脊尾白蝦甘露糖結合凝集素(MBL)基因在抗鎘脅迫中的生物學功能分析*

徐莞媛 馬杭柯 孫金秋 段健誠鄧高威 高 煥,2,3,4 閻斌倫,2,3,4

脊尾白蝦甘露糖結合凝集素(MBL)基因在抗鎘脅迫中的生物學功能分析*

徐莞媛1馬杭柯1孫金秋1段健誠1鄧高威1高 煥1,2,3,4閻斌倫1,2,3,4①

(1. 江蘇省海洋生物資源與生態環境重點實驗室 江蘇省海洋生物技術重點實驗室 淮海工學院 連云港 222005； 2. 江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心 連云港 222005; 3. 江蘇省農業種質資源保護與利用平臺 南京 210014；4. 江蘇省海洋資源開發研究院(連云港) 連云港 222005)

為研究Cd2+脅迫下脊尾白蝦()甘露糖集合凝集素(MBL)在肝胰腺中表達量的變化特征，本研究利用重金屬鎘(Cd2+)對脊尾白蝦進行96 h急性毒性實驗。實驗共設置5組Cd2+濃度脅迫(0、0.01、0.0175、0.021和0.0278 mmol/L)，分別在Cd2+脅迫后0、3、6、12、24、48、72和96 h共8個時間點取樣。實時熒光定量結果顯示，高濃度Cd2+(0.0175、0.021和0.0278 mmol/L)脅迫下，脊尾白蝦MBL基因的表達量先呈上升趨勢，在72 h達到峰值后隨后下降，但各時間點表達量均與對照組存在顯著性差異(<0.01)；Cd2+濃度為0.01 mmol/L時，脊尾白蝦MBL基因的表達量整體呈下降趨勢。進一步采用RNA技術干擾該基因表達后，發現Cd2+脅迫后的脊尾白蝦個體死亡率顯著增加。本研究表明，脊尾白蝦MBL在應答Cd2+脅迫過程中可對機體起到一定的保護作用。

脊尾白蝦；MBL；鎘；RNA干擾技術；急性毒性實驗

近年來，隨著現代化工業的快速發展，大量工業廢水排放導致重金屬污染嚴重，威脅水產品的養殖與發展(黃福泉等, 2004; 王長友等, 2010; Vijayavel, 2009)，在眾多重金屬污染中，鎘是最嚴重也是毒性最強的重金屬之一，為應優先關注的污染物之一(Hamza-Chaffai, 1995;Moreira, 2010)。水中的重金屬主要通過鰓吸收、攝食、與水體的滲透交換作用等途徑富集到生物體內(勵建榮等, 2007; 趙紅霞等, 2003; Pourang, 2010)，進而對機體造成多方面的損傷。在生理水平上，鎘會造成機體產生過量的活性氧，會直接損傷抗氧化系統(Pytharopoulou, 2008; Doyotte, 1997)，也會對機體氨基酸和蛋白質如絲氨酸酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑等的含量造成一定的影響(廖潔等, 2018; 黃婷, 2016; Dawood, 2012)；在核基因組水平上，鎘會損傷水生生物的DNA和DNA修復系統，致使機體出現畸形、突變等(毛跟軍等, 2004)；在細胞水平上，鎘會通過影響蛋白質的結構及其生理功能，進而對甲殼類的肝胰腺等造成毒害作用(王蘭等, 2004)。甘露糖集合凝集素(MBL)是先天免疫系統重要的成員，除了結合病原微生物表面的糖結構，發揮溶菌的作用(Gupta, 2008; Pradhan, 2010; Summerfield, 2003)，還可以與絲氨酸蛋白酶結合激活補體途徑的MBL途徑，進而保護機體免受外界干擾(Walport, 2001; Presanis, 2003)。如上所述，Cd2+會造成機體絲氨酸蛋白酶的損傷，在生物機體受到Cd2+脅迫后，是否對MBL造成不同程度的影響？至今未見相關報道。

脊尾白蝦()是我國重要的經濟蝦類之一，以黃渤海產量最高(時冬晴等, 2007)，而脊尾白蝦養殖的近海海域受重金屬污染的問題日益突出(李先超, 2001)。在前期的研究中，我們已克隆獲得脊尾白蝦甘露糖集合凝集素基因(已另文發表，GenBank登錄號：MK105910)，本研究通過對該基因在應答Cd2+脅迫下的表達特征分析，闡釋該基因在重金屬脅迫中的生物學功能。

1 材料與方法

本實驗首先選取健康蝦和患病蝦，驗證MBL基因是否在患病蝦中具有大量表達的特征，研究MBL基因在機體防御中是否發揮作用；利用重金屬鎘脅迫，研究MBL基因在機體受到鎘離子脅迫后表達特征是否存在差異；利用RNA干擾技術，研究在機體在干擾后進一步受到鎘離子脅迫后，MBL基因是否會參與脊尾白蝦對鎘的抵御。

1.1 實驗材料

實驗所用健康成年脊尾白蝦為實驗室自繁而來，體長為(6.5±0.5) cm，體重為(2.5±0.5) g。實驗前將脊尾白蝦暫養在水溫25℃、鹽度25、pH為8.0的養殖缸內(50 cm×40 cm×30 cm)，24 h不間斷充氧，早晚投餌一次，投餌前對養殖缸進行清污。

1.2 實驗樣品的采集

1.2.1 脊尾白蝦不同組織取材 選取健康成年脊尾白蝦(取自本實驗室自繁養殖) 3尾，選取肌肉發白的患病脊尾白蝦(來源菜市場) 3尾，實驗前已對患病蝦進行了病原檢測，檢測到微孢子蟲的存在。分別選取其健康蝦和患病蝦的眼柄、胃、肝胰腺、心臟、鰓、腸、肌肉、卵巢共8個組織，用于RNA的提取。

1.2.2 鎘離子脅迫實驗取材 通過文獻得到Cd2+對脊尾白蝦96 h的半致死質量濃度為3.650 mg/L，Cd2+對脊尾白蝦的安全質量濃度為0.3650 mg/L(謝嘉等, 2017)。配制1 mol/L氯化鎘(南京化學試劑有限公司生產)母液，配制4組不同濃度梯度的溶液，濃度分別為0.01、0.0175、0.021和0.0278 mmol/L，并設立對照組。實驗過程在養殖箱(50 cm×40 cm×30 cm)內進行，每箱放50尾，整個養殖過程24 h不間斷充氣。

1.2.3 RNA干擾 挑選健康活躍的成年脊尾白蝦(對照組和實驗組均為50尾，每次取3尾脊尾白蝦)，注射siRNA對MBL進行基因沉默，用于siRNA干擾的引物共4條(干擾部位為本實驗室已獲得的脊尾白蝦MBL基因外顯子的350~371 bp) (表1)，具體操作方法按照TR-102-T7 RNAi Transcripition Kit (Vazyme,中國)的說明書進行。干擾組每克脊尾白蝦注射4 μg siRNA，注射部位心臟表皮處，對照組每克脊尾白蝦注射4 μg生理鹽水。注射siRNA和生理鹽水的脊尾白蝦24 h后(按照RNA干擾試劑盒說明書，注射24 h是干擾效率最高的時間點)，再進行鎘脅迫(Cd2+濃度為0.021 mmol/L)。在4種脅迫濃度下，低濃度(0.01和0.0175 mmol/L)脅迫下，毒性較小，MBL表達量較少；高濃度(0.0278 mmol/L)脅迫下，脊尾白蝦死亡太快，而只有0.021 mmol/L濃度下，脊尾白蝦死亡率適中，實驗可持續時間久，又可檢測到MBL較高的表達量，脅迫養殖方法參照1.2.2。

表1 脊尾白蝦siRNA干擾引物和熒光定量PCR引物的序列

Tab.1 Primer sequence of Exopalaemon carinicauda siRNA interference and Q-PCR

1.3 總RNA的提取

鎘脅迫實驗共設置8個取樣點，分別在處理后0、3、6、12、24、48、72和96 h取樣，RNAi干擾實驗共設置8個取樣點，分別為干擾后0、3、6、12、24、48、72和96 h取樣，每個濃度均取3尾脊尾白蝦，將脊尾白蝦的肝胰腺經液氮冷凍、研磨后用RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取RNA。

1.4 脊尾白蝦MBL基因組織特異性表達

根據本實驗室已獲得的脊尾白蝦MBL基因序列，設計熒光定量引物，分別命名為EC-MBL-Lectin- QR-F(正向擴增引物)和EC-MBL-Lectin-QR-R(反向擴增引物)(表1)，以18S rRNA為內參基因(薛蓓等, 2017)。實時熒光定量PCR反應使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(大連寶生物)，PCR反應體系為20 μl：2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10.0 μl，ddH2O 4.0 μl，cDNA 4.0 μl，EC-MBL-Lectin- QR-F1 0.8 μl，EC-MBL- Lectin-QR-R1 0.8 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl。

PCR反應程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s (熔解曲線程序)。

1.5 數據統計與分析

每天記錄各組實驗中脊尾白蝦的死亡個體數，計算累積死亡率，公式如下：

(%)=[Dt+2+……+Dt]/×100

為累積死亡率，為脊尾白蝦死亡個體數數，t為記錄天數，為每個實驗組中脊尾白蝦的總數目。

采用SPSS 18.0和Excel軟件對實驗數據進行統計分析，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行差異顯著性分析，在顯著性結果的基礎上應用Tukey法進行多重比較(<0.05為差異顯著，<0.01為極顯著差異)。

2 結果與分析

2.1 脊尾白蝦MBL基因的組織表達分析

利用熒光定量來研究MBL基因在脊尾白蝦不同組織中的表達特征，檢測結果如圖1所示。MBL基因在肝胰腺中表達量最高，且與其他組織存在顯著性差異(<0.05)；在其他組織(心臟、卵巢、胃、鰓、眼柄、腸和肌肉)中幾乎不表達。

肌肉發白的脊尾白蝦(購自菜市場)利用熒光定量對其MBL基因不同組織的表達特征進行分析，檢測結果如圖1所示，其中，在肝胰腺中表達量最高，且與其他組織存在顯著差異(<0.05)，其次是心臟。患病組和健康組比對發現(圖1)，MBL基因在患病蝦的肝胰腺和心臟中表達量較健康蝦顯著增加。

圖1 脊尾白蝦MBL在健康蝦和患病蝦的不同組織的表達特征分析

E: 眼柄; S: 胃; He: 肝胰腺; H: 心臟; G: 鰓; I: 腸; M: 肌肉; O: 卵巢

*表示與對照組差異顯著(<0.05)，**表示與對照組差異極顯著(<0.01)。下同

E: Eye stalk; S: Stomach; He: Liver and pancreas; H: Heart; G: Sputum; I: Intestine; M: Muscle; and O: Gonad

* indicates a significant difference from the control group (<0.05), and ** indicates a significant difference from the control group (<0.01). The same as below

2.2 鎘離子脅迫后不同濃度和不同時間點的脊尾白蝦MBL基因表達分析

總體而言，與對照組相比，各脅迫組中脊尾白蝦的MBL基因在肝胰腺中的相對表達量隨時間的延長而增加，但脊尾白蝦MBL基因在肝胰腺中的相對表達量在不同濃度鎘離子隨時間的變化出現明顯的差異(圖2)。鎘離子濃度為0.01 mmol/L時，脊尾白蝦MBL基因在肝胰腺中的相對表達量基本呈現下降的趨勢，但在6 h和24 h時有上升趨勢，與對照組差異顯著(<0.05)；鎘離子濃度分別為0.0175、0.021和0.0278 mmol/L時，在脅迫初期，脊尾白蝦MBL基因在肝胰腺中的相對表達量基本沒有變化，在12 h后呈上升趨勢，3種濃度均在脅迫72 h時達到高峰，并與對照組差異顯著(<0.01)，72 h之后開始下降。

2.3 RNA干擾后脊尾白蝦MBL基因的表達量分析

脊尾白蝦MBL基因的相對表達量在RNA干擾后的變化如圖3所示。重金屬鎘脅迫后，干擾組和對照組脊尾白蝦MBL基因在肝胰腺中的相對表達量均呈現上升趨勢，但干擾組和對照組相比，干擾組脊尾白蝦MBL基因在肝胰腺中的相對表達量均低于對照組。在6、12、24、48、72和96 h時，RNA干擾組和對照組的脊尾白蝦MBL基因在肝胰腺中的相對表達量出現顯著性差異(<0.01)。

圖2 不同鎘離子濃度脅迫下脊尾白蝦MBL表達量

脊尾白蝦累積死亡率在RNA干擾前后存在顯著差異，如圖4所示，鎘脅迫后的0、3、6 h 3個時間段，干擾組和對照組脊尾白蝦的累積死亡率基本相同，但在12、24、48、72和96 h后，干擾組的累積死亡率顯著高于對照組。

圖3 RNA干擾后脊尾白蝦MBL表達量隨時間的變化

圖4 RNA干擾后脊尾白蝦累積死亡率隨時間的變化

3 討論

早期研究發現，甲殼類動物凝集素在血細胞或肝胰腺中的表達量最高，因此，這些組織被認為是甲殼類動物防御系統中重要的器官(S?derh?ll, 1998; Gross, 2001)，本研究在脊尾白蝦MBL的組織特異性表達分析中發現，脊尾白蝦MBL在肝胰腺中表達最多，并與其他組織存在顯著性差異，因此，作者認為肝胰腺是脊尾白蝦MBL主要的效應組織。與肌肉發白的患病蝦進行比對時發現，患病蝦MBL在肝胰腺的表達量較健康蝦顯著增加，這可能說明MBL在肝胰腺發揮著相應的應激作用。研究表明，蝦蟹對重金屬鎘的積累具有明顯的組織特異性，主要富集在鰓、甲殼和肝胰腺(Silvestre, 2004、2005)，而肝胰腺又是脊尾白蝦MBL的主要效應組織。

為了探討MBL在重金屬鎘離子脅迫下的表達特征，本研究利用4種重金屬鎘離子濃度進行脅迫，發現較高濃度的鎘離子誘導MBL在肝胰腺中的表達量呈先上升后下降的趨勢，鎘離子濃度較低時，MBL的表達量整體呈下降趨勢。在先前的研究中發現，鎘離子脅迫后水生生物機體內抗氧化酶活力和丙二醛(許星鴻等, 214)、黃嘌呤氧化酶(劉偉成等, 2006)、熱休克蛋白(生安志等, 2016)出現先上升后下降的趨勢，這與本研究中MBL在脊尾白蝦受到鎘離子脅迫后出現的結果相一致。因此，脊尾白蝦MBL對鎘離子具有一定的應激作用，但Cd2+脅迫后脊尾白蝦MBL發揮作用存在著時間和劑量問題，高劑量的Cd2+會誘導脊尾白蝦MBL發揮應激作用。

為進一步驗證脊尾白蝦MBL基因是否與鎘離子脅迫有直接的關系，本研究進一步利用RNA干擾技術對脊尾白蝦MBL基因進行干擾研究。熒光定量結果顯示，干擾組脊尾白蝦MBL基因在肝胰腺中的相對表達量均低于對照組，說明干擾是成功的。在此基礎上，進一步對MBL表達受到干擾的脊尾白蝦進行鎘離子脅迫，結果發現，干擾組的死亡率也顯著高于對照組。由上述實驗結果推測，這可能由脊尾白蝦對鎘離子抵御能力降低導致。以往的研究已經證實，金屬硫蛋白(MT)具有重金屬解毒的作用，在缺失MT基因的酵母基因轉入MT基因，酵母便對重金屬銅產生了抗性(Thiele, 1986)，過量表達MT基因的轉基因小鼠和蒼蠅()提高了對重金屬鎘的耐受性(Liu, 1995; Tang, 2011)，因此，我們認為當脊尾白蝦受重金屬鎘離子脅迫后，脊尾白蝦MBL發揮了一定的抵御作用，但其應答機制尚需進一步研究。

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Biological Functional Analysis of MBL Gene in Resistance to Cadmium Stress in

XU Wanyuan1, MA Hangke1, SUN Jinqiu1, DUAN Jiancheng1, DENG Gaowei1, GAO Huan1,2,3,4, YAN Binlun1,2,3,4①

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment, Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005; 2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-Industry Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005; 3. Jiangsu Provincial Infrastructure for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014; 4. Marine Resource Development Institute of Jiangsu (Lianyungang), Lianyungang 222005)

In order to study the expression profile of mannose-binding lectin (MBL) in response to the stress of heavy metal cadmium (Cd2+) in the ridgetail white prawn,,changes of MBL expression level during 96 h of stress were analyzed in the tissue of hepatopancreas. Five Cd2+stress concentrations (0, 0.01, 0.0175, 0.021 and 0.0278 mmol/L) were set up in the experiment, and the samples were taken at 8 time points, i.e. 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 and 96 hours after Cd2+stress. The real-time fluorescence quantitative results showed that under the stress of high concentration of Cd2+(0.0175, 0.021 and 0.0278 mmol/L), the expression level of MBL gene in the ridgetail white prawn increased first, then decreased after reaching the peak at 72 h. There are significant differences between experimental group and control group at all the stress time points. When the cadmium ion was 0.01 mmol/L, a lower concentration, the expression level of MBL gene in the ridgetail white prawn tends to decrease from the beginning. Further interfering down the expression level of MBL using the RNA technology, it was discovered that the mortality rate of Cd2+stressed individuals were higher than those of the control group. This study showed that MBL potentially took part in the protection offrom Cd2+stress.

; MBL; Cadmium; RNA interference; Acute toxicity test

YAN Binlun, E-mail: yanbinlun1962@163.com

S917.4

A

2095-9869(2020)04-0174-07

10.19663/j.issn2095-9869.20190402002

http://www.yykxjz.cn/

徐莞媛, 馬杭柯, 孫金秋, 段健誠, 鄧高威, 高煥, 閻斌倫. 脊尾白蝦甘露糖結合凝集素(MBL)基因在抗鎘脅迫中的生物學功能分析. 漁業科學進展, 2020, 41(4): 174–180

Xu WY, Ma HK, Sun JQ, Duan JC, Deng GW, Gao H, Yan BL. Biological functional analysis of MBL gene in resistance to cadmium stress in. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 174–180

* 江蘇省高等學校自然科學研究重大項目(17KJA240001)、2017年淮海工學院研究生科研創新計劃項目(XKYCXX2017-11)和江蘇省優勢學科建設工程項目共同資助 [This work was supported by Major Natural Science Research Projects in Colleges and Universities of Jiangsu Province (17KJA240001), Graduate Research Innovation Project of Huaihai Institute of Technology (XKYCXX2017-11), and Construction Project of Superiority Discipline in Jiangsu Province]. 徐莞媛, E-mail: 742705425@qq.com

閻斌倫，教授，E-mail: yanbinlun1962@163.com

2019-04-02,

2019-04-30

(編輯 馮小花)