尼羅羅非魚Cullin-1基因克隆及表達

劉鑫潮，黃 瑜，簡紀常

尼羅羅非魚基因克隆及表達

劉鑫潮，黃 瑜，簡紀常

（廣東海洋大學水產學院，廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室暨水產經濟動物病害控制廣東省普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】探究尼羅羅非魚（）（）基因在尼羅羅非魚抵抗病原細菌過程中的作用。從尼羅羅非魚脾臟組織中克隆基因（記為），對其進行生物信息學分析，應用實時熒光定量PCR技術分析在健康魚胸腺、鰓、肝、脾、腸道、頭腎、腦、肌肉、皮膚、血液組織，以及經無乳鏈球菌刺激后病魚脾、腸道、頭腎中的表達?！尽浚℅enBank登錄號XM_003459470.5）編碼區為2 331 bp，編碼776個氨基酸，理論分子質量為89 ku，理論等電點為8.16。氨基酸序列分析顯示，有1個高度保守的泛素樣蛋白結構域Nedd8（ubiquitin-like domain），N′ 端有一個的信號肽序列。系統進化樹分析表明，序列與伯氏擬麗魚（）相似性最高，為98.7%。qRT-PCR顯示在健康尼羅羅非魚各組織中均有表達，其中在頭腎中表達量最高，其次是胸腺、腦、皮膚，在腸道中表達量最低。經無乳鏈球菌刺激后，表達量在脾臟和腸道中均顯著上調，頭腎、脾臟和腸道均在48 h表達量最大。參與尼羅羅非魚抵抗無乳鏈球菌過程中的免疫應答。

尼羅羅非魚；；基因表達；免疫應答；無乳鏈球菌

尼羅羅非魚（）有肉質細嫩、味道鮮美、營養價值高、環境適應能力強、生長速度快等特點，是我國南方重要的養殖品種[1]。然而隨著養殖規模的不斷擴大，近年來鏈球菌病頻發，嚴重影響國內尼羅羅非魚養殖業穩定發展[2-4]。羅非魚免疫研究有助于抗菌藥物及疫苗的開發，研究其免疫系統及免疫應答有重要意義。

（）在蛋白質降解和泛素化中有重要作用，是SCF（SKP1-CUL1-Fbox）E3泛素連接酶復合物的重要組成部分，可介導泛素化蛋白參與細胞周期進程、信號轉導和轉錄，在先天免疫應答中有調控作用。目前對該基因的研究報道主要是在植物的細胞周期調控[5]和人的腫瘤[6-7]、癌癥[8]等方面，在尼羅羅非魚中尚未見報道。本研究通過克隆尼羅羅非魚基因（），分析該基因氨基酸序列，研究在健康和經無乳鏈球菌刺激的羅非魚體內的表達模式，為更好地研究羅非魚免疫機制提供理論基礎和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

健康尼羅羅非魚購自湛江市某羅非魚養殖場，在廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室于(28±2) ℃條件下暫養1周，體質量約100 g。RNA提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、cDNA合成試劑盒、qPCR試劑盒購自北京全式金公司；克隆質粒 pMD18-T載體購自TaKaRa 公司（大連）；RNAlater、DNA 膠回收純化試劑盒購自Thermo公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成?？寺「惺軕B細胞大腸桿菌() DH5α及無乳鏈球菌（ZQ0910）菌種由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚總RNA提取和反轉錄 隨機取健康羅非魚，剖取適量脾臟組織于2.0 mL無RNA離心管，浸泡于1 mLTrizol后立刻使用研磨器研磨，按照TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取羅非魚脾臟總RNA。根據TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書將提取的RNA反轉錄成cDNA。于-80℃下保存備用。

空白對照腹腔注射滅菌的0.1 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，實驗組注射0.1 mL PBS重懸過的1×107cfu mL-1無乳鏈球菌。分別在注射后0、3、6、12、24、48、72、96 h各取羅非魚3尾，取適量脾臟、頭腎和腸道組織，放入2.0 mL無RNA離心管，浸泡于1 mL Trizol 后立即用研磨器研磨。同法提取RNA，并反轉成cDNA。– 80 ℃下保存備用。

1.2.2 尼羅羅非魚基因的克隆 根據本實驗室所測得的羅非魚轉錄組數據(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA244908)，利用Primer Premier 5.0分別設計克隆引物-F/R和熒光定量引物--436F/--532R（表1），以β-actin為內參。以羅非魚脾臟cDNA為模板，利用引物F/R對羅非魚基因編碼序列片段進行擴增，反應體系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7 μL，cDNA模板1 μL，F/R各1 μL。反應條件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min 20 s，33個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。PCR產物經電泳檢測、目的條帶切膠回收后與載體pMD 18-T連接，連接產物轉化至DH5α感受態細胞，涂布于含Amp+的LB瓊脂平板，于37 ℃條件下培養12 h。挑取單菌落于含Amp+的LB液體培養基，于37 ℃、200 r/min條件下培養1 h，通過菌落PCR鑒定，陽性菌送生工生物(廣州) 股份有限公司測序。

表1 引物

1.2.3基因序列分析 將陽性克隆的測序結果用DNAMAN軟件拼接，從而獲得On-CUL1編碼序列和推導氨基酸序列，用ExPASy (http:// expasy.org/tools/) 進行蛋白質分析得到理論等電點預測、分子質量和親水性參數等。用InterProScan程序（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/ iprscan/）預測結構域。用Soft Berry-Psite (http://lin-ux1.softberry. com/berry.phtmltopic=psite&group=pro-grams&sub group=prolocInterProscan)預測氨基酸基本功能位點分布。用PORTER (http://www. distill. ucd.ie/porter)、SWISSM-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/11 intera-ctive)預測二級結構、三維結構。通過在線BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對核苷酸序列和氨基酸序列進行同源性比對。用DNAMAN程序對On-CUL1氨基酸序列進行多重比對。通過MEGA6.0軟件，用N-J法構建系統進化樹。

1.2.4 qPCR驗證羅非魚CUL1組織分布 以β-actin為內參基因，cDNA為模版，通過ABI7500 Real-Time定量PCR儀（Bio-Rad，CA，USA）進行qRT-PCR。引物見表1。反應結束后應用ABI 7500 Software V2.0.5，采用2-△△Ct法計算在組織中的相對表達量。用SPSS 17.0軟件進行統計分析。數據用單因素方差分析，表示為平均值±標準差，顯著性水平= 0.05。

2 結果與分析

2.1 尼羅羅非魚CUL1基因克隆與序列分析

克隆的（GenBank登錄號：XM_003459470.5）全長為2 331 bp，可編碼776個氨基酸（圖1）。分析推導的氨基酸序列，CUL1蛋白理論分子質量為89 ku，等電點為8.16，其中亮氨酸（Leu）比例最高，為11.7%，其次為賴氨酸（Lys），為8.5%，其中帶正電荷的氨基酸有103個，帶負電荷的氨基酸有107個。

“”，N-糖基化位點；“”，蛋白激酶C磷酸化位點；“”，酪氨酸激酶磷酸化位點；“”，豆蔻?；稽c；“”，酰胺化位點；“”，異戊二烯基結合位點；“”，微體c端定位信號；“*”，終止子；加粗部分，信號肽。

經預測，CUL1序列無跨膜結構域（圖2），有1個N-糖基化位點，11個蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，1個豆蔻?；稽c，2個酰胺化位點，1個異戊二烯基結合位點，17個微體c端定位信號；存在信號肽，1 ~ 20為信號肽區域，其中信號肽剪切位點在第20 ~ 21位氨基酸之間；該蛋白總平均親水值為0.937，可能是疏水性蛋白。ProtScale分析表明，On-CUL1蛋白疏水性氨基酸含量較高，疏水區域較大，為疏水性蛋白，與理化分析結果一致。因此推測基因編碼的蛋白質為疏水性蛋白。

圖2 On- CUL1氨基酸序列保守結構域分析

2.2 On-CUL1二級結構和三級結構

經預測，羅非魚CUL1蛋白二級結構（圖3）有無規則卷曲（24.23%）、α-螺旋（64.95%）、β-折疊（3.61%）、拓展鏈（7.22%）。圖4為對On-CUL1蛋白同源建模結果，是以2hac.1.A為模版，分別用羅非魚和人類的CUL1氨基酸序列構建的三維結構。對氨基酸三維建模佐證了二級結構的正確性。

2.3 羅非魚CUL1序列同源比對及進化分析

克隆的與NCBI數據庫中其他物種序列的比對結果表明，與伯氏樸麗魚（）同源性最高，為98.71%，與大黃魚（）的為94.25%，與金頭鯛（）的為94.21%。與非洲爪蟾（）、伯氏樸麗魚、大西洋鮭（）、野豬（）、人（）、大杜鵑（）的基因同源性比對結果（圖5）顯示，二者相似性均達到90%以上，分別為95.24%、98.71%、96.78%、95.68%、95.45%、95.88%，說明功能十分保守，進化變異極小。推測它們是同源序列氨基酸序列的系統進化樹可見，羅非魚與伯氏樸麗魚及斑點叉尾鮰（）聚為一支（圖6），顯示了較高的同源性。

Fig. 4 Three-dimensional structure of CUL1 in tilapia and Homo sapiens

S. salar, XP_014045939.1; O. niloticus, XP_003459518.1; H. burtoni, XP_014185177.1; H. sapiens, NP_001357590.1; X. tropical, NP_001039255.1; S. scrofa, XP_020919247.1; C. canorus, XP_009566761.1；“.”為相同的氨基酸序列

圖6 N-J 法構建CUL1氨基酸系統進化樹

2.4 尼羅羅非魚CUL1組織表達分析

圖7顯示，在10個組織中均可表達，在頭腎中表達量最高，其次是胸腺、腦和皮膚，在腸道、肝臟和鰓中表達量較低。經無乳鏈球菌（）刺激后，在頭腎、脾臟和腸道中不同時間點的表達量差異較大（圖8），但均在48 h達到表達高峰。

In，腸道；Li，肝；Bl，血液；Gi，鰓；Sp，脾；Sk，皮膚；Mu，肌肉；Br，腦；Th，胸腺；HK，頭腎

*，與0 h比較P＜0.05；**，與0 h比較P＜0.01

3 討論

本研究克隆獲得尼羅羅非魚序列，其ORF為2 331 bp，編碼776個氨基酸，與其他魚類之間同源性較高，其中許多氨基酸和功能位點是保守的。推導得到編碼CUL1的氨基酸序列，預測該序列含有一個信號肽區域和一個泛素樣蛋白結構域，該結構域有1個蛋白激酶C (PKC) 磷酸化位點(氨基酸位點739 ~ 741)，暗示該蛋白有完整的抗原結合位點，這在抗原信息傳遞過程中有重要作用[9]。經比對，與伯氏樸麗魚的同源性為98.71%，該蛋白在系統進化樹中與伯氏樸麗魚聚為一支，而與其他物種親緣關系較遠。綜上，CUL1蛋白在進化過程中保守性較高，在不同物種間可能有一定差異性。

人在不同組織中均可表達，主要是免疫系統、肌肉、腸道、腦和肺等中有較高的表達。目前尚未見在魚類中表達的研究報道。本研究顯示，在頭腎中表達量最高，其次是胸腺、腦、皮膚、肌肉和脾臟，在腸道中表達量最低。頭腎是羅非魚的重要免疫器官之一，含有大量B和T淋巴細胞，可制造白細胞與毀滅陳舊紅細胞[10-12]。胸腺亦為羅非魚的重要免疫器官，是T細胞增殖分化的主要場所[13-14]，在腦組織中的高量表達可能是因為無乳鏈球菌獨特的感染方式，無乳鏈球菌可穿過血腦屏障感染魚類腦部，被巨噬細胞吞噬后隨血液進入顱腔，從而引發疾病[15-16]。皮膚和腸道是重要的黏膜免疫組織，羅非魚皮膚是免疫保護的第一道防線，其表面可分泌黏液，分布有大量的T淋巴細胞及其他白細胞，從而有參與細胞免疫應答的基礎[17-18]。而CUL1在尼羅羅非魚中的研究尚淺，具體抵御病原細菌入侵的機制尚不清楚，需進一步研究。

經無乳鏈球菌刺激后，在頭腎、腸道、脾臟組織中，表達總體上均呈先升后降的趨勢，于48 h時達到高峰。在腸道組織中，于48 h時表達量達到高峰，其表達量約為對照組的3倍，在96 h時再次出現一個小高峰，可能與腸道免疫系統的二次免疫有關。在頭腎組織中，在6、24 h時表達量下調，于48 h達到高峰，其表達量約為0 h時表達量的2倍。這可能與頭腎這一重要的免疫器官在感染初期無乳鏈球菌可抑制免疫應答功能[19]相關。脾臟組織經無乳鏈球菌感染后呈大幅度上調趨勢，于48 h時達到高峰，其表達量約為對照組0 h時的18倍以上。脾臟是無乳鏈球菌感染主要的感染器官[20]，脾臟中的高水平表達說明羅非魚脾臟在對機體的免疫保護上可能發揮著更大的作用[21]。以上結果均表明，在宿主免疫防御中起重要作用，為參與免疫的研究提供重要依據。

4 結論

本研究成功克隆，On-CUL1有1個高度保守的泛素樣蛋白結構域CUL1 Nedd8，序列在不同物種間的保守性極高。在10種組織中均有表達，其中頭腎、胸腺、腦中表達量較高。經無乳鏈球菌刺激后，腸道、頭腎、脾臟的表達量呈時序性上調，在刺激48 h時，三組織中的表達量均最高，說明參與了尼羅羅非魚抵御細菌侵染過程中的免疫應答反應。

[1] 黃家慶, 徐田祥. 小體積高密度網箱養殖尼羅羅非魚技術[J]. 齊魯漁業, 2004, 21(7): 17-19.

[2] 張新艷, 樊海平, 鐘全福, 等. 羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定及致病性研究[J]. 水產學報, 2008, 32 (5): 772-779.

[3] 黃錦爐. 羅非魚無乳鏈球菌病病原學、病理學及基因的原核表達研究[D]. 雅安：四川農業大學, 2012.

[4] 謝彩霞, 汪志文, 魯義善, 等. 尼羅羅非魚基因的克隆和mRNA表達分析[J]. 廣東海洋大學學報, 2020, 40(1): 8-14.

[5] 周蕊, 余澤華. 泛素化途徑與細胞周期的關系[J]. 生命科學, 2003, 15(3): 147-150.

[6] ZHOU Y H, XIA J Z, XU W H, et al. Cullin-1 promotes cell proliferation in human breast cancer and is related to diabetes[J]. International Journal of Biological Markers, 2016, 31(4):375-381.

[7] 雍紅梅.基因在乳腺癌發生發展中功能及分子機制研究[D]. 徐州: 徐州醫學院, 2012.

[8] WANG W, LIU Z H, QU P, et al. Knockdown of regulator of cullins-1 (ROC1) expression induces bladder cancer cell cycle arrest at the G2 phase and senescence[J]. PLoS One, 2013, 8(5):1-11.

[9] 汪志文, 張海艷, 黃瑜, 等. 尼羅羅非魚基因的分子克隆與mRNA表達分析[J]. 基因組學與應用生物學, 2017, 36(1): 190-200.

[10] HANSEN J D, KAATTARI S L. The recombination activating gene 1 (RAG1) of rainbow trout (): cloning, expression, and phylogenetic analysis[J]. Immunogenetics, 1995, 42(3): 188-195.

[11] HANSEN J D, KAATTARI S L. The recombination activating gene 2 (RAG2) of the rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J]. Immunogenetics, 1996, 44(3): 203-211.

[12] HANSEN J D, STRASSBURGER P, DU PASQUIER L. Conservation of a master hematopoietic switch gene during vertebrate evolution: isolation and characterization of Ikaros from teleost and amphibian species[J]. European Journal of Immunology, 1997, 27(11): 3049-3058.

[13] GAN Z, WANG B, ZHOU W, et al. Molecular and functional characterization of CD59 from Nile tilapia () involved in the immune response to[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2015, 44(1): 50-59.

[14] CESTA M F. Normal structure, function, and histology of the spleen[J]. Toxicologic Pathology, 2006, 34(5): 455-465.

[15] SCHUCHAT A. Epidemiology of group B streptococcal disease in the United States: shifting paradigms[J]. Clinical Microbiology Reviews, 1998, 11(3): 497-513.

[16] ROBINSON J A, MEYER F P. Streptococcal fish pathogen[J]. Journal of Bacteriology, 1966, 92(2): 512-513.

[17] KOZONO Y, ABE R, KOZONO H, et al. Cross-linking CD21/CD35 or CD19 increases both B7-1 and B7-2 expression on murine splenic B cells[J]. Journal of Immunology, 1998, 160(4): 1565-1572.

[18] 羅曉春, 謝明權, 黃瑋, 等. 魚類粘膜免疫研究進展[J]. 水產學報, 2005, 29(3): 411-416.

[19] MERINO-CONTRERAS M L, GUZMAN-MURILLO M A, RUIZ-BUSTOS E , et al. Mucosal immune response of spotted sand bass(Steindachner, 1868) orally immunised with an extracellular lectin of[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2001, 11(2): 115-126.

[20] 唐玫, 馬廣智, 徐軍. 魚類免疫學研究進展[J]. 免疫學雜志, 2002, 18(z1): 112-116.

[21] 樊博琳, 黎源, 汪志文, 等. 尼羅羅非魚基因克隆及其組織表達分析[J]. 廣東海洋大學學報, 2018, 38(6): 6-12.

Cloning and Tissue Expression Analysis of the Cullin-1 in Nile Tilapia()

LIU Xin-chao, HUANG Yu, JIAN Ji-chang

(,,524088,)

【】To explore the role of cullin-1 (CUL1) gene of the Nile tilapia () inthe defense of pathogenic bacteria. 【】The CUL1 gene (named) was cloned from the spleen of the Nile tilapia (), and bioinformatics analysis of the gene was performed, and the expression of On-in the thymus, gills, liver, spleen, intestine, head kidney, brain, muscle, skin, and blood tissues of healthy fish, and the spleen, intestine, and head kidney ofstimulated fish was analyzed by fluorescence quantitative PCR. 【】The coding region of On-CUL1 gene was 2 331 bp, and encoding a 776 amino acids protein with a theoretical molecular mass 89 ku, and isoelectric point 8.16. On-CUL1 had a highly conserved ubiquitin-like domain,Nedd8 (ubiquitin-like domain), and a signal peptide sequence at the Nterminal.showed the highest similarity with(98.7%).was expressed in all tissues of healthy Nile tilapia, with the highest expression in head kidney, followed by thymus, brain and skin, and the lowest expression in intestine.After it was stimulated by inactivated. The expression ofwas significantly up-regulated in the spleen and intestine. The expression levels in the body kidney, spleen and intestine peaked at 48 h. 【】was involved in the immune response of Nile tilapia against

;; gene expression; immune response;

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）05-0027-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.004

2020-03-06

國家自然科學基金（31572651）；高校重大科研成果培育計劃類項目（GDOU2013050309）；廣東省普通高校青年創新人才項目（230419083）

劉鑫潮（1996－），男，碩士，研究方向為水產經濟動物病害控制。E-mail: 767322063@qq.co

簡紀常，男，教授，研究方向為水產經濟動物病害防治。E-mail: jianjc@gmail.com

黃瑜，男，博士，研究方向為水產經濟動物病害防治。 E-mail: huangyu@gdou.edu.cn

劉鑫潮，黃瑜，簡紀常. 尼羅羅非魚Cullin-1基因克隆及表達[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（5）：27-33.

（責任編輯：劉慶穎）