大孔樹脂純化平臥菊三七總有機酸工藝研究

趙玉榮，曾 銳，張藝蓉，陸姍姍

（南京中醫藥大學翰林學院，江蘇泰州 225300）

0 引言

平臥菊三七Gynura procumbens Lour.為菊三七屬多年生草本植物，具有降糖、降血脂、抗氧化等功效［1-3］，有研究表明總有機酸是其抗氧化作用的有效組分之一［4］。前期研究發現平臥菊三七中抗氧化成分主要集中在乙酸乙酯部位，并通過液質聯用技術鑒定了其主要含有有機酸類成分，如綠原酸、阿魏酸等［5］。同時，應用星點設計-響應面法優化了平臥菊三七中綠原酸的提取工藝［6］。近年來，大孔樹脂被廣泛應用于有機酸的提取工藝純化中。因此，本研究通過比較不同大孔樹脂的靜態吸附與解吸附性能，篩選出分離純化平臥菊三七總有機酸的最優樹脂，并對上樣質量濃度、乙醇洗脫濃度、乙醇洗脫體積進行優化，為合理開發利用平臥菊三七資源提供理論基礎。

1 儀器與材料

平臥菊三七（江蘇省野生蔬菜研究所），大孔樹脂DM301（批號：2019-012），DM130（批號：2019-003），HPD100（批號：2019-005），HPD450（批號：2018-079），AB-8（批號：2018-090），均購于鄭州勤實科技有限公司。一水合檸檬酸（國藥集團化學試劑有限公司），鄰苯二甲酸氫鉀（上海凌峰化學試劑有限公司），NaOH固體顆粒（西隴科學股份有限公司）。KH-500B型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；THZ-82恒溫振蕩器（華藥企業），pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 提取物的制備

稱取平臥菊三七藥材500 g，加入10倍量80%乙醇，80℃回流提取1 h，重復提取3次，抽濾，合并提取液。減壓濃縮至終體積為500 mL，以等體積石油醚萃取3次除雜，保鮮膜密封，4℃保存備用。

2.2 NaOH溶液濃度的標定

取100℃烘干至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀0.418 0 g，酚酞為指示劑，滴定配制的NaOH溶液，平行測量3次，取平均值。測得NaOH溶液的準確濃度為0.096 4 mol/L。

2.3 總有機酸的測定

參考朱晨晨等［7］方法，采用電位滴定法測定總有機酸。取平臥菊三七提取液或檸檬酸適量，加水溶解，定容，精密取，按電位滴定法，即將pH復合電極插入液面下，開啟攪拌，確保滴定過程中待測溶液中濃度均勻，用上述標定的NaOH滴定，測量有機酸的含量。采用Excel 2010版繪制一階導數曲線（ΔE/ΔV）-V。一階導數曲線最高點對應的體積即為滴定終點體積，以檸檬酸計算總有機酸含有量。

2.4 檸檬酸消耗的標準NaOH的量

稱取檸檬酸0.135 0 g，用適量的蒸餾水溶解，充分吸收，已標定的NaOH滴定檸檬酸溶液進行測量。如圖1所示，曲線的極大值對應體積就是滴定終點，消耗堿量為20.05 mL，即為滴定突躍點。計算為每消耗每1 mL NaOH滴定液（0.096 4 mol/L）相當6.020 9 mg的檸檬酸。

圖1 檸檬酸對照品一階導數滴定曲線

2.5 平臥菊三七提取液中總有機酸測定

取平臥菊三七提取液1 mL，蒸餾水定容至50 mL，超聲溶解，用上述NaOH溶液滴定，結果如圖2所示。平臥菊三七粗提取液滴定至NaOH溶液消耗體積為1.75 mL時存在明顯的滴定突躍，即每1 mL的平臥菊三七提取液中含有相當于10.536 6 mg的檸檬酸量。

圖2 平臥菊三七提取液中平臥菊三七提取液中總有機酸一階導數滴定曲線

3 酸純化工藝優化

3.1 大孔樹脂預處理

取DM301，DM130，HPD100，HPD450，AB-8大孔樹脂200 g，用95%乙醇浸泡溶脹24 h，濕法裝柱，用2 BV的95%乙醇洗脫，以蒸餾水沖洗至無醇味，備用。

3.2 大孔樹脂的篩選

3.2.1 靜態吸附-解析性能考察實驗

稱取樹脂各5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入平臥菊三七提取液5 mL，置于水浴振蕩器中振蕩2 h，待充分吸收后過濾，取蒸餾水洗滌大孔樹脂，轉移至錐形瓶中，再加入50%乙醇30 mL，置于水浴振蕩器中，充分振蕩，測定吸附率和解吸率進行比較，公式為吸附量=（C0-V1）V1/m；解吸量=C2V2/m；吸附率=［（C0-C1）/C0］×100%；解吸率=解吸量/吸附量×100%（C0為總有機酸初始質量濃度，C1為吸附平衡后總有機酸質量濃度，C2為解吸后總有機酸質量濃度，V1為吸附液體積，V2為解吸液體積，m為大孔樹脂質量），實驗結果如表1所示。

表1 5種大孔樹脂對平臥菊三七總有機酸靜態吸附的影響

結果顯示：HPD100，DM301，HPD100對有機酸都有較高的解析率，但HPD450在預處理階段顆粒大小不均一，容易分層，實驗結果不穩定，故不采用；HPD 100和DM301的吸附量和解析量都比較高，做動態吸附，進一步篩選最優樹脂。

3.2.2 動態吸附-解析性能察實驗

取5種類型的樹脂10 g，裝入統一規格的色譜柱（2.0 cm×40 cm），量取5 mL樣品溶液，加蒸餾水30 mL進行稀釋，用蒸餾水沖洗樹脂直至流出液基本無顏色，用NaOH溶液滴定液滴定，測定有機酸含量，如表2所示。

表2 5種大孔樹脂對平臥菊三七中總有機酸動態吸附的影響

綜合結果顯示DM301對平臥菊三七提取液中的有機酸成分有較高的吸附率，HPD100靜態吸附雖然較高而且動態比吸附量最高，但是比解析量較少，導致動態的解析率只有48.34%，故采用DM301為最優樹脂。

4 大孔樹脂對平臥菊三七總有機酸純化工藝研究

4.1 上樣質量濃度對平臥菊三七提取液有機酸吸附量的影響

取DM301大孔樹脂3 g，置于50 mL錐形瓶中，分別量取3.32，5.07，7.18，7.61，8.51 mL的母液，然后加水定容至10 mL，配成3.5，5.34，7.57，8.02，8.97 mg/mL的總有機酸，放入水浴振蕩器中振搖2 h，待充分吸附后過濾，用上述NaOH溶液滴定，測定比吸附量，比較上樣濃度。

結果顯示，上樣質量濃度在3.5～7.57 mg/mL時，吸附量隨著濃度的增加而增加，而達到7.57 mg/mL后吸附量隨著變化量的增加而逐漸減少，考慮到上樣液質量濃度過高時易堵塞樹脂，所以上樣質量濃度在7.57 mg/mL時為最佳上樣質量濃度，如圖3所示。

圖3 上樣質量濃度對平臥菊三七提取液有機酸吸附量的影響

4.2 乙醇體積分數對平臥菊三七提取液中有機酸解吸附的影響

取DM301樹脂3 g，置于50 mL錐形瓶，加入5 mL質量濃度為7.57 mg/mL總有機酸，加水定容到10 mL，放入水浴振蕩器中振搖2 h后，取出過濾，用蒸餾水沖洗樹脂直至流出液基本無顏色，再取30 mL體積分數為50%，70%，90%，95%的乙醇沖洗樹脂，放于水浴振蕩器中，振搖2 h，充分吸附后取出過濾，測量溶液解析率，結果如圖4所示。

結果顯示，乙醇體積分數在50%～90%時隨著乙醇體積分數的增加而增加，當乙醇體積分數為90%時解析率達到最高，當體積分數超過90%時，解析率隨著乙醇體積分數的增高而減少，所以當乙醇體積分數為90%時解析率最高。

圖4 乙醇體積分數對平臥菊三七提取液中有機酸解吸附的影響

4.3 乙醇體積對平臥菊三七提取液有機酸解吸附的影響

取DM301樹脂3 g，置于50 mL錐形瓶，加入5 mL濃度為7.57 mg/mL總有機酸，定容到10 mL，放入水浴振器中振搖2 h后，用蒸餾水沖洗樹脂直至流出液基本無顏色，再用2，4，6，8 BV的90%乙醇洗脫樹脂，放入水浴振蕩器中，振蕩2 h，等溶液充分吸收后，過濾得到濾液，測定解吸附量，比較解析率，結果如圖5所示。

圖5 乙醇體積對平臥菊三七有機酸解吸附的影響

結果表明，2 BV的90%乙醇洗脫就可以將總有機酸洗脫下來，同時考慮到節約試劑，故選擇2 BV的90%乙醇為洗脫溶劑。

4.4 總有機酸純化工藝驗證

取DM301樹脂3 g，置于50 mL錐形瓶，加入5 mL質量濃度為7.57 mg/mL總有機酸，定容到10 mL，放入水浴振器中振搖2 h后，用蒸餾水沖洗樹脂直至流出液基本無顏色，再用2 BV的90%乙醇洗脫樹脂，放入水浴振蕩器中，振蕩2 h，等溶液充分吸收后，過濾得到濾液，用“2.5”項下方法測定濾液中總有機酸的濃度，測得結果為每1 mL的平臥菊三七提取液中含有相當于15.054 3 mg的檸檬酸量，與初始提取液中總有機酸的含量（初始含量為每1 mL中含有相當于10.536 6 mg的檸檬酸量）相比，提高了42.88%。

5 討論

有機酸是平臥菊三七的主要化學成分，其具有顯著的抗氧化作用。因此，分離純化平臥菊三七總有機酸對研究其藥理作用具有重要的意義。

根據有機酸結構及性質的差異，常采用的分離純化方法有酸堿法、離子交換樹脂法、大孔樹脂吸附法、活性炭吸附法等［8-9］。大孔樹脂是一類不溶于酸、堿及各種有機溶劑的高聚物吸附劑，具有價格便宜、選擇性好、操作簡單、適用于范圍廣等優點，在很多領域都有廣泛的應用，但還未應用到平臥菊三七總有機酸的研究。因此，本實驗可為平臥菊三七中總有機酸成分的純化工藝提供理論依據。