牙鲆JNK2基因的表達分析及免疫功能探究*

司 瑜 王宣剛 王夢婭 王欣桐 于海洋 張全啟 王志剛

牙鲆基因的表達分析及免疫功能探究*

司 瑜 王宣剛 王夢婭 王欣桐 于海洋 張全啟 王志剛①

(中國海洋大學海洋生命學院 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室 青島 266003)

本研究利用實驗室已建牙鲆()轉錄組數據庫，得到牙鲆基因()并利用PCR技術進行序列驗證。的開放閱讀框長度為1263 bp，編碼420個氨基酸；通過SMART服務器對PoJNK2的結構域進行預測，顯示PoJNK2具有典型的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶催化結構域S_TKc。利用qRT-PCR分析在牙鲆成體不同組織中的表達水平，發現其在牙鲆免疫組織中均有表達，因此，初步推測在牙鲆免疫應答方面可能發揮作用。本研究設計了體內遲緩愛德華氏菌()侵染實驗和體外免疫刺激細胞實驗以探究在牙鲆免疫反應中的作用。在遲緩愛德華氏菌體內注射牙鲆成體后，在脾臟、頭腎和鰓中有不同程度的表達上調。同時，使用遲緩愛德華氏菌、Poly I:C和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)刺激牙鲆鰓細胞系后，發現在不同時間點表達上調。除此之外，通過細胞轉染實驗在牙鲆鰓細胞系中過表達，發現其對下游炎癥細胞因子的表達及激活蛋白Activator protein-1 (AP-1)的轉錄活性具有顯著的上調作用，進一步闡明了在調節牙鲆免疫應答方面的作用。

牙鲆；；遲緩愛德華氏菌；先天免疫

魚類是最古老的脊椎動物，在生物進化史中具有十分重要的地位。與哺乳類動物類似，魚類也具有完善的免疫器官、組織和多種免疫細胞，這些是魚類進行免疫預防各種疾病的免疫基礎(Litman, 2005)。先天免疫系統是最早以非特異性的方式保護宿主免受其他有機體感染的免疫機制，是無脊椎動物和低等脊椎動物免疫防御的基礎。發揮先天免疫作用的細胞以一種通用的方式識別病原體并做出免疫應答(Marchalonis, 1998)。

c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的重要亞基(Sluss, 1996)。最早發現并鑒定出的哺乳動物基因包括3種，它們分別被認定為、和(也分別稱為應激激活蛋白激酶SAPK-γ、SAPK-α和SAPK-β) (Dérijard, 1994)。和基因廣泛表達。相比之下，基因的表達模式相對有限，主要局限于大腦、心臟和睪丸(Gupta, 1996)。JNK蛋白激酶在TNF信號通路中由腫瘤壞死因子受體相關蛋白(TRAF2)激活，在IL-1激活后由TRAF6進一步激活(Lomaga, 1999)。之后，JNK又通過絲列原活化蛋白激酶激酶4 (MKK4)(也稱為SEK1)和MKK7在Thr和Tyr上的磷酸化而激活。MAPKK正是通過對Thr和Tyr上的T環發生磷酸化反應來激活JNK，絲氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸酶和雙重特異性磷酸酶在介導JNK發生去磷酸化失活時必不可少(Keyse, 2000)。JNK通路在先天免疫反應中具有進化保守性。在果蠅細胞中，JNK通路在脂多糖(LPS)作用下被激活(Sluss, 1996)。在哺乳動物中，LPS或腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)-1等炎性細胞因子可強烈誘導激活多種細胞類型的(Chang, 2001)。在成纖維細胞中，的缺乏導致多種細胞因子嚴重減少，包括Ⅰ型干擾素(IFN)和IL-6(Chu, 1999)。

硬骨魚是一種研究早期脊椎動物天然免疫應答功能的良好模型(Whyte, 2007)。牙鲆()是一種名貴的海產魚類，其肉質鮮美，營養豐富，經濟價值高，是重要的海水增養殖魚類之一，市場十分廣闊(李澤宇等, 2018)。了解牙鲆的先天防御機制，可以幫助我們控制魚類疾病，保持魚類養殖業的長期可持續性。遲緩愛德華氏菌()是一種常見的胞內致病菌，會引起宿主感染愛德華氏菌病并導致死亡(Abayneh, 2013)。遲緩愛德華氏菌通過侵染吸附在細胞表面，向宿主細胞內注入毒力因子從而使宿主感染病菌(Rao, 2001)。它會引起魚類的敗血癥，并伴有廣泛的皮膚損害，影響肝臟、腎臟、脾臟和肌肉等內臟。這種細菌能夠避免宿主的防御機制，從而在宿主體內迅速繁殖并導致死亡(Rao, 2001)。大部分魚類都會受到遲緩愛德華氏菌的影響，包括鯉魚、羅非魚、鯰魚和牙鲆()等(Castro, 2010; Ling, 2000)。本研究從牙鲆中克隆獲得了免疫相關基因，并對其進行了鑒定。采用體內和體外2種方法對基因的表達模式以及對下游炎癥細胞因子和轉錄因子AP-1的調節作用進行了探究。本研究可為魚類抗病育種的研究提供理論參考，同時揭示了的促炎作用，可為魚類疾病的治療和預防提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牙鲆 在本實驗中，所用牙鲆來自山東海陽黃海水產有限公司。隨機選取3條雄魚和3條雌魚 (1.5年齡，體長320~420 mm，體重500~700 g)，經尾靜脈抽血處死后進行解剖，每條魚取心臟、肝臟、脾臟、頭腎、腦、鰓、肌肉和腸8個組織，經液氮冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.1.2 牙鲆鰓細胞系(FG9307) 來自中國海洋大學細胞工程技術實驗室饋贈。該細胞用DMEM/F12培養基[向其中加入10% () FBS(胎牛血清)、1% () NEAA和100 U/ml青霉素)，24℃培養。

1.1.3 遲緩愛德華氏菌 實驗所用遲緩愛德華氏菌菌株為本實驗室保存菌株。待使用時將該菌株劃線接種于LB固體培養基中，28℃活化培養12 h。活化后，將單克隆菌落接種于LB液體培養基中，28℃搖晃培養12 h。用PBS緩沖液稀釋使其終濃度為107CFU/ml。

1.1.4 牙鲆遲緩愛德華氏菌攻毒實驗及免疫相關器官的RNA提取 來自本實驗室學生制作，具體實驗操作步驟詳見本實驗室已發表論文(曹丹丹等, 2018)，提取RNA后，使用反轉錄試劑盒反轉錄成濃度為100 ng/μl cDNA模板，保存于-80℃，待使用時稀釋至10 ng/μl。

1.2 方法

1.2.1基因序列分析 本研究分別通過分析比對氨基酸與核酸序列、脊椎動物基因所編碼氨基酸序列和系統進化對基因進行序列分析。DNAman程序用于分析氨基酸與核酸序列比對，MEGALIGN和DNAstar程序用于分析脊椎動物基因結構域保守性，ClustalW和MEGA 6程序用于分析系統進化。該分析過程中所用到的脊椎動物基因序列號詳見表1。

表1 實驗所用基因編號

Tab.1 JNK2 sequences used in this study

1.2.2 獲得基因的核心片段 在NCBI數據庫中搜索到斑馬魚和半滑舌鰨序列，并在實驗室已建立的牙鲆基因組和轉錄組數據庫中進行比對，得到基因的cDNA序列，根據比對結果設計擴增基因核心序列的特異性引物o-FW1/ RV1，詳見表2，利用PCR技術克隆驗證。

表2 實驗所用引物

Tab.2 The primers used in this study

注：下劃線分別為酶切位點序列

Note: Restriction enzyme sites are underlined

1.2.3基因的組織表達分析 根據定量引物設計原則，設計的qRT-PCR引物- qFw/qRv。選定牙鲆基因作為內參基因，通過qRT-PCR (SYBR qPCR SuperMix, Novoprotein, 上海)分析在牙鲆成魚的不同組織中基因的表達情況。qRT-PCR所用模板為材料1.1.1中cDNA模板。

1.2.4 遲緩愛德華氏菌、poly I:C、TNF-α刺激牙鲆鰓細胞系 將生長狀態良好的牙鲆鰓細胞系傳代接板至12孔板，生長至細胞覆蓋度達80%以上。向每孔中加入Polyinosinic: polycytidylic acid (Poly I:C, Sigma)、TNF-α(科昕生物公司)和遲緩愛德華氏菌，使終濃度分別為50 μg/ml、20 ng/ml和5×106CFU/ml。對照組分別加入相同濃度的PBS。

分別在刺激0、3、6、9和12 h時收集細胞樣品(遲緩愛德華氏菌刺激組，取刺激后0、3、9、12 h的細胞樣品)，存于Trizol中待用。

1.2.5過表達載體構建 為更深入地探究牙鲆的基因功能，構建了的2種不同表達載體，分別以p-EGFP-N1和p-cDNA3.1-A為載體，其中，以p-EGFP-N1為載體所構建的表達載體帶綠色熒光。在基因的ORF兩端，即ATG處和TAG處利用引物-Fw2/Rv2設計Ⅰ和HⅠ酶切位點。通過雙酶切得到的ORF克隆片段，連接到p-EGFP-N1質粒中，得到p-- EGFP重組質粒。使用同樣的方法，在基因的ORF兩端利用引物-Fw3/Rv3設計dⅢ和HⅠ酶切位點，與p-cDNA3.1質粒連接，得到p-cDNA3.1-重組質粒。

1.2.6基因在牙鲆鰓細胞系中的過表達 將生長狀態良好的牙鲆鰓細胞系接板到12孔板，培養至細胞單層均勻覆蓋密度達80%以上。使用LipofectamineTM2000 (US Everbright, Inc., 蘇州)進行p--EGFP質粒轉染，同時轉染p-EGFP-N1質粒作為對照；轉染p-cDNA3.1-質粒，對照組使用p-cDNA3.1-A質粒，具體步驟詳見說明書。轉染48 h以后，將p--EGFP組細胞用DAPI染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。p-cDNA3.1組細胞在轉染24 h后，使用20 ng/ml TNF-α進行刺激，24 h后提取細胞總RNA待用。

1.2.7 免疫調節檢測實驗 將轉染p-cDNA3.1質粒48 h后的牙鲆鰓細胞，用20 ng/ml的TNF-α進行刺激，對照組用PBS處理。在刺激24 h以后，收集細胞樣品，提取RNA，用qRT-PCR檢測下游IL-6、IL-8和TNF-α的表達變化情況。

1.2.8 雙熒光報告實驗 為了探究基因的表達變化對MAPK信號通路下游AP-1的轉錄調控作用，設計了雙熒光素酶報告實驗，檢測基因在HEK-293T細胞中過表達后對AP-1轉錄因子的表達影響。使用LipofectamineTM2000將p-cDNA3.1-質粒轉染至HEK-293T細胞中，同時轉染p-AP-1-luc熒光素酶報告質粒(碧云天生物公司)，設置陰性對照組和空載質粒組，陰性對照組即在HEK-293T細胞中只轉染p-AP-1-luc熒光素酶報告質粒，空載質粒組即轉染空載質粒p-cDNA3.1和p-AP-1-luc熒光素酶報告質粒。根據雙熒光素酶報告系統實驗要求，按照p-AP-1-luc熒光素酶報告質粒：海腎熒光素酶報告質粒(pRL-TK)=50∶1的比例，再在每個孔中共轉染pRL-TK，轉染24 h后進行雙熒光素酶活性檢測。

1.2.9 數據分析 本實驗所涉及數據差異性分析，均利用SPSS 20.0軟件，使用單因素方差(One-way ANOVA)檢驗進行比較。所有數據以平均值±標準誤(Mean±SE)(=3)表示，各個組之間的差異性用*表s示(*<0.05; **<0.01)。

2 結果

2.1 PoJNK2基因的序列分析

首先通過搜索本實驗室的牙鲆轉錄組庫，與NCBI數據庫中的序列進行比對，獲得了基因序列，ORF序列長1263 bp，編碼420個氨基酸。

為探究在脊椎動物中的進化關系，本研究利用MEGA 6構建了由不同脊椎動物的基因組成的系統進化樹(圖2)，牙鲆與大菱鲆()在親緣關系上最為接近。通過在線蛋白結構預測軟件SMART對基因的結構域進行預測，結果顯示，基因具有典型的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶催化結構域S_TKc。利用GENEDOC服務器對牙鲆的氨基酸序列與其他硬骨魚氨基酸序列進行比對分析(圖3)，結果顯示，的S_TKc結構域與其他硬骨魚的S_TKc結構域高度保守。

圖1 PoJNK2基因的核苷酸序列與氨基酸序列對應圖

圖2 JNK2的系統進化分析

圖3 PoJNK2與其他已知JNK蛋白的MUSCLE的多重序列比對

黑色區域表示每個氨基酸位點的同源性至少為70%。S_TKc結構域標注在上方的灰色條中

The black region indicates that the homology of each amino acid locus is at least the 70%. S_TKc domain is indicated as gray bars above the alignment

2.2 PoJNK2基因的組織表達分析

通過qRT-PCR分析牙鲆基因在不同組織中的表達模式(圖4)，在牙鲆心臟、肝臟、脾臟、頭腎、腦、鰓、肌肉、腸8個組織中均有表達。其中，在鰓中表達最高，在腦和腸中表達也較高。

2.3 遲緩愛德華氏菌刺激成年牙鲆后PoJNK2基因的差異表達分析

在遲緩愛德華氏菌侵染牙鲆成魚后，分別取了不同時間點的注菌組和對照組的脾臟、頭腎、鰓3個組織，探究在遲緩愛德華氏菌刺激下的表達模式，qRT-PCR結果顯示，在脾臟、頭腎、鰓3個組織中，遲緩愛德華氏菌的刺激引起了的不同程度的變化(圖5)。

分析的表達變化：在脾臟中(圖5A)，遲緩愛德華氏菌刺激后，的表達沒有太大的變化，直到刺激48 h時，實驗組的表達量上升至對照組的1.8倍。在頭腎中(圖5B)，隨著遲緩愛德華氏菌刺激作用的延長，的表達呈現出先升高后降低的趨勢，在12 h時實驗組表達量上升至對照組的 2.2倍，隨后開始下降，到48 h時降至對照組的1.3倍。在鰓中(圖5C)，的表達趨勢是先升高再降低又升高，在3 h時實驗組表達量是對照組的1.7倍，在 24 h時下降至0.6倍，而后又在48 h時上升至1.4倍。

圖4 PoJNK2基因在牙鲆各個組織中的表達模式

基因是定量分析的內參對照，誤差線代表平均值±標準誤(=3)

gene expression was used as internal control, vertical bars represent the Mean±SE (=3)

2.4 免疫刺激牙鲆鰓細胞系后PoJNK2基因的差異表達分析

為研究在抗病原菌感染方面發揮的重要作用，分別使用1.2.4中處理得到的cDNA模板，通過qRT-PCR分析的表達變化。結果如圖6所示，遲緩愛德華氏菌、poly I:C、TNF-α刺激均能使的表達上調。觀察在不同情況刺激下表達量的變化：在使用PBS刺激的對照組中 (圖6A)，的表達基本沒有變化。在Poly I:C刺激時(圖6B)，在刺激前12 h里表達量沒有明顯變化，到24 h時，表達量突然升高至0 h的2.2倍。在TNF-α刺激時(圖6C)，的表達是在12 h時開始增加，到24 h時，升高至0 h的2.6倍。遲緩愛德華氏菌刺激時(圖4D)，的表達逐漸升高，到24 h時表達量達到0 h的3.4倍。

2.5 PoJNK2的亞細胞定位

通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞轉染P-- EGFP重組質粒后的狀態，結果顯示(圖7)，與其他脊椎動物蛋白相似，PoJNK2在細胞質和細胞核中都有表達。

2.6 PoJNK2基因過表達對通路下游IL-6、IL-8和TNF-α等細胞因子的調節作用

本實驗深入研究了在抵抗病原菌侵害方面發揮的作用，通過qRT-PCR分析顯示，相比空白對照組和轉染空載質粒p-cDNA3.1組，過表達以后(圖8)，牙鲆鰓細胞內的的表達量明顯升高至空白對照組的6.4倍。

圖5 PoJNK2在遲緩愛德華菌刺激牙鲆組織中的表達模式

基因是定量分析的內參對照，時間點0 h表達量用作參照樣品。誤差線代表平均值±標準誤(=3)。實驗組與空白對照(0 h)之間的顯著差異由星號表示(*<0.05; **<0.01)。下同

gene was used as reference sample. The error line represents Mean±SE (=3). The significant difference between the experimental group and the blank control (0 hours) was indicated by the asterisk (*<0.05; **<0.01). The same as below

同時，還發現的過表達會使得通路下游的各個細胞因子均有不同程度的表達上調。過表達后，IL-6的表達量與p-cDNA3.1組和空白對照組相比分別升高了8.5和15.8倍；IL-8的表達量與p-cDNA3.1組和空白對照組相比分別升高了7.8和17.9倍；TNF-α的表達量與p-cDNA3.1組和空白對照組相比分別升高了24.7倍和35.9倍。

圖6 PoJNK2在免疫刺激牙鲆鰓細胞中的表達模式

A~D：的mRNA水平在不同刺激下的FG細胞的定量表達模式，包括PBS、Poly I:C、TNF-α和。

A~D:Quantitative expression patterns ofmRNA in FG cells stimulated by different stimuli, including PBS, Poly I: C, TNF- α and

圖7 PoJNK2蛋白的亞細胞定位

激光共聚焦掃描顯微鏡下，PoJNK2(綠色熒光)在細胞中的分布。核DNA用DAPI染色，為藍色熒光，pEGFP-N1用作陰性對照。Bar = 10 μm

Under laser confocal scanning microscope (LSCM), PoJNK2 in the whole cell, mainly in the cytoplasm. Nuclear DNA was stained with DAPI, blue fluorescence, pEGFP-N1 was used as negative control. Bar = 10 μm

圖8 PoJNK2過表達對TNF-α刺激的FG細胞中通路下游細胞因子的表達的影響

A: qRT-PCR顯示過表達后，mRNA表達量升高; B、C、D: 轉染24 h后，細胞用TNF-α刺激(20 ng/ml)刺激24 h，通過qRT-PCR分析IL-6和IL-8、TNF-α的表達水平

A: The expression of mRNA increased after overexpression ofby qRT-PCR. B, C, and D: The expression levels of IL-6, IL-8 and TNF- α were analyzed by qRT-PCR. The cells were stimulated with TNF- α (20 ng/ml) for 24 hours after transfection

2.7 PoJNK2基因過表達對下游AP-1的轉錄調控作用

為確定基因過表達后是否會對MAPK信號通路下游的轉錄因子AP-1有激活作用，設計雙熒光素酶報告實驗，結果如圖9所示，與空白對照組和轉染p-cDNA3.1組相比，的過表達顯著增強MAPK信號通路下游轉錄因子AP-1的轉錄活性。

圖9 PoJNK2過表達對AP-1報告基因活性的影響

轉染24 h后檢測熒光素酶活性。未轉染質粒和轉染p-cDNA3.1作為對照，顯著差異由星號表示(*<0.05; **<0.01)

The results showed that AP-1 luciferase reported the change of fluorescence intensity of plasmids. Luciferase activity was detected 24 hours after transfection. The difference between untransfected plasmid and transfected p-cDNA3.1 was indicated by asterisk (*<0.05; *<0.01)

3 討論

在以往研究中，從節肢動物到哺乳動物，JNK作為保守的應激激活蛋白激酶，可被多種免疫刺激物激活，并在宿主防御和免疫反應方面發揮重要作用(Delaney, 2006)。然而，對于硬骨魚類，特別是牙鲆JNK功能的了解還十分有限。本研究對牙鲆基因進行了序列鑒定和功能探究。

本研究發現，牙鲆JNK2具有典型的絲氨酸–蘇氨酸蛋白激酶催化結構域S_TKc，且通過氨基酸序列分析顯示，牙鲆JNK2的S_TKc結構域與其他硬骨魚的S_TKc結構域高度保守，說明牙鲆JNK2與大部分硬骨魚的JNK的同源性較高。

根據Zapata等(2006)研究發現，魚類的免疫器官主要包括腎臟、脾臟、胸腺和腸道相關淋巴組織。同時，也有報道證實魚類的鰓在抗病毒免疫方面發揮著重要作用(Li, 2014)。本研究發現，在腦、鰓和腸中表達較高，因此，推測在牙鲆對抗外來病原體的免疫防御中可能起著重要作用。為了探究這種免疫防御機制，使用遲緩愛德華氏菌侵染牙鲆的脾臟、頭腎和鰓，定量檢測的表達變化。結果發現，經遲緩愛德華氏菌刺激后，這3個組織中的的表達水平顯著增加，基本呈現先升高后降低或者先升高后降低又升高的趨勢。該結果進一步闡明了在牙鲆免疫防御中發揮的保護作用。然而，還需要進一步的研究來揭示這種免疫防御機制。

PolyI:C是一種病毒dsRNA類似物，在體內可以作為干擾素抑制劑(Liu, 2017)。TNF-α是一種由巨噬細胞衍生的具有抗腫瘤活性的細胞因子，與炎癥、免疫調節、抗病毒防御、內毒素休克和有絲分裂等多種生物學過程有關(Hattori, 1996)。PolyI:C和TNF-α經常在實驗中被用來模擬病毒對細胞進行刺激。Nishitoh等(1998)向293T細胞中轉染含HA標記的HAJNK后，再使用TNF-α刺激，用免疫復合物激酶法檢測JNK活性發現，TNF-α可誘導JNK活化，并推測TNF-α對JNK的激活可能是依賴于硫醇/二硫鍵的交換反應。本研究免疫刺激實驗結果表明，PolyI:C、TNF-α和遲緩愛德華氏菌均能使的表達上調，但上調幅度有所不同。這說明在面對不同的免疫刺激其產生的免疫應答效果是不同的，其原因可能是細胞對于特定的免疫刺激物和活細菌的反應機制不一樣。通過本研究結果可以確認細菌和病毒類似物均可刺激表達增加，說明在牙鲆抗菌抗病毒反應中可能發揮一定的作用。

炎癥細胞因子是一類控制炎癥細胞反應的免疫調節分子，主要包括IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18和TNF-α等。細胞因子可與特定的細胞因子抑制劑和可溶性細胞因子受體協同作用，調節人體的免疫應答(Giorgos, 2014)。已有研究證實，哺乳動物中一些胞內類型的細菌感染可強烈激活JNK通路，而且在免疫刺激下，JNK激活是產生多種炎癥細胞因子所必需的(Chu, 1999)。本研究證實了以上結論，過表達后能顯著上調IL-6、IL-8和TNF-α的表達。這些結果表明，在牙鲆體內發揮免疫作用的機制可能是通過調節細胞因子從而產生促炎反應。

據研究，MAPK信號通路能夠介導從細胞外到細胞質或細胞核的信號轉導，從而調節多種細胞過程(Yang, 2012)。與其他MAPK成員相似，JNK蛋白主要分布在胞漿中，沒有外部信號。在適當的環境刺激下，特異性上游MKK4或MKK7激酶通過雙重磷酸化激活JNK。然后，磷酸化的JNK轉移到細胞核，激活轉錄因子以改變靶基因的表達(Davis, 2000)。在Dunn等(2002)的研究中，證實JNK可以激活下游轉錄因子AP-1，然后調控著對病原體的反應起重要作用的各種炎癥細胞因子的產生。Qu等(2015)研究表明，JNK通路可以調節AP-1在軟體動物中對藻溶弧菌感染的反應。同樣，在本研究中，的過表達顯著激活了AP-1熒光素酶報告質粒的活性。這些發現表明，在牙鲆的感染過程中可能是通過激活轉錄因子AP-1改變靶基因的表達，進而參與免疫反應。

綜上所述，本研究首次在牙鲆中克隆驗證了基因，核酸、氨基酸序列比對及系統進化分析都顯示出基因與大多數硬骨魚具有較高的保守性。組織表達表明，主要在牙鲆的免疫組織中表達。體內注射遲緩愛德華氏菌和體外免疫刺激(包括PolyI:C、TNF-α和遲緩愛德華氏菌)均能夠增強的表達；作為胞內蛋白，在細胞內過表達會激活MAPK通路下游AP-1的轉錄，并顯著上調炎癥細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達。本研究為海水魚類抗病育種和疾病防治提供了理論參考。

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Expression Analysis and Functional Characterization ofin Japanese Flounder ()

SI Yu, WANG Xuangang, WANG Mengya, WANG Xintong, YU Haiyang, ZHANG Quanqi, WANG Zhigang①

(Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003)

The immune system of teleost, similar to mammals, is divided into two subsystems: Innate immune system and acquired immune system. Acting as the first line of defense against invading pathogens and pathogenicity factors, the innate immune system can be activated by the pattern recognition receptor (PRRs) which can recognize the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) and activate the downstream inflammatory response accordingly. MAPK(mitogen-activated protein kinase) signaling pathway is an important signal transduction system in eukaryote cells, which can mediate extracellular signaling into the cell and participate in various cellular processes such as cell proliferation, apoptosis, and immune response. JNK (c-Jun N-terminal kinase) signal pathway is an important branch of MAPK signal pathway.have been extensively studied in mammals, but not adequately in the teleost. In this research, we designed experiments to study the role ofgenes in the antimicrobial reaction of Japanese flounder and their effects on the downstream of the pathway in order to provide a theoretical basis for the study of JNK signaling pathway in fish.

In this study, thegene sequences of Japanese flounder were obtained from the transcription database of flounder and named after. TheORF region encodes is 1263 bp and encodes 420 amino acids. The domains ofgenes were predicted by SMART server. The results showed that thegene had a typical serine-threonine protein kinase domain S_TKc. The expression levels ofgenes in different tissues of flounder were analyzed by the qRT-PCR technique. It was found thatwere widely expressed in the immune tissue of Japanese flounder. Therefore, it was preliminarily speculated thatplayed a major role in the immune response of Japanese flounder. We designed an infection experiment ofand immune stimulatory cell experimentsto investigate the role ofin the immune response of Japanese flounder. The expression ofwas up-regulated in the spleen, kidney, and gill of Japanese flounder after injecting. At the same time, the gill cells of flounder (FG) were stimulated byPoly I:C and TNF-α. The expression ofwas up-regulated at different time points. In addition, we overexpressedin FG by cell transfection and it was found thathad significant regulatory effects on the regulation of downstream pro-inflammatory cytokines and transcription factor AP-1. The role ofin regulating the immune response of Japanese flounder was further clarified.

Japanese flounder;;;Innate immunity

WANG Zhigang, E-mail: zgwang@ouc.edu.cn

Q75

A

2095-9869(2020)04-0012-11

10.19663/j.issn2095-9869.20190327001

http://www.yykxjz.cn/

司瑜, 王宣剛, 王夢婭, 王欣桐, 于海洋, 張全啟, 王志剛. 牙鲆基因的表達分析及免疫功能探究. 漁業科學進展, 2020, 41(4): 12–22

Si Y, Wang XG, Wang MY, Wang XT, Yu HY, Zhang QQ, Wang ZG. Expression analysis and functional characterization ofin Japanese flounder (). Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 12–22

* 國家高技術研究發展計劃(863)項目(2012AA10A408)資助 [This work was supported by National High Technology Development Program of China (863) (2012AA10A408)]. 司 瑜，E-mail: sy03siyu@163.com

王志剛，實驗師，E-mail: zgwang@ouc.edu.cn

2019-03-27,

2019-04-25

(編輯 馮小花)