組 (< 0.05)；投喂4 d時，陰性對照組GOT活力顯著低于陽性對照組和240 mg/kg組(< 0.05)，而與60 和120 mg/kg組差異不顯著 (> 0.05)；投喂7 d時，陰性對照組和120 mg/kg組的GOT活力顯著低于陽性對照組 (< 0.05)，60和240 mg/kg組的GOT活力與陽性對照組、陰性對照組和120 mg/kg組均無顯著差異(> 0.05)。

數值為平均值±標準誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時間點間Duncan多重比較，凡含一個相同字母或無字母時無顯著性差異（P > 0.05）。

圖2可見，飼料中添加姜黃素顯著影響四氯化碳誘導鯉魚肝臟損傷后血漿中TP含量。隨著投喂時間增加，120 mg/kg組的TP含量呈先降后升變化趨勢 (< 0.05)，其他各組均無顯著差異 (> 0.05)；在投喂1 d時，陽性對照組及240 mg/kg組的TP含量低于陰性對照組，60、120 mg/kg組的TP含量平均值低于陰性對照組但差異不顯著 (> 0.05)；投喂4 d時，陽性對照組的TP含量顯著低于陰性對照組 (< 0.05)，其余各組之間差異均不顯著(> 0.05)；投喂7 d時，120 mg/kg組的TP含量回升至陰性對照組水平 (> 0.05)，且120 mg/kg組平均值高于60和240 mg/kg組，但差異不顯著(> 0.05)；投喂14 d時，60、120 mg/kg組的TP含量顯著高于陽性對照組 (< 0.05)，與陰性對照組和240 mg/kg組差異不顯著 (> 0.05)。

數值為平均值±標準誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時間點間Duncan多重比較，凡含一個相同字母或無字母時無顯著性差異（P > 0.05）。

圖2可見，經CCl4誘導后，鯉魚血漿T-AOC受姜黃素添加量影響顯著。隨著投喂時間的增加，120 mg/kg組的T-AOC和TP含量的變化趨勢基本相同，均呈先降后升變化趨勢 (< 0.05)，其他各組之間無顯著差異(> 0.05)；在投喂1 d時，陽性對照組的T-AOC顯著低于陰性對照組，與其他各組無顯著性差異，在其他時間點，姜黃素添加量的不同對鯉血漿T-AOC并未造成顯著影響。

2.2 四氯化碳誘導后姜黃素對鯉魚肝臟抗氧化指標的影響

圖3可見，CCl4誘導后，肝臟SOD活力和MDA含量均受姜黃素添加量和投喂時間顯著影響。隨著投喂時間的增加，120、240 mg/kg組的SOD活力呈先降后升趨勢 (< 0.05)，其他各組無顯著差異。在投喂飼料1 d時，與陰性對照組相比，陽性對照組和240 mg/kg組的肝臟SOD活力顯著降低 (< 0.05)，60和120 mg/kg組的平均值降低，但差異不顯著 (> 0.05)；在投喂4 d時，各姜黃素組SOD活力平均值高于陽性對照組，低于陰性對照組，但差異并不顯著 (> 0.05)。MDA含量則呈相反趨勢，當姜黃素的添加量為120 mg/kg時，隨著投喂時間的增加，肝臟MDA含量呈先升后降趨勢（< 0.05）。

數值為平均值±標準誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時間點間Duncan多重比較，凡含一個相同字母或無字母時無顯著性差異（P > 0.05）。

圖4可見，經CCl4誘導后，肝臟中GSH-Px和GSH活力均受飼料投喂時間和姜黃素添加量顯著影響。隨著投喂時間的增加，120、240 mg/kg組GSH-Px活力和GSH含量均呈先降后升趨勢 (< 0.05)，其他各組無顯著差異 (> 0.05)。試驗開始時，陽性對照組和各姜黃素組肝臟GSH平均值較陰性對照組有所下降，但差異不顯著，而與陰性對照組相比，各組GSH-Px活力顯著下降 (< 0.05)；在投喂1 d時，陽性對照組和各姜黃素組的GSH-Px活力顯著低于陰性對照組 (< 0.05)，而與陰性對照組相比，陽性對照組的GSH含量顯著降低(< 0.05)，各姜黃素組的GSH含量有所下降，但差異不顯著(> 0.05)；在投喂4 d時，各姜黃素組的GSH和GSH-Px活力平均值與前一次采樣相比均有所升高 (> 0.05)，且與陰性對照組相比無顯著差異，各組間差異也不顯著 (> 0.05)；在投喂7、14 d時，各姜黃素組GSH和GSH-Px活力基本恢復至正常水平，各組間無顯著差異 (> 0.05)。

2.3 四氯化碳誘導后姜黃素對鯉魚肝臟組織結構的影響

圖5可見，投喂飼料1 d時，在油鏡（×1000）下，陽性對照組、60、120及240mg/kg組的肝細胞出現嚴重空泡及細胞膨大現象，大部分肝細胞的細胞核大而明顯且出現偏移，大量細胞核出現聚集現象，更有甚者，肝細胞有出血現象。而陰性對照組的肝細胞形狀較為正常，無細胞膨大及明顯的脂肪空泡現象；細胞核大小適中，分布于細胞中間。在投喂7 d時，陽性對照組和60 mg/kg組仍有細胞核聚集和脂肪空泡化等現象；此外，120 mg/kg組肝臟細胞形狀較為正常，無明顯細胞膨大和脂肪空泡現象，細胞核大小適中，分布于細胞中間；240 mg/kg組雖有些許脂肪空泡，但與投喂1d相比癥狀已減輕。

數值為平均值±標準誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時間點間Duncan多重比較，凡含一個相同字母或無字母時無顯著性差異（P > 0.05）。

圖5 姜黃素對鯉魚肝臟組織結構的影響

2.4 四氯化碳誘導后姜黃素對鯉魚肝臟中Nrf2 mRNA表達量的影響

圖6可見，經四氯化碳誘導后，鯉魚肝臟mRNA表達量受姜黃素添加量影響顯著。在試驗開始及投喂1 d時，各組間肝臟mRNA表達量均無顯著差異 (> 0.05)；在投喂4 d時，120 mg/kg組mRNA表達量顯著高于陰性對照組和陽性對照組 (< 0.05)，其余各組間差異均不顯著 (> 0.05)；在投喂7、14 d時，各姜黃素組mRNA表達量均顯著高于陰性對照組 (< 0.05)，而陽性對照組表達量平均值高于陰性對照組，但差異不顯著 (> 0.05)。

數值為平均值±標準誤，n = 9；小寫字母分別表示不同劑量組間Duncan多重比較，大寫字母分別表示不同時間點間Duncan多重比較，凡含一個相同字母或無字母時無顯著性差異（P > 0.05）。

2.5 四氯化碳誘導后姜黃素對鯉魚肝臟細胞核Nrf2蛋白水平的影響

如圖7所示，在投喂飼料7 d后，鯉魚肝臟細胞核中的Nrf2含量受姜黃素添加量影響。與陰性對照組相比，陽性對照組，60、120、240 mg/kg組的肝臟細胞核內Nrf2含量均升高，其中，120 mg/kg組最高。

3 討論

3.1 四氯化碳誘導肝臟損傷后姜黃素對鯉魚血液生理指標的影響

動物血液生理指標可用來判斷機體的基礎代謝和營養狀況。通過血液生理指標的變化可判斷機體的營養和健康狀況以及對環境的適應情況[25]。肝臟是動物機體最主要的代謝器官，具有抗氧化、代謝蛋白質及儲存糖元等功能，肝臟損傷可嚴重影響機體的健康。GPT和GOT是魚類最重要的轉氨酶，主要存在于肝臟中，可在一定程度上反映肝臟的生理狀態[26]。當肝細胞受損時，肝臟細胞膜的通透性會發生改變，GPT和GOT會被大量釋放到血液中，因而被認為是檢測肝功損害最具有特異性的重要指標[27]。本研究中，在四氯化碳誘導鯉魚肝臟損傷初期，陽性對照組及60、120、240 mg/kg姜黃素組的血漿GPT和GOT活力顯著高于陰性對照組；但隨著投喂飼料時間的延長，與陽性對照組相比，3個姜黃素組的GPT和GOT活力平均值均有所降低，其中，120 mg/kg組的血漿GPT和GOT活力較60、240 mg/kg組差異更為顯著。這說明姜黃素在一定程度上對鯉魚幼魚肝臟損傷具有修復作用。

血漿TP含量是反應機體營養和代謝水平的重要指標，可維持正常的滲透壓和恒定的pH，并與脂肪、膽紅素、膽固醇和磷酸等的轉運相關。而肝臟是蛋白質合成的唯一場所，當肝臟損傷時，血液TP含量將顯著降低，因而，血液中TP含量也可作為檢測肝臟受損程度的重要指標[28]。有學者認為，在運輸、氨氮、病原菌感染等急性應激下血液蛋白含量將增加，而在慢性應激下將降低[29-30]。然而張春暖[31]研究表明，在急性熱應激和氨氮應激24 h后，團頭魴（Yih）血漿TP含量顯著降低。黃琪琰等[32]對異育銀鯽（）溶血性腹水病的病理及生理反應進行了研究，結果顯示患病魚體的血液TP含量顯著低于健康魚。本研究中，在四氯化碳誘導初期，陽性對照及各姜黃素組TP含量顯著降低，與團頭魴急性熱應激后TP含量的變化一致。隨投喂時間的增加，各姜黃素組TP含量逐漸提升， 120 mg/kg組對TP含量的提升效果最為明顯， 240 mg/kg組提升效果最差。說明飼料中添加姜黃素可在一定程度上促進蛋白質的合成，從而達到抗氧化應激的目的，且當姜黃素添加量為120 mg/kg時效果最優。Harikrishnan等[33]研究植物提取物對鯉生理反應的影響時表明，日糧中添加中草藥提取物能增加血液中的TP含量，使魚體抵抗氧化應激反應，與本研究結論一致。這可能是因為姜黃素可一定程度上提升機體的免疫功能，可通過提高機體的非特異性免疫能力來促進機體代謝，從而維持機體抗氧化平衡，進而達到修復肝臟損傷的目的[34]。

3.2 四氯化碳誘導后姜黃素對鯉魚肝臟相關抗氧化酶和Nrf2 mRNA表達量的影響

SOD是目前為止發現的唯一以超氧陰離子自由基（O2-）為底物的酶，可催化O2-轉化為H2O2和O2。谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px) 又可通過還原性谷胱甘肽 (GSH) 將H2O2催化生成水，以達到抵抗體內自由基的目的。MDA是羥基陰離子 (?OH) 攻擊細胞膜后脂質過氧化的產物。這些相關抗氧化酶在機體中參與肝臟Ⅱ相代謝反應，俗稱Ⅱ相代謝酶。細胞轉錄因子Nrf2是細胞防御氧化應激的重要調節因子，與機體的防御系統密切相關，可通過與機體肝臟酶促反應中相關代謝酶中啟動子區域特定的DNA序列組成的抗氧化反應元件（antioxidant responsive element, ARE）相互作用，上調多種抗氧化酶及解毒酶，提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物質的表達水平[35-36]，從而保護機體組織免受有毒物質的攻擊。本研究中，四氯化碳誘導初期，除陰性對照組外，其他各組SOD、GSH-Px活力和GSH含量均出現不同程度的降低，MDA含量卻相反，這說明四氯化碳對鯉魚幼魚肝臟造成了一定損傷。而當投喂飼料7 d時，陽性對照組和各姜黃素組的SOD、GSH-Px活力和GSH含量較投喂1 d時，均出現不同程度的提高，除240 mg/kg組GSH-Px活力外，投喂7 d時的120和240 mg/kg組的SOD、GSH-Px活力和GSH含量較投喂1 d時差異顯著。同時，肝臟mRNA表達量的結果顯示，與陰性對照組相比，隨著投喂時間的增加，陽性對照和各姜黃素組表達量均值呈不同程度的上升現象。這說明姜黃素可通過調控的表達來上調機體相關抗氧化酶的活力，從而達到維持機體氧化與抗氧化生理平衡以及修復肝臟損傷的目的。

3.3 四氯化碳誘導后姜黃素對鯉魚肝臟組織結構的影響

通過觀察經四氯化碳誘導后魚體的肝臟組織切片可確定姜黃素對鯉肝臟損傷有否修復作用。結果顯示，在四氯化碳誘導初期，魚體肝臟出現空泡化、細胞核偏移及細胞核聚集等現象。投喂姜黃素7 d時，120 mg/kg組肝臟組織已無空泡化、細胞膨大和細胞核聚集現象，與陰性對照組無明顯差異，而陽性對照組和60 mg/kg組肝臟組織仍有細胞核聚集和細胞空泡現象，且240 mg/kg組肝細胞也有輕微空泡化。表明飼料中添加姜黃素對鯉魚肝臟損傷有一定修復作用。其中，以120 mg/kg姜黃素添加效果最佳。原因可能有以下幾點：首先，在肝臟損傷初期，機體產生大量ROS分子，其可導致受損細胞DNA分子損傷，而姜黃素可提高相關抗氧化酶的活力來消除ROS分子；其次，姜黃素作為一種中草藥添加劑，其功能或與大黃素通過調節細胞凋亡相關基因修復肝臟損傷[37]類似，但劑量不足或過量使用均不能達到最優效果。

3.4 四氯化碳誘導后姜黃素對鯉魚肝臟細胞核內Nrf2含量的影響

Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白質家族，是包括p45、Nrf1、Nrf2和Nrf3在內的CNC轉錄因子家族成員中活力最強的轉錄調節因子，主要在機體的代謝器官和解毒器官（如肝臟）中表達。而Nrf2的活性是由胞漿蛋白伴侶分子Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）精確調控的。在正常的生理狀態下，Keap1通過其DGR區結合位點分別與Nrf2和肌動蛋白相結合，從而將Nrf2約束于細胞質中，而當細胞受到外源性化學制劑刺激或者氧化應激時，Keap1或者Keap1的DGR區構象發生變化，進而使Nrf2從Keap1上解離出來，移位至細胞核中，與抗氧化反應元件ARE相互作用，進一步激活了ARE介導下的相關代謝酶基因的表達[38]。本研究中，投喂飼料7 d后，添加姜黃素組鯉肝臟細胞核內Nrf2蛋白含量高于陰性對照組和陽性對照組，其中，以120 mg/kg組核內Nrf2的含量最高。這說明，姜黃素可促使Nrf2從Keap1上解離出來，從細胞質移位至細胞核中，進而參與調控相關抗氧化酶的合成，最終達到修復肝臟損傷和維持機體動態平衡的目的。這與肝臟切片和Nrf2 mRNA表達的結果一致。

4 結論

姜黃素可通過介導Nrf2來提高鯉魚相關抗氧化酶的活力，從而對魚體的肝臟損傷進行修復。當姜黃素的添加水平為120 mg/kg時，機體的抗氧化功能最強，對肝臟損傷的修復力也最強。

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Research of Curcumin on Recovery Effect of Liver Injury inInduced by Carbon Tetrachloride

ZHANG Yuan-yuan1, SONG Li-ping1, GUO Hui2, WANG Xiao-li1

（1.,’250013,2.,’250022,）

【】To evaluate the recovery of curcumin in liver injury ofinduced by carbon tetrachloride (CCl4), for future screening of green treatment drugs for the tr fish hepatobiliary syndrome.【】A basal diet supplemented with 0, 60, 120 and 240 mg/kg curcumin as four experimental diets. The experiment included five groups: positive control group (injected with 15% carbon tetrachloride solution, fed basic feed), negative control group (injected with olive oil, fed basic feed), 60, 120 and 240 mg/kg curcumin group (injected with 15% carbon tetrachloride solution, fed the diet supplemented with 60, 120 and 240 mg/kg curcumin respectively).The activity of GPT, GOT, MDA content, Total Protein (TP) in blood, T-AOC, SOD, GSH, GSH-Px, and expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) were detected, and histological exaination for liver was conducted .【】 By comparing blood physiological indexes (GPT, GOT, TP and T-AOC) and other antioxidant indexes (SOD, MDA, GPx, GSH and Nrf2, et al) among groups at different times, the therapy effect of curcumin to liver injury induced by carbon tetrachloride inwere evaluated. It was found that: during the experiment period, blood physiological indexes and other antioxidant indexes are significantly (<0.05) influenced by the dose and feeding time of curcumin. Initially, there were a significant (<0.05) increase on glutamic oxalacetic transaminase (GOT) and glutamic pyruvictransaminase (GPT) activities of the plasma and liver malondialdehyde (MDA) content in the positive control group and the three curcumin groups, and the mean values of these indexes decreased with increasing feeding time. The activity of GPT, GOT and MDA content of 120 mg/kg group and GPT activity of 240 mg/kg group had a significantly difference(<0.05) with increasing feeding time. In addition, the trend of total protein (TP) and total antioxidant capacity (T-AOC) of plasma and liver superoxidedismutase (SOD), glutathione (GSH) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities were the opposite of that of GPT. T-AOC, SOD and GSH-Px activities and TP and GSH contents of 120 mg/kg group. The activity of SOD and GSH-Px and GSH content of 240 mg/kg group increased firstly and then decreased(<0.05) with increasing feeding time. Curcumin (120 mg/kg curcumin per diet) can repair the damage of liver caused by carbon tetrachloride and restored liver tissue to normal. Results ofmRNA expression in liver and Nrf2 protein level in nucleus also indicated that the dietary supplementation with optimal curcumin could increase themRNA expression in liver and enhance antioxidant status of carp by promoting the release of Nrf2, which increase the activity of antioxidantenzymes and finally protect common carp from liver injury by CCl4.【】Curcumin (especially 120 mg/kg) can improve activities of related antioxidant enzymes through the regulation of Nrf2 activity, so as to repair liver damage in fish.

; liver injury; recoveryeffect; curcumin; Nrf2

S917；S948

A

1673-9159（2020）05-0001-11

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.001

2020-01-04

山東省自然科學基金項目（ZR2018PC030）

張媛媛（1984－），女，博士，助理研究員，從事水產動物營養與免疫研究. E-mail: yyuanzhang2008@163.com

張媛媛，宋理平，郭輝，等. 姜黃素對四氯化碳誘導鯉肝臟損傷的修復作用[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（5）：1-11.

（責任編輯：劉慶穎）