銀杏葉黃酮實驗室提取技術進展

摘 要：銀杏葉黃酮已成為研究熱點，而黃酮的實驗室提取是分離純化、結構鑒定和活性探究等的前提。目前，銀杏葉黃酮實驗室提取技術主要有傳統的堿液提取、熱水提取、有機溶劑提取和新興的酶輔助提取、超臨界流體提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取等。本文對銀杏葉黃酮的實驗室提取技術進行了歸納總結和評價，并在此基礎上進行了展望，以期為銀杏葉黃酮的進一步開發提供借鑒。

關鍵詞：銀杏葉;黃酮;提取

銀杏（Ginkgo biloba L.）系銀杏科銀杏屬喬木，亦稱白果樹或公孫樹，是古老的中生代孑遺植物，有“活化石”的美稱[1-2]。我國銀杏資源豐富，約占全世界的70%左右[3]，每年秋季有大量的銀杏葉落葉被丟棄或焚燒，造成一定污染。銀杏葉含黃酮、萜類物質、生物堿、糖類物質和蛋白質等，其中黃酮是銀杏葉提取物的關鍵藥效成分之一。黃酮廣泛存在于自然界，具有多種活性，例如抗氧化、抑菌、抗腫瘤和護肝等，且無明顯副作用，可應用于制藥和食品加工等領域[4]。迄今，已有大量關于銀杏葉黃酮提取的報道，本文對近年銀杏葉黃酮的實驗室提取技術進行了綜述和展望，擬為銀杏葉黃酮的進一步開發提供支持與參考。

1 傳統提取方法

1.1 堿液提取

銀杏葉黃酮大多具有酚羥基，呈弱酸性，難溶于酸性水，易溶于堿性水，因此可以利用堿性水溶液或堿性醇溶液提取，之后，對提取液進行酸化，使銀杏葉黃酮形成沉淀析出。黃酮母核的多樣性主要與黃酮骨架、環系的變化、氧化程度和數量有關，在加熱條件下，高濃度堿液可破壞黃酮的母核結構;提取液被酸化時，為防止生成“佯鹽”，pH值也不能太低。在已報道的堿液提取銀杏葉黃酮工藝中，使用較多的堿液有氫氧化鈉-水溶液、氫氧化鈉-乙醇溶液及碳酸鈉-水溶液等，pH值一般控制在9.0～10.0;酸化提取液時一般使用硫酸或鹽酸調節pH值。堿液提取銀杏葉黃酮可提高提取得率、縮短提取時間，且使蛋白質、粘液質和含COOH-果膠等形成沉淀而被除去，缺點是提取設備易被腐蝕。齊建等[5]比較了幾種溶劑對銀杏葉黃酮提取得率的影響，發現0.2% NaOH的提取效果優于蒸餾水。

1.2 熱水提取

天然黃酮除少數游離外，大多與糖結合形成苷，其中黃酮苷易溶于水、乙醇、甲醇等;游離的黃酮即黃酮苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇等有機溶劑，根據“相似相溶”原理，熱水提取銀杏葉黃酮得到的主要成分是黃酮苷[6]。閆高穎等[7]用熱水提取銀杏葉黃酮，通過優化得到最適工藝：100 ℃條件下提取3次，每次1 h，料液比為1∶26，在此條件下黃酮得率為0.59%。熱水提取銀杏葉黃酮的優點是提取溶劑無毒、無味、無污染且可再生，具有提取設備簡單、成本低和提取液中的脂溶性雜質少等優點，但熱水提取需要的溫度較高，一般在90 ℃以上，易使銀杏葉黃酮的生物活性受損;提取過程中溶出的蛋白質、無機鹽及其他一些水溶性雜質，導致提取液易腐敗變質，加大了后續分離純化的難度。

1.3 有機溶劑提取

當原料加入到有機溶劑中時，有機溶劑會進入細胞壁，滲透到細胞內，溶解可溶性物質，使細胞內外產生濃度差，直到細胞內外的溶液濃度達到動態平衡。為減小溶劑揮發損失和提高提取效率，該技術一般采用回流加熱裝置，可供選的溶劑有甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮等，其中甲醇和丙酮毒性較大，正丁醇沸點較高且有刺激性，都很少使用，大多使用廉價、易回收、毒性小的乙醇，并將乙醇與水混溶作為提取溶劑S[8]。乙醇濃度越高，提取溶劑極性越低，色素等脂溶性雜質越易溶出，乙醇濃度越小低，提取溶劑極性越大，水溶性雜質越易浸出，因此在銀杏葉黃酮的有機溶劑提取工藝中，乙醇濃度一般控制在50%～85%，李英[9]在乙醇浸提銀杏葉黃酮的工藝中，得到理想條件：4倍體積（v/w）的濃度為70%的乙醇溶液于60 ℃條件下進行6級（單級

20 min）逆流浸提。有機溶劑提取所需溫度一般低于熱水提取，且提取液過濾、溶劑回收和產物干燥等過程易于進行，但存在能耗高、污染大、效率低與耗時長等缺點。

2 新興提取方法

2.1 酶輔助提取

酶輔助提取能提高銀杏葉黃酮提取得率，且反應條件溫和、污染小，具有黃酮活性受損小、結構受保護等優點[10]。該技術是利用酶降解細胞壁成分，從而改變細胞壁通透性，減小銀杏葉黃酮從胞內溶出的阻力，以提高提取得率;亦可采用轉苷酶和糖等底物將黃酮苷元轉換成黃酮苷，以提高黃酮在提取溶劑中的溶解度，促進提取的進行。植物細胞壁由纖維素、果膠、半纖維素等組成，在破壞細胞壁結構方面，可選擇的酶有纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶及復合酶等。馮自立等[11]采用復合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1）提取銀杏葉黃酮，發現復合酶用量為銀杏葉的1/300、酶解

4.0 h、溫度50 ℃、初始pH為5.0時，酶解效果最佳，該工藝條件下，總黃酮提取率為92.38%。纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶等是蛋白質，溫度、pH值與提取溶劑種類等都會影響其酶活，條件過高或過低都會使酶活性受損，在銀杏葉黃酮提取工藝中，提取溫度一般為40～50 ℃，pH值一般為4.5～7.0。

2.2 超臨界流體提取

近些年，超臨界流體提取技術已被廣泛應用于醫藥、食品和石油等領域[12]。在超臨界流體提取銀杏葉黃酮的工藝中，可供選的溶劑較多，如CO2、NO、NH3和C2H6等，其中CO2以不燃、無毒、價廉且無色，具有易精制、易達到超臨界條件等優點而被普遍使用。CO2是非極性物質，純SF-CO2適合提取極性較低的親脂性物質或分子量較低的脂肪烴，但銀杏葉黃酮以極性的黃酮苷居多，目前主要通過添加夾帶劑提高銀杏葉黃酮在SF-CO2中的溶解度以提高提取得率，乙醇是常用的夾帶劑，Shi-Feng Miao[13]等采用超臨界CO2提取銀杏葉黃酮，得到最適條件：提取壓力20 MPa、提取溫度40 ℃、夾帶劑乙醇流量

6 mL/min、CO2流量10 g/min、提取時間90 min，在此條件下黃酮得率為0.36%。超臨界CO2提取銀杏葉黃酮所需溫度較低，SF-CO2具有抗氧化和滅菌作用，且溶劑殘留少、污染小，因此有“綠色技術”的美名;但裝備復雜，投資大、成本高，導致建立大規模生產線難度大[14-15]。

2.3 超聲波輔助提取

超聲波是一種頻率高于人類聽覺上限的聲波，它方向性好、穿透力強，常用來提取、清洗、消毒殺菌和碎石等[16]。超聲波輔助提取銀杏葉黃酮是利用超聲波的空化、機械、熱和化學效應等加速細胞內有效成分的釋放、擴散和溶解，促進提取的進行。羅教等[17]利用超聲波輔助提取銀杏葉黃酮，通過工藝優化，確定在液料比30∶1（mL/g）、乙醇濃度70%、提取溫度75 ℃條件下超聲20 min，提取得率可達2.781%。超聲波輔助提取銀杏葉黃酮操作簡單，設備維護和保養方便，具有雜質溶出少和低溫節能等優點，缺點是會產生噪音，且超聲波能斷開碳-碳鍵，產生活性較強的自由基，破壞黃酮的生物活性及穩定性[18]。可供選的超聲波裝置有超聲波細胞粉碎機、超聲波發生器和超聲波清洗器等，大多超聲波清洗器不具有功率調節功能，但其成本低、容量大、投料方便，因此在銀杏葉黃酮提取工藝中的應用較多。

2.4 微波輔助提取

自1987年Ganzler等[19]率先使用微波技術分別從蠶豆和棉花中提取嘧啶苷和棉籽酚以來，微波已被廣泛應用于黃酮、生物堿、多糖等天然活性物質的輔助提取中。傳統熱提取是以熱傳導、熱輻射等途徑從外向里進行加熱，這種方法效率低、時間長;微波輔助提取銀杏葉黃酮主要是利用微波的熱效應，微波可瞬間穿透物料，里外同時受熱進行提取，因此該技術具有較高的黃酮得率且省時，一般僅需1～30 min，這是該技術最顯著的特點，此外該技術的優點有：易控制、選擇性好和節能等[20-21]。微波輔助提取銀杏葉黃酮的缺點是若微波輻射不均勻，易造成局部溫度過高，致使黃酮活性受損，且設備泄漏的微波輻射會對人體造成慢性損傷。在微波輔助提取銀杏葉黃酮工藝中，影響提取效果的參數包括溶劑種類、料液比、溶劑濃度、微波時間、微波溫度與微波功率等，因微波溫度與微波功率這兩者具有較高的相關性，在實驗中一般只考慮其中一個因素，且大多只考慮微波功率，徐春明等[22]利用微波輔助提取銀杏葉黃酮，結果表明：在最優條件料液比1∶15（g/mL）、乙醇濃度70%、微波功率300 W、微波時間1 min下黃酮得率為2.698%。

2.5 其他新興提取技術

其他新興提取技術有聯合提取和微生物發酵提取等。聯合提取是指將兩種或兩種以上的輔助技術同時先后應用于提取中，輔助技術有超聲波-微波、超聲波-酶、微波-酶和等，提取溶劑可以是水、堿液和乙醇等。微生物發酵提取銀杏葉黃酮是利用微生物在發酵過程中產生的復合酶系分解細胞壁中的大分子，如纖維素、半纖維素和果膠等，促進目標組分從細胞內溶出;該技術的優點是成本較低，且實驗條件溫和，但周期較長，一般需要幾天的時間，且培養基、菌體和代謝產物的存在給銀杏葉黃酮粗提液的分離純化帶來困難。

3 展望

在銀杏黃酮提取新工藝的開發中，可以從輔助技術和提取溶劑兩方面下手;在考慮提高提取得率和保護黃酮生物活性的同時，應結合提取工藝的成本、安全性、穩定性、試劑回收方法以及提取渣的處理方式等。并積極開發提高原料利用率的措施，例如將提取渣作為提取其他有效成分的原料或經過處理使之變成飼料或肥料。

目前，銀杏葉黃酮的提取工藝大多僅以黃酮得率為考察指標，但銀杏葉除含有黃酮外，還有萜類、多糖和生物堿等，在資源日漸匱乏的情況下，有必要加強對銀杏葉中活性物質的綜合提取研究。銀杏葉黃酮粗提液中有大量雜質，如脂肪、蛋白質和色素等，需純化才能被更好地應用，如能將純度納入評價指標，可以減輕后續分離純化工藝的負擔。

樹齡、性別、季節、光照、產地、海拔、溫度和降雨量等因素會對銀杏葉黃酮含量、成分和功效等產生影響，吳雅瓊等[23]對不同產地銀杏黃酮及相關活性物質含量情況進行了研究，發現來自漢中的銀杏葉中黃酮含量最高。都勻產地黃酮含量的變異系數最大，在產地間選擇的同時也需要關注產地內的選擇。

銀杏樹生長緩慢，自然條件下從栽種到結果要20多年，大量結果則要更久，因此得名“公孫樹”。植物組織培養省時、占地少，可獲得無毒苗，不受季節限制，且具有繁殖方式多和經濟效益高等優點，利用銀杏組織培養技術為銀杏葉黃酮的提取提供優質原料是一個值得探討的課題。

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作者簡介：谷政偉（1990—），男，湖南郴州人，碩士。研究方向：化學元素含量分析。